प्रोटीन बातचीत: SILAC immunoprecipitation प्रयोगों उपन्यास प्रोटीन की खोज के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. अनुमति से नियंत्रण और परीक्षण के नमूने, सच बातचीत दोनों में प्रोटीन बहुतायत की सटीक रिश्तेदार मात्रा का ठहराव आसानी से प्रयोगात्मक contaminants से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और कम संबंध में बातचीत कम कड़े बफर शर्तों के उपयोग के माध्यम से संरक्षित.
प्रोटीन बातचीत: इम्युनो संबंध शुद्धीकरण, SILAC immunoprecipitation, के साथ संयुक्त मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स उपन्यास प्रोटीन की खोज के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. नियंत्रण और परीक्षण के नमूने दोनों में प्रोटीन बहुतायत की सटीक रिश्तेदार मात्रा का ठहराव की अनुमति देकर, सच बातचीत आसानी से प्रयोगात्मक contaminants से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. निम्न संबंध में बातचीत कम कड़े बफर शर्तों के उपयोग के माध्यम से संरक्षित और आसानी से पहचाने रहना जा सकता है. इस प्रोटोकॉल एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए प्रस्तुत करने के लिए तैयारी द्वारा पीछा ब्याज की प्रोटीन, टैग किए गए एक समानता के स्थिर आइसोटोप लेबल अमीनो एसिड, अभिकर्मक और immunoprecipitation साथ टिशू कल्चर कोशिकाओं की लेबलिंग की चर्चा. इस प्रोटोकॉल फिर ब्याज की एक प्रोटीन के साथ बातचीत सेलुलर भागीदारों की पहचान करने के क्रम में मास स्पेक्ट्रोमीटर से दिए गए डेटा का विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए कैसे करें. एक उदाहरण के रूप में इस तकनीक पहचान करने के लिए लागू किया जाता हैeIF4AI और eIF4AII: यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारकों के लिए बाध्य प्रोटीन tify.
प्रोटीन समारोह को समझने में एक आवश्यक कदम प्रासंगिक बातचीत प्रोटीन की पहचान है. इस तरह के प्रोटीन अज्ञात हैं जहां उपलब्ध तकनीकों का एक नंबर, अपने गुण और कमियों के साथ प्रत्येक रहे हैं. ये खमीर दो संकर प्रणाली, पुनः संयोजक प्रोटीन का उपयोग पुलडाउन assays, साथ ही साथ मिलकर आत्मीयता शुद्धि या नल टैगिंग 1, 2 शामिल हैं.
इन तकनीकों के लिए एक अधिक के अलावा हाल ही (SILAC) 3 सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद प्रासंगिक स्तनधारी सेल लाइन से ब्याज की एक प्रोटीन के संबंध शुद्धीकरण का संयोजन है. यह है कि सेल स्थानीयकरण और बाद translational संशोधनों में खमीर दो संकर दृष्टिकोण से अधिक लाभ अधिक लाभ, साथ ही साथ परेशान नहीं कर रहे है पारंपरिक नल टैगिंग यह वजह उपयोगकर्ता की अनुमति एक मात्रात्मक बजाय गुणात्मक दृष्टिकोण है कि मेंdily विशेष रूप से बाध्य है कि मेजबान कारकों से, प्रोटीन और contaminants बातचीत गैर विशेष रूप से अलग करते हैं. एक नमूना आम तौर पर नहीं बल्कि व्यक्ति के रूप में प्रोटीन बैंड की तुलना में, पूरे विश्लेषण किया जाता है के रूप में आगे, ब्याज की प्रोटीन इसी तरह एक जेल पर प्रोटीन पलायन, और न ही वे आम तौर पर धुंधला के बाद दिखाई देने के लिए पर्याप्त स्तर पर मौजूद होने की जरूरत है, के लिए अग्रणी द्वारा नकाबपोश नहीं कर रहे हैं आत्मविश्वास से पहचान प्रोटीन 4 की बढ़ी संख्या.
इस तकनीक का प्रदर्शन, निकट से संबंधित यूकेरियोटिक अनुवाद दीक्षा कारक के GFP fusions eIF4AI और eIF4AII 90% अमीनो एसिड पहचान पर कि शेयर SILAC-immunoprecipitation मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स द्वारा जांच की गई. मानव eIF4AI और द्वितीय GFP eIF4A के एन टर्मिनस से जुड़े हुए है, जहां एक संलयन प्रोटीन के लिए फार्म pEGFP-C1 में क्लोन किया गया. क्षणिक अभिकर्मक स्थिर आइसोटोप लेबल 293T कोशिकाओं को इन निर्माणों देने के लिए इस्तेमाल किया गया था स्थिर सेल लाइनों पैदा करने के लिए जरूरत से बचने के लिए.
<p class="Jove_content"> कोशिकाओं पहले ब्याज की एक प्रोटीन एन्कोडिंग प्लास्मिड डीएनए के अभिकर्मक द्वारा पीछा SILAC सेल संस्कृति मीडिया में दो सप्ताह के लिए चिह्नित किया गया. कोशिकाओं को फिर lysed प्रोटीन एकाग्रता सामान्यीकृत, और lysate आत्मीयता के बराबर राशि का विरोधी GFP agarose पर शुद्ध थे. Eluate के बराबर राशि का तो संयुक्त और LC-MS/MS विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया गया. इस विश्लेषण का परिणाम तो उच्च आत्मविश्वास प्रोटीन की पहचान करने के लिए कार्रवाई कर रहे हैं: प्रोटीन बातचीत (चित्रा 1).SILAC immunoprecipitation प्रत्यक्ष बातचीत की लेकिन यह भी कम आकर्षण या प्रोटीन परिसरों 4 के साथ अप्रत्यक्ष बातचीत न केवल की पहचान में सक्षम बनाता है. इस प्रणाली का प्रयोग, eIF4AI और द्वितीय immunoprecipitations प्राथमिक बाध्यकारी साथी eIF4G (isoforms मैं / द्वितीय और तृतीय) 5 की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और विश्वास पहचान है, साथ ही eIF4E साथ अप्रत्यक्ष बातचीत, और eIF3 परिसर के कई घटकों की अनुमति दी.
यहाँ वर्णित SILAC pulldown रणनीति उपन्यास प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक बहुत ही संवेदनशील और शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करता है: प्रोटीन बातचीत है, और इसके अलावा ब्याज की बारीकी से संबंधित नमूनों के बीच बदल बाध्यकारी पैटर्न के तेजी से और सरल भेदभाव की अनुमति देता है. EIF4AI और eIF4AII प्रोटीन 6 के प्रोटीन बातचीत: इस उदाहरण में इस तकनीक प्रोटीन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. लेखक का ज्ञान करने के लिए, इस eIF4A के इन दो isoforms की सेलुलर interactome जांच करने के लिए SILAC प्रोटिओमिक्स की उपयोगिता का शोषण साहित्य में पहला अध्ययन है.
जैसा कि ऊपर वर्णित दृष्टिकोण एक GFP टैग और विरोधी GFP मोती 9, 10 और इसलिए संशोधनों टैग एन या कम रखा गया है कि क्या उदाहरण के लिए ब्याज की एक विशिष्ट प्रोटीन, के लिए प्रयोग की जाने वाली इस दृष्टिकोण सक्षम करने के लिए आवश्यक हो सकता है का उपयोग करता है एक प्रोटीन की सी टर्मिनस. जहां संभव हो, पश्चिमी blots या कार्यात्मक assays चाहिएएक ज्ञात प्रोटीन बातचीत साथी के बंधन का पता लगाने के लिए किया जा. एक प्रोटीन एक GFP टैग, अन्य टैगिंग या pulldown रणनीतियों के साथ फ्यूजन बर्दाश्त नहीं करना चाहिए अन्य टैग का उपयोग कर दोनों SILAC pulldowns के लिए लागू किया गया है (फ्लैग 11, बायोटिन 12, strep (स्वयं के डेटा, अप्रकाशित)), या एक प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके ब्याज का लक्ष्य प्रोटीन की siRNA पछाड़ना एक नियंत्रण नमूना 13 प्रदान करता है. इस तरह के प्रयोगों साहित्य में कहीं वर्णित किया गया है, लेकिन संक्षेप में, चरण 1 और कदम 5.4-8 में वर्णित के रूप में बराबर प्रोटीन जानकारी का उपयोग कर चुनाव की अभिव्यक्ति / pulldown सिस्टम के लिए उपयुक्त के रूप में संशोधित कदम 2-5.3 साथ, ऊपर के रूप में लागू किया जाएगा 2.4-2.5 कदम. मात्रा का ठहराव चरणों गैर विशिष्ट बंधनकारी प्रोटीन विश्लेषण स्तर पर हटाया जा करने की अनुमति के रूप में, यह कम आत्मीयता प्रोटीन की रक्षा करने के क्रम में नियंत्रण मोती, या उच्च नमक washes के साथ पूर्व ऊष्मायन चूकना की सिफारिश की है: ब्याज की एक प्रोटीन के साथ प्रोटीन बातचीत . एक nuclease माY शामिल है या एक विशेष रूप से प्रयोग की बारीकियों के अनुसार इस प्रोटोकॉल से लोप हो. उदाहरण के लिए: इस विधि में इस्तेमाल किया प्रोटीन शाही सेना helicases हैं, RNase कॉकटेल शाही सेना (3.2 कदम) के माध्यम से मध्यस्थता अप्रत्यक्ष बातचीत को दूर करने के लिए प्रोटोकॉल में शामिल किया गया था. कुछ मामलों में हालांकि, न्यूक्लिक एसिड निर्भर बातचीत की पहचान करने के लिए nuclease साथ और बिना समानांतर प्रयोगों चलने से वहाँ लाभ हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल के भीतर, 'मध्यम' और दोहराने के प्रयोगों में 'भारी' नमूने की स्विचिंग SILAC मीडिया या सेल के विकास में अंतर से शुरू की भिन्नता के लिए नियंत्रित करने के लिए सिफारिश की है. एक वैकल्पिक नियंत्रण प्रतिकृति प्रयोगों में सभी तीन ('प्रकाश', 'मध्यम', और 'भारी') मीडिया की अनुक्रमिक स्विचिंग शामिल है. इस दृष्टिकोण संभवतः और अधिक कठोर है जबकि, यह कम से कम एक दोहराने, ब्याज की एक प्रोटीन w में के रूप में, विश्लेषण की जटिलता में वृद्धि करता हैबीमार 'प्रकाश' लेबल की कोशिकाओं में उत्पादित किया और इसलिए यह लगातार 'प्रकाश' नमूने (जैसे keratins के रूप में पर्यावरण contaminants), और एक प्रोटीन के लिए बाध्य है जब केवल 'प्रकाश' नमूने में समृद्ध कर रहे हैं कि उन में पहचान प्रोटीन के बीच भेद करने के लिए आवश्यक है ब्याज.
मात्रा का ठहराव डेटा का उपयोग की अनुमति देता Whilst एक सीमा के उपयोग के माध्यम से विशिष्ट से गैर विशिष्ट बातचीत की भेदभाव, अनिवार्य रूप से कुछ वास्तविक बातचीत से खारिज किया जा सकता है. ऊपर दृष्टिकोण प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण है: आसानी से नहीं पिछले मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ अनुभव, या बड़े प्रोटीन के विश्लेषण के साथ शोधकर्ताओं द्वारा प्रयास किया जा सकता है कि प्रोटीन बातचीत: प्रोटीन बातचीत डेटासेट. सबसे उपयोगों के लिए इस ब्याज का उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के लिए पर्याप्त से अधिक है. इस डेटा नुकसान को कम करने में मदद करने के लिए इस दृष्टिकोण को आगे संशोधन कहीं और साहित्य में वर्णित है और एक पीआर के उपयोग में शामिल कर रहे हैंप्रयोगात्मक मानकों (सेल लाइन, मनका मैट्रिक्स, बफर शर्तें) की एक विशेष सेट के लिए संदूषक प्रोटीन में जाना जाता है, जहां otein आवृत्ति पुस्तकालय 10, 14 को बाहर रखा जा सकता है. हालांकि, विशेष प्रयोगात्मक मापदंडों के आधार पर यह एक मनका proteome उत्पन्न करने के लिए नियंत्रण प्रयोगों की एक संख्या को चलाने के लिए आवश्यक हो सकता है और यह इसलिए प्रयोग के खर्च और जटिलता दोनों को बढ़ा सकते हैं. इस तकनीक पर अधिक जानकारी www.peptracker.co.uk वेबसाइट 14 से उपलब्ध है.
यह भी प्रोटोकॉल (- मानचित्र SILAC प्रयोग शुद्धि के बाद एक मिश्रण कहा जाता है) immunoprecipitation प्रक्रिया के अंत में अलग लेबल के नमूने शामिल मिश्रण से ऊपर वर्णित है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इस प्रोटीन के रूप में किया जाता है: प्रोटीन बातचीत एक दिया संतुलन 15 पर होते हैं. यह अन्य समूहों के नमूनों की ऊष्मायन के साथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित इस नक्शे SILAC दृष्टिकोण संयुक्त है कि ध्यान दिया जाना चाहिएपूर्व pulldown (मिश्रण के बाद शुद्धि – PAM SILAC) को समय के विभिन्न लंबाई के लिए 15, 16 (2 घंटे 20 मिनट साहित्य में इस्तेमाल किया गया है). एक प्रोटीन अनुपात 1:1 की ओर चला जाता है कैसे तेजी के आधार पर यह गुणात्मक बंधन समानताएं जांच करने के लिए और स्थिर या गतिशील बातचीत प्रोटीन के रूप में 15 प्रोटीन को परिभाषित करने के लिए संभव है.
संक्षेप में, SILAC pulldowns एक physiologically प्रासंगिक सेटिंग में, ब्याज की दी प्रोटीन के साथ बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं. तकनीक बहुत आसानी से ब्याज की किसी भी प्रोटीन के लिए अपने आवेदन की अनुमति, अलग शुद्धि रणनीतियों के एक नंबर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. परिणामों की मात्रा बेहद वास्तविक बातचीत की पहचान सरल और गैर विशिष्ट बाँधने को दूर किया कड़े बफर शर्तों में छूट परमिट, और इस प्रकार कम संबंध में बातचीत को बरकरार रखता है. तीन नमूने ऊपर में तुलना की जा सकती हैंरणनीति, तकनीक अलग प्रोटीन isoforms, उत्परिवर्ती प्रोटीन, या औषधीय inhibitors के प्रभाव के बीच बाध्यकारी प्रोटीन में मतभेद की तुलना में स्पष्ट ताकत है. पूरे जेल स्लाइस बल्कि उस Coomassie से दाग व्यक्ति बैंड से विश्लेषण कर रहे हैं के रूप में, उच्च आत्मविश्वास में पहचान प्रोटीन की संख्या आमतौर पर एक मानक जीएसटी / नल pulldown में पहचान की तुलना में अधिक है, और ब्याज की प्रोटीन निकाल दिया जाता है के चयन में पक्षपात प्रयोगकर्ता. तकनीक इसलिए उपन्यास प्रोटीन बातचीत (खमीर 2 संकर, जीएसटी / उसकी या नल pulldowns) के इस्तेमाल में पहचान अन्य आमतौर पर इस्तेमाल की तकनीक के साथ बहुत कृपापूर्वक तुलना करती है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के पुलिस महानिरीक्षक को वेलकम ट्रस्ट और बीबीएसआरसी से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. आईजी वेलकम वरिष्ठ फैलो हैं.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |