Experimentos de imunoprecipitação SILAC representar um poderoso meio para descobrir nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteína em ambas as amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais, e interacções de baixa afinidade preservado através da utilização de condições de tampão menos rigorosas.
Proteômica quantitativos combinados com purificação de imunoafinidade, SILAC imunoprecipitação, representam um poderoso meio para a descoberta de nova proteína: interações protéicas. Ao permitir que a quantificação relativa exacta da abundância de proteínas tanto em amostras de controlo e de ensaio, os verdadeiros interacções podem ser facilmente distinguidos dos contaminantes experimentais. Interacções de baixa afinidade podem ser preservadas por meio da utilização de condições de tampão menos rigorosas e ficar prontamente identificável. Este protocolo descreve a marcação de células de cultura de tecidos com isótopos estáveis aminoácidos marcados, transfecção e imunoprecipitação de uma afinidade marcado proteína de interesse, seguido pela preparação para a apresentação de uma instalação de espectrometria de massa. Este protocolo, em seguida, discute como analisar e interpretar os dados retornados do espectrômetro de massa, a fim de identificar parceiros celulares que interagem com uma proteína de interesse. Como um exemplo desta técnica é aplicada a identificar proteínas de ligação aos fatores de iniciação eucarióticos tradução: eIF4AI e eIF4AII.
Um passo essencial para a compreensão da função das proteínas é a identificação de proteínas que interagem relevantes. Quando essas proteínas são desconhecidos, há uma série de técnicas disponíveis, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens. Estes incluem o sistema de leveduras duplamente híbrido, utilizando ensaios de pulldown proteína recombinante, bem como a purificação por afinidade em tandem ou TAP-marcação 1, 2.
Uma adição mais recente destas técnicas é a combinação de purificação por afinidade de uma proteína de interesse a partir de uma linha celular de mamífero relevante, seguido por espectrometria de massa de análise quantitativa utilizando rotulagem isótopo estável de aminoácidos em cultura de células (SILAC) 3. Isto tem vantagens sobre a levedura abordagem de dois híbridos em que a localização celular e modificações pós-tradução não são perturbados, assim como as vantagens sobre os tradicionais, em que é uma abordagem quantitativa do que qualitativa permitindo ao utilizador a rea-marcação TAPdily distinguir não especificamente proteínas que interagem e contaminantes, de factores do hospedeiro que se ligam especificamente. Além disso, como a amostra é tipicamente analisados inteiro, em vez de bandas de proteínas individuais como, proteínas de interesse não são mascarados por semelhante a migração de proteínas em gel, nem eles tipicamente têm de estar presentes em níveis suficientes para ser visível após a coloração, levando a aumento do número de proteínas de confiança identificados 4.
Para demonstrar esta técnica, fusões GFP do fator de iniciação da tradução eucariótica intimamente relacionado eIF4AI e eIF4AII que partes sobre identidade de aminoácidos de 90% foram investigados por SILAC-imunoprecipitação proteômica quantitativa. EIF4AI humano e II foram clonados em pEGFP-C1 para formar uma proteína de fusão onde a GFP é fundido com o terminal N de elF4A. Para evitar a necessidade de se gerar linhagens de células estáveis a transfecção transiente foi usado para entregar estas construções para células 293T de isótopos estáveis rotulados.
<p class="Jove_content"> As células foram marcadas em primeiro lugar durante duas semanas em meio de cultura de células SILAC, seguido por transfecção de plasmídeo de ADN que codifica uma proteína de interesse. As células foram então lisadas, a concentração de proteína normalizada, e quantidades iguais de lisado purificado por afinidade em agarose de anti-GFP. Quantidades iguais de eluato foram então combinados e submetidos à análise de LC-MS/MS. Os resultados desta análise são então processadas para identificar proteínas de elevada confiança: interacções de proteína (Figura 1).SILAC imunoprecipitação permite a identificação não só de interações diretas, mas também baixa afinidade ou interações indiretas com complexos de proteína 4. Usando este sistema, eIF4AI e II imunoprecipitações permitiu a identificação reprodutível e confiável do parceiro de ligação primária eIF4G (isoformas I / II e III) 5, assim como as interacções indirectas com a eIF4E, e os vários componentes do complexo eIF3.
A estratégia suspenso SILAC descrito aqui representa um meio muito sensíveis e poderosos de detectar nova proteína: interações proteína, e, além disso, permite que a discriminação rápida e simples de padrões de ligação entre as amostras alteradas estreitamente relacionadas de interesse. Neste exemplo, esta técnica foi utilizada para investigar a relação proteína: interacções proteicas das proteínas eIF4AI e eIF4AII 6. Para o conhecimento do autor, este é o primeiro estudo na literatura explorando a utilidade da proteômica SILAC para investigar o interactome celular destas duas isoformas de eIF4A.
A abordagem descrita acima utiliza um GFP-tag e anti-GFP grânulos 9, 10 e, por conseguinte, as modificações podem ser necessárias para permitir que esta abordagem para ser utilizado para uma proteína específica de interesse, por exemplo, se a marca é colocada na extremidade N-ou C-terminal de uma proteína. Sempre que possível, Western blot ou ensaios funcionais devemser realizados para detectar a ligação de um parceiro de interacção proteína conhecida. Se uma proteína não tolerar fusão com a tag GFP, outra marcação ou estratégias suspensos foram aplicadas a pulldowns SILAC usando as duas outras tags (Flag 11, Biotina 12, STREP (dados próprios, não publicado)), ou usando anticorpos primários contra uma proteína de interesse onde siRNA knockdown da proteína-alvo fornece uma amostra de controlo 13. Tais experiências têm sido descritos em outros lugares na literatura, mas em breve, passo 1, e as etapas de 5,4-8 seria aplicada como acima, com passos 2-5,3 modificados conforme apropriado para o sistema de expressão / suspenso de escolha da utilização de factores de proteínas iguais como descrito em os passos 2,4-2,5. À medida que as fases de quantificação permitir proteínas de ligação não específicas a serem removidos no nível de análise, recomenda-se omitir a pré-incubação com esferas de controlo, ou lavagens elevados de sal, a fim de preservar a proteína de baixa afinidade: interacções de proteína com uma proteína de interesse . A ma nucleasey ser incluído ou omitido a partir deste protocolo de acordo com as especificidades de uma experiência particular. Por exemplo: como as proteínas utilizadas neste método são as helicases de RNA, RNase cocktail foi incluído no protocolo para remover interacções indirectas mediadas através do ARN (passo 3.2). Em alguns casos, no entanto, não pode ser beneficiar realizando experimentos paralelos com e sem nuclease para identificar ácidos nucléicos interações dependentes.
Dentro deste protocolo, a troca de amostras "pesados" em experiências idênticas, "médio" e é recomendado para controlar a variação introduzida por diferenças nos media SILAC ou crescimento celular. Um controle alternativo envolve a troca sequencial de todos os três ('light', 'médio' e 'pesado') de mídia em experimentos de réplica. Enquanto esta abordagem é potencialmente mais rigorosas, que faz aumentar a complexidade da análise, tal como em, pelo menos, uma réplica, uma proteína de interesse wdoente ser produzida em células marcadas "light" e por isso é necessário fazer a distinção entre proteínas consistentemente identificados em amostras de "light" (contaminantes ambientais, como a queratina), e aqueles que só são enriquecidas em amostras "light", quando ligado a uma proteína de interesse.
Embora o uso de dados permite a discriminação de quantificação específicos do de interacções não específicas através da utilização de um limiar, inevitavelmente algumas interacções genuínas pode ser descartado. A abordagem acima é uma abordagem simples e rápido para identificação de proteína: interações proteína que pode ser facilmente tentados por pesquisadores com nenhuma experiência anterior com espectrometria de massa, ou de análise de grandes conjuntos de dados de interação proteína: proteína. Para a maioria das utilizações este é mais do que suficiente para a identificação de novas proteínas de interesse. Outras modificações para essa abordagem para ajudar a reduzir a perda de dados são descritos em outro lugar na literatura e incluem o uso de um prbiblioteca freqüência otein onde conhecido proteínas contaminantes para um conjunto específico de parâmetros experimentais (linha celular, matriz talão, condições buffer) podem ser excluídos 10, 14. No entanto, dependendo das condições experimentais particulares, pode ser necessário executar uma série de experiências de controlo para gerar um proteoma do grânulo e, por conseguinte, este pode aumentar tanto o custo e complexidade do experimento. Mais informações sobre esta técnica está disponível no site da www.peptracker.co.uk 14.
Deve também notar-se que o protocolo descrito acima envolve a mistura de amostras marcadas de forma diferente no final do processo de imunoprecipitação (denominada uma Mistura Após Purificação – MAP SILAC experimento). Isto é feito como proteína: interacções de proteínas ocorrer num determinado equilíbrio 15. Deve notar-se que outros grupos combinaram esta abordagem MAP SILAC descrito neste protocolo com a incubação das amostrasantes de suspenso (Purificação Após mistura – PAM SILAC) para diferentes períodos de tempo (de 20 min a 2 h foram utilizados na literatura) 15, 16. Com base em como rapidamente uma proporção de proteína de gotas em relação de 1:1, é possível investigar qualitativamente afinidades de ligação e para definir as proteínas como as proteínas que interagem estáveis ou dinâmicos 15.
Em resumo, pulldowns SILAC representar um meio muito poderoso de identificação de proteínas que interagem com uma dada proteína de interesse, em um ambiente fisiologicamente relevante. A técnica pode ser muito facilmente adaptado a um certo número de diferentes estratégias de purificação, o que permite a sua aplicação a qualquer proteína de interesse. A quantificação dos resultados simplifica grandemente a identificação de interacções genuínos, e permite o relaxamento das condições do tampão utilizado para remover rigorosas ligantes não específicos, e assim preserva as interacções de baixa afinidade. Como até três amostras pode ser comparado, em que precedeestratégia, a técnica tem pontos fortes claras na comparação diferenças na proteína de ligação entre as diferentes isoformas de proteínas, proteínas mutantes, ou o efeito de inibidores farmacológicos. Como fatias inteiras de gel são analisados em vez de bandas individuais que mancha de Coomassie, o número de proteínas identificadas em alta confiança são normalmente mais elevados do que aqueles identificados em uma GST / TAP-suspenso padrão, e experimentador viés na seleção de proteínas de interesse é removido. Assim, a técnica compara muito favoravelmente com outras técnicas comumente usados utilizados na identificação de novos proteína-interações (levedura 2-híbridos, GST / His ou TAP Pulldowns).
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações do Wellcome Trust e BBSRC a IG. IG é um Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |