단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.
단백질 상호 작용 : 면역 친화 정제, SILAC의 면역과 결합 정량 프로테오믹스는 새로운 단백질의 발견을위한 강력한 수단을 나타냅니다. 제어 및 시료 모두에서 단백질 풍요의 정확한 상대 정량을 허용함으로써, 진정한 상호 작용은 쉽게 실험 오염 물질을 구별 할 수있다. 저 친화력 상호 작용은 덜 엄격한 조건 버퍼의 사용을 통해 유지하고 쉽게 식별 유지 될 수있다. 이 프로토콜은 질량 분석 시설에 제출을위한 준비를 한 다음 그 단백질을 태그 친 화성의 안정 동위 원소 표지 된 아미노산, 형질 전환 및 면역과 조직 배양 세포의 라벨에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 단백질과 상호 작용하는 세포의 파트너를 식별하기 위해 질량 분석기에서 리턴 데이터를 분석하고 해석하는 방법을 논의한다. 예로서이 기술의 iDEN인가eIF4AI 및 eIF4AII : 진핵 세포 번역 개시 인자에 결합하는 단백질을 tify.
단백질 기능을 이해하는 데 필수적인 단계는 관련 상호 작용하는 단백질의 식별입니다. 단백질이 알 수없는 장소에서 사용 가능한 다양한 기술, 자신의 장점과 단점 각각이 있습니다. 이들은 효모 두 하이브리드 시스템, 재조합 단백질을 사용하여 풀다운 분석뿐만 아니라 탠덤 선호도 정화 또는 TAP-태그 1, 2 (가) 있습니다.
이러한 기술에 대한보다 최근의 첨가 (SILAC) 3 세포 배양에서 아미노산의 안정 동위 원소 표지를 사용하여 정량적 질량 분석 하였다 관련된 포유 동물 세포주에서 그 단백질의 친화도 정제의 조합이다. 이는 해당 셀의 현지화 및 번역 후 변형의 효모 두 하이브리드 접근 방식을 통해 장점을 통해 장점뿐만 아니라, 교란되지 않은이 기존의 TAP-태그가 정말이에요에 사용자를 허용하는 양적보다는 질적 접근 방식 인 것을디일 특이 적으로 결합 호스트 요인, 단백질과 오염 물질을 상호 작용이 아닌 구체적으로 구분합니다. 샘플은 일반적으로 오히려 개별 단백질 밴드보다, 전체 분석으로 또한, 그 단백질은 마찬가지로 겔에서 단백질을 마이그레이션 없으며 일반적으로 염색 한 후 볼 수 있도록 충분한 수준에 존재해야합니까, 선도에 의해 마스크되지 않습니다 자신있게 확인 된 단백질 4의 증가 숫자.
이 기술을 설명하기 위해 밀접하게 관련 진핵 번역 개시 인자의 GFP 융합은 eIF4AI 및 eIF4AII 90 %의 동일한 아미노산 서열을 통해 그 점유율은 SILAC – 면역 정량 프로테오믹스에 의해 조사 하였다. 인간 eIF4AI 및 II는 GFP가 eIF4A의 N-말단에 융합되는 융합 단백질을 형성하는 pEGFP-C1에 클로닝 하였다. 일시적 형질 감염은 안정적인 동위 원소 표지 된 293T 세포에 이러한 구조물을 제공하는 데 사용 된 안정한 세포주를 생성하기위한 필요성을 방지한다.
<p class="jove_content는"> 셀은 제 관심 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA의 형질이어서 SILAC 세포 배양 배지에서 2 주 표지 하였다. 세포는 그 후, 용해 단백질 농도는 정규화 및 용해질 친 화성 동등한 양 안티 GFP 아가상에서 정제 하였다. 용출액을 동량이어서 합하고 LC-MS/MS 분석을 위해 제출되었다. 이 분석의 결과는 다음 높은 신뢰성 단백질을 식별하기 위해 처리된다 : 단백질 상호 작용 (도 1).SILAC의 면역 직접 상호 작용뿐만 아니라 선호도가 낮은 또는 단백질 복합체 4 간접적 인 상호 작용뿐만 아니라 식별 할 수 있습니다. 이 시스템을 사용하여, eIF4AI 및 II immunoprecipitations는 기본 바인딩 파트너 eIF4G (이소 I / II 및 III) 5의 재현과 신분을 확인뿐만 아니라 eIF4E에 간접 상호 작용, 그리고 eIF3 단지의 다양한 구성 요소를 허용했다.
여기에 설명 된 SILAC 풀다운 전략은 새로운 단백질을 검출하는 매우 민감하고 강력한 수단을 나타냅니다 단백질 상호 작용을하고, 또한 그 밀접하게 관련 샘플 사이의 변경된 바인딩 패턴의 신속하고 간단하게 차별 할 수 있습니다. eIF4AI eIF4AII 단백질 및 (6)의 단백질 상호 작용이 예에서이 기술은 단백질을 조사 하였다. 저자의 지식에,이 eIF4A의 두 가지 아형의 세포 interactome을 조사하기 위해 SILAC의 프로테오믹스의 유틸리티를 악용 문학의 첫 번째 연구이다.
전술 한 바와 같이 방법은 GFP-태그와 항-GFP 비즈 09 10 따라서 변형이 태그가 N-또는 배치되어 있는지 여부를, 예를 들어 관심있는 특정 단백질에 사용되는이 방법을 사용하기 위해 필요할 수있다을 사용 단백질의 C-말단. 가능하다면, 서부 말 또는 기능 분석해야공지 된 단백질의 상호 작용 파트너의 결합을 검출하기 위해 수행 될 수있다. 단백질 GFP 태그, 다른 태그 또는 풀다운 전략과 융합을 용납하지 않겠 다른 태그를 모두 사용하여 SILAC의 풀다운에 적용된 (FLAG 11, 비오틴 12 STREP (자신의 데이터, 게시되지 않은)), 또는 단백질에 대한 일차 항체를 사용하여 관심 대상의 단백질의 siRNA 녹다운는 대조 샘플 (13)을 제공하는 경우. 이러한 실험은 문헌에 밖에 기재되어있다, 그러나 간략히, 단계 1 및 단계는 5.4-8에 설명 동등한 단백질 입력을 사용하여 선택 식 / 풀다운 체제에 따라 변경됨 단계 2-5.3로 상기와 같이 적용 할 것인지 2.4-2.5 단계를 반복합니다. 정량화 단계는 비 특이 적 결합 단백질 분석 수준에서 제거 할 수 있도록, 그것은 낮은 친화력 단백질을 유지하기 위해 제어 구슬, 또는 염분 세척 사전 배양을 생략하는 것이 좋습니다 : 관심의 단백질과 단백질 상호 작용 . 클레아 제 엄마y를 포함하거나 특정 실험의 특성에 따라이 프로토콜에서 생략 될 수있다. 예를 들어이 방법에 사용되는 단백질이 RNA 헬리 한, RNA 분해 효소 칵테일은 RNA (단계 3.2)를 통해 매개되는 간접적 인 상호 작용을 제거하는 프로토콜에 포함되었다. 어떤 경우에는 그러나, 핵산 따라 상호 작용을 확인하는 핵산 분해 효소와 사용하지 병렬 실험을 실행이 혜택을 누릴 수 있습니다.
이 프로토콜 내에서 '매체'와 복제 실험에서 '무거운'샘플의 전환은 SILAC 미디어 또는 세포의 성장의 차이에 의해 도입 된 변화를 제어하는 것이 좋습니다. 다른 컨트롤은 복제 실험에서 세 가지 ( '빛', '중간', 그리고 '무거운') 미디어의 순차적 전환을 포함한다. 이 접근법은 잠재적으로 더 엄격한 반면, 적어도 하나의 복제에 관심 단백질 w 같이 분석의 복잡성을 증가 않는다병이 '라이트'라는 세포에서 생성 될 수 그리고 그것은 지속적으로 '빛'샘플 (예 : 각질 등의 환경 오염 물질), 그리고 단백질에 결합하는 경우에만 '빛'샘플에서 농축 된 것을 식별 단백질을 구별 할 필요가있다 관심.
정량 데이터의 사용을 허용하는 동안 임계 값의 사용을 통해 특정 -에서 비특이적 상호 작용의 차별은 불가피 진짜 상호 작용은 삭제 될 수 있습니다. 위의 방법은 단백질을 식별하는 간단하고 빠른 방법입니다 : 쉽게 더 이전의 질량 분석에 대한 경험, 또는 큰 단백질의 분석과 연구자에 의해 시도 될 수있는 단백질 상호 작용 : 단백질 상호 작용 데이터 세트. 대부분의 용도를 위해이 관심의 새로운 단백질을 식별하기위한 충분한 이상입니다. 이러한 데이터 손실을 줄일 수있는이 방법의 변형은 또 다른 곳 문헌에 기술 및 PR의 사용을 포함한다실험적인 매개 변수 (세포주, 비드 매트릭스, 버퍼 조건)의 특정한 세트에 대해 오염 단백질을 공지 otein 주파수 라이브러리 (10), (14)를 제외 할 수있다. 그러나, 특정 실험 매개 변수에 따라서는 비드 프로테옴을 생성하도록 제어 실험의 수를 실행할 필요가있을 수 있고 따라서 이것은 실험의 비용과 복잡성을 증가시킬 수있다. 이 기술에 대한 자세한 정보는 www.peptracker.co.uk 웹 사이트 14에서 사용할 수 있습니다.
또한 프로토콜 (- MAP의 SILAC 실험을 정제 한 후 믹싱 지칭) 면역 과정의 끝에서 서로 다르게 표지 된 샘플을 혼합 수반 상술 주목해야한다. 이것은 단백질로 이루어집니다 : 단백질 상호 작용은 주어진 평형 (15)에서 발생합니다. 그것은 다른 그룹은 샘플의 배양에이 프로토콜에 설명이 MAP의 SILAC 접근 방식을 결합했다 주목해야한다이전 풀다운 (혼합 한 후 정제 – PAM SILAC)에 시간의 길이가 다른 15, 16 (2 시간 20 분은 문헌에 사용되었다). 단백질 비율을 1:1으로 인하 얼마나 빨리 기반으로, 품질 적 결합 친화도를 조사 및 안정 또는 동적 상호 작용 단백질 15로 단백질을 정의하는 것이 가능하다.
요약하면, SILAC의 풀다운은 생리학 관련 설정에서, 관심의 특정 단백질과 상호 작용하는 단백질을 식별하는 매우 강력한 방법을 나타냅니다. 기술은 매우 쉽게 또한 임의의 주어진 단백질에의 응용을 허용하는 다른 정제 전략의 수에 적응 될 수있다. 결과의 정량화가 크게 진정한 상호 작용의 식별을 단순화하고, 비 특정 바인더를 제거하는 데 엄격한 버퍼 조건의 완화를 허용, 따라서 선호도가 낮은 상호 작용을 유지합니다. 최대 3 개의 시료는 상기에서 비교 될 수있는 바와 같이전략 기술은 다른 단백질 이소 형, 돌연변이 단백질, 또는 약물 억제제의 효과 사이에 결합 단백질의 차이를 비교하는 명확한 장점을 가지고 있습니다. 전체 젤 조각이 아니라 그 쿠마에 의해 얼룩 개별 밴드보다 분석으로, 높은 신뢰성에 확인 된 단백질의 수는 일반적으로 표준 GST / TAP-풀다운에서 확인 된 것보다 더 높은, 그리고 관심의 단백질을 제거한다 선택에 편견을 실험. 이 기술은 따라서 새로운 단백질 상호 작용 (효모 2 – 하이브리드, GST / 그의 또는 TAP 풀다운)의 식별에 사용되는 다른 일반적으로 사용되는 기술로 매우 호의적으로 비교합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 IG의 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)와 BBSRC에서 교부금에 의해 지원되었다. IG는 웰컴 선임 연구원입니다.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |