Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.
Protein etkileşimleri: İmmün afinite temizliğinin, SILAC immüno ile birleştirildi, kantitatif proteomik yeni bir proteinin keşfi için güçlü bir aracı temsil etmektedir. Kontrol ve test örnekleri hem de protein bolluk doğru nispi miktarını vererek, gerçek etkileşimleri kolayca deneysel kirletici ayırt edilebilir. Düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşulların kullanılmasıyla boyunca korunmuş ve kolaylıkla tanımlanabilir devam edilebilir. Bu protokol bir kütle spektrometresi tesisine sunulması için hazırlanmasını takiben ilgi proteini, etiketlenmiş bir yakınlık kararlı izotop etiketli amino asitler, nakil ve immunoprecipitation doku kültürü hücreleri etiketleme tartışır. Bu protokol daha sonra ilgi bir protein ile etkileşim hücresel ortakları belirlemek için kütle spektrometresi döndürülen verileri analiz etme ve yorumlama anlatılır. Bir örnek olarak, bu teknik, kimliklerini uygulanıreIF4AI ve eIF4AII: ökaryotik translasyon başlatma faktörleri için bağlama proteinleri haklı göstermeye çalışıyorlar.
Protein işlevlerini anlamada önemli bir adım, ilgili etkileşen proteinlerin belirlenmesidir. Bu tür proteinler bilinmeyen Nereye mevcut tekniklerin bir dizi, kendi yararları ve sakıncaları ile her vardır. Bu maya iki-hibrid sistemi, yeniden birleştirici protein kullanılarak açılan deneyleri, hem de tandem afinite arıtma ya da kademe etiketleme 1, 2 içerir.
Bu teknikler için daha yeni bir ek (SILAC) 3 hücre kültürü içinde amino asitlerin izotop etiketleme kullanılarak niceliksel ardından kütle spektrometrisi ile ilgili bir memeli hücre hattından ilgi konusu bir proteinin afinite saflaştırma birleşimidir. Bu, hücre lokalizasyonu ve post-translasyonel modifikasyonlar maya iki-hibridli bir yaklaşım göre avantajları fazla avantaj, hem de tedirgin değildir sahip geleneksel TAP etiketlemeyi rea olanak sağlayan bir nicel değil, nitel yaklaşım olmasıylaDily özellikle bağlanan konak faktörler, proteinler ve kirletici etkileşim spesifik olmayan ayırt. Bir örnek olarak, tipik olarak daha çok tek tek protein bantları dışında, bütün incelendiğinde daha ayrıntılı olarak, ilgi konusu proteinlerin benzer bir protein jeli üzerinde göç eden, ne de, tipik olarak boyanarak görünür olması için yeterli seviyelerde mevcut olması gerekir, yol maskelenir değildir güvenle belirlenen protein 4 artan sayıları.
Bu tekniği göstermek için, yakından ilgili ökaryotik çeviri başlatma faktörü GFP füzyonlarıdır eIF4AI ve eIF4AII% 90 amino asit kimliği üzerindeki payının SILAC-immünopresipitasyon nicel Proteomikte tarafından incelenmiştir. İnsan eIF4AI ve II GFP eIF4A of N-terminaline bağlı bir füzyon proteini oluşturmak için pEGFP-C1 klonlanmıştır. Geçici transfeksiyon izotop işaretli 293T hücreleri, bu yapıları teslim etmek için kullanılmıştır kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için kaçınmak gerekir.
<p class="Jove_content"> Hücreler ilk olarak ilgi konusu bir proteini kodlayan plasmid DNA transfeksiyonu ardından hücre kültürü ortamı SILAC iki hafta boyunca işaretlendi. Hücreler daha sonra, lize normalleştirilmiş protein konsantrasyonu ve lizat afinite eşit miktarlarda anti-GFP agaroz üzerinde saflaştırılmıştır. Eluatın eşit miktarları daha sonra, bir araya getirilmiş ve LC-MS/MS analizi için gönderilmiştir. Bu analizin sonuçları daha sonra yüksek bir güven proteini tespit etmek için işlenir: protein etkileşimleri için (Şekil 1).SILAC immüno doğrudan etkileşimleri hem de düşük afinite ya da protein kompleksleri 4 ile doğrudan etkileşimleri sadece tanımlanmasını sağlar. Bu sistemi kullanarak, eIF4AI ve II imüno birincil bağlanma ortağı eIF4G (izoformlar I / II ve III) 5 tekrarlanabilir ve güvenli kimlik, hem de eIF4E ile dolaylı etkileşimleri ve eIF3 kompleksinin çeşitli bileşenler izin verdi.
Burada açıklanan SILAC açılan bir strateji, yeni proteini tespit etmek için bir çok hassas ve güçlü bir mekanizma: protein etkileşimleri ve bundan başka ilgi yakından ilgili örnekler arasında değişmiş bağlanma kalıplarının hızlı ve basit bir ayrım sağlar. EIF4AI ve eIF4AII proteinlerin protein etkileşimleri 6: Bu örnekte, bu teknik proteini incelemek için kullanılmıştır. Yazarın bilgisine, bu eIF4A bu iki izoformlannın hücresel interactome araştırmak için SILAC proteomiks programını istismar literatürdeki ilk çalışmadır.
Yukarıda tarif edildiği gibi bir yaklaşım, GFP-tag ve anti-GFP boncuk 9, 10 ve bu nedenle modifikasyonlar etiket N-ya da yer olup olmadığını, örneğin ilgi özel bir protein için, kullanılmak üzere, bu yaklaşım sağlamak için gerekli olabilir kullanır Bir proteinin C-terminus. Mümkün olan yerlerde, western blotlar ya da işlevsel tahlilleri gerektiğiBilinen bir protein etkileşim ortağının bağlayıcı tespit etmek için gerçekleştirilebilir. Bir protein, bir GFP etiketi, diğer etiketleme veya açılan stratejileri ile füzyon tahammül gereken diğer etiketler her ikisini de kullanarak SILAC Pulldowns uygulanmıştır (FLAG 11, 12 Biotin, STREP (kendi veri, yayınlanmamış)) ya da bir proteine karşı antikorlar kullanılarak, birincil ilgi konusu hedef proteinin siRNA portatif bir kontrol numunesi 13 içerir burada. Bu tür deneyler, literatürde başka yerlerde tarif edilmiştir, ama kısa olarak, basamak 1 ve adım 5,4-8 tarif edildiği gibi eşit protein girdileri ile tercih edilen bir ekspresyon / açılan sistemi için uygun şekilde modifiye adımları 2-5,3, yukarıda tanımlandığı gibi uygulanmış olur 2,4-2,5 adımları. Aşamaları miktar non-spesifik bağlanma proteinleri analiz düzeyinde çıkartılmasına olanak sağlamak üzere, düşük-protein afinite korumak için kontrol boncuk veya yüksek tuzlu yıkama ile ön-inkübasyon devre dışı bırakmak için önerilir: ilgi konusu bir protein ile bir protein etkileşimleri . Bir nukleaz may dahil veya belirli bir deney özelliklerine göre bu protokol atlanabilir. Örnek: Bu yöntemde kullanılan proteinler RNA helikazlar gibi, RNaz kokteyl RNA (adım 3.2) aracılık ettiği dolaylı etkileşimleri kaldırmak için protokol dahil edilmiştir. Bazı durumlarda bununla birlikte, nükleik asit bağımlı etkileşimlerini tespit etmek nükleazı ile ve olmadan paralel deneyler çalıştırmasını fayda var olabilir.
Bu protokol dahilinde, "orta" ve tekrarlanan deneylerde "ağır" örnekleri arasında sviçleme SILAC ortam veya hücre büyümesi farklılıklardan ortaya varyasyon kontrol etmek için önerilmektedir. Bir alternatif kontrol çoğaltma deneylerinde her üç ('hafif', 'orta' ve 'ağır') medya sıralı anahtarlama içerir. Bu yaklaşım, potansiyel olarak daha sıkı iken, en az bir tekrarında, ilgi konusu bir protein w olarak, analiz karmaşıklığını artırmak etmezhasta 'hafif' etiketli hücrelerinde üretilen ve bu nedenle sürekli olarak 'hafif' örneklerinde (örneğin keratinlerden gibi çevresel kirleticiler) ve bir proteine bağlı yalnızca 'hafif' örneklerinde zenginleştirilmiş olanlar tespit proteinler ayırt etmek gerekir faiz.
Nicel veri kullanımı sağlar iken bir eşik kullanımı yoluyla spesifik-olmayan-spesifik etkileşimleri ayrımcılık, kaçınılmaz olarak bazı gerçek etkileşimler atılabilir. Yukarıdaki yaklaşım protein belirlenmesi için basit ve hızlı bir yaklaşımdır: kolayca hiçbir önceki kütle spektrometresi ile deneyim, veya büyük protein analizi ile araştırmacılar tarafından teşebbüs edilebilir protein etkileşimleri: protein etkileşim veri setleri. Birçok kullanım için bu ilgi yeni proteinleri tanımlamak için fazlasıyla yeterli. Bu veri kaybını azaltmak için bu yaklaşım daha fazla başka modifikasyonlar literatürde tarif edilen ve bir PR kullanımını içerirDeneysel parametreler (hücre hattı, kordon matris, tampon koşulları kullanılarak) belirli bir kümesi için kirletici madde proteinlerinin bilinen otein frekans kütüphane 10, 14, iptal edilebilir. Bununla birlikte, özel deneysel parametrelere bağlı olarak bir boncuk proteomesini oluşturmak için kontrol deneyleri bir dizi çalıştırmak için gerekli olabilir ve bu nedenle, bu denemenin masraf ve karmaşıklığını hem de artırabilir. Bu teknikle ilgili ayrıntılı bilgiler www.peptracker.co.uk web sitesinden 14 edinilebilir.
Ayrıca protokol (- MAP SILAC deney saflaştırma sonra bir karıştırıcı olarak adlandırılır) immünopresipitasyon işleminin sonunda farklı işaretlenmiş numune karıştırma içerir, yukarıda tarif unutulmamalıdır. Bu protein olarak yapılır: protein etkileşimleri, belirli bir denge 15 meydana gelir. Bu, diğer gruplar örneklerin inkübe bu protokolde tarif edilen bu MAP SILAC yaklaşımı kombine unutulmamalıdırönce aşağı çekme etkisi (Karışım sonra saflaştırma – PAM SILAC) için, farklı zaman süreleri için 15, 16 (2 saat için 20 dakika literatürde kullanılmıştır). Bir protein oranı 1:1 'e doğru düşmektedir ne kadar hızlı göre, bu nitelik bağlanma afinitelerinin saptanması ve stabil veya dinamik etkileşen proteinlere 15 gibi proteinleri tanımlamak mümkündür.
Özet olarak, SILAC Pulldowns fizyolojik olarak uygun bir ortamda, ilgi konusu bir protein ile etkileşen proteinlerin belirlenmesi için bir çok güçlü bir aracı temsil eder. Bu teknik, çok kolay bir şekilde ilgi duyulan herhangi bir protein uygulanmasını sağlayan, farklı saflaştırma bir dizi strateji adapte edilebilir. Sonuç miktarının büyük ölçüde gerçek etkileşim tanımlanmasını kolaylaştırır, ve spesifik olmayan bağlayıcı kaldırmak için kullanılan tampon sıkı koşullar gevşemesine izin verir ve bu nedenle düşük afiniteli etkileşimler korur. En fazla üç numune, yukarıda karşılaştırılabilir gibistrateji, bu teknik, farklı protein izoformları, mutant proteinler, ya da farmakolojik inhibitörlerinin etkisi arasında farklılıklar bağlama proteini karşılaştırma açık güçlü sahiptir. Bütün jel dilimleri yerine bu Coomassil leke bireysel gruplarından daha incelendiğinde gibi, yüksek güven de tanımlanan proteinlerin numaraları genelde standart bir GST / TAP-pulldown belirlenen daha yüksektir, ve ilgi proteinleri ortadan kaldırılır seçiminde önyargı deneyci. Teknik, bu yüzden yeni protein-etkileşimleri (maya 2-hibrid, GST / His veya TAP PULLDOWNS) tanımlanmasında kullanılan diğer yaygın olarak kullanılan teknikler ile çok olumlu karşılaştırır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma IG Wellcome Trust ve BBSRC hibe tarafından desteklenmiştir. IG Wellcome Senior Fellow.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |