This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية هي مفيدة في البحوث الأساسية في القلب والأوعية الدموية المختبر لأنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة بأعداد كبيرة في إجراء واحد. بسبب التقدم في التكنولوجيا المجهر فمن السهل نسبيا لالتقاط الصور الخلية الحية لغرض التحقيق الأحداث الخلوية في الوقت الحقيقي مع الحد الأدنى من القلق بشأن الضيائية إلى الخلايا. يصف هذا البروتوكول كيفية التقاط صور timelapse الخلية الحية من الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية باستخدام مجهر القرص الغزل مبائر التالية تنبيغ lentiviral والغدانية لتعديل خصائص الخلية. تطبيق نوعين مختلفين من الفيروسات يجعل من الاسهل لتحقيق معدل تنبيغ التعبير والمستويات المناسبة لاثنين من الجينات المختلفة. ويمكن الحصول على صور جيدة التركيز الخلية الحية باستخدام نظام ضبط تلقائي للصورة المجهر، والتي تحافظ على التركيز مستقرة لفترات زمنية طويلة. تطبيق هذا الأسلوب، وظائف مهندس خارجياويمكن تحليل البروتينات إد أعرب في الخلايا الأولية مثقف. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن استخدامه لدراسة وظائف الجينات من خلال استخدام الرناوات siRNAs فضلا عن جهري الكيميائية.
لطالما استخدمت الفئران حديثي الولادة العضلية الأولية للتحقيق وظيفة cardiomyocyte في المختبر 1. فهي سهلة لعزل من الفئران الوليدة عن طريق العديد من الطرق راسخة 2-4. الأسلوب الأكثر شيوعا يستخدم كولاجيناز أو التربسين لهضم النسيج الضام للقلب قبل العزلة الخلية. وقد طور الباحثون أيضا أساليب لعزل العضلية من القوارض الكبار 5-8 وكذلك الفئران حديثي الولادة 9،10.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل العضلية من الفئران الوليدة حديثي الولادة، وتوظيف إجراء انزيم الهضم من خطوتين. يستخدم التربسين أول O / N عند 4 درجات مئوية، ومن ثم كولاجيناز المنقى في 37 درجة مئوية. الحضانة من أنسجة القلب مع التربسين O / N عند 4 ° C يقلل من الخطوات اللازمة لخلايا الحصاد بالمقارنة مع الطرق باستخدام حضانات متتابعة في محلول أنزيم دافئ 2. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام المشترك المنقىllagenase بدلا من الانزيمات الخام وتقلب الكثير إلى الكثير يمكن القضاء عليها، وبالتالي توفير تعزيز التكاثر.
الدراسات الفنية للبروتين معين غالبا ما تستخدم نظام التعبير البروتين باستخدام اتش 11-13 و / أو الفيروسة البطيئة 14-16. [تحذيري ملاحظة] ينبغي أن يتم إنتاج الفيروسية والتلاعب بها وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.
لا دمج اتش في جينوم المضيف. لديها كفاءة عالية جدا من تنبيغ في معظم أنواع الخلايا، بما في ذلك تقسيم الخلايا والخلايا غير تقسيم، وكذلك الخلايا الأولية وخطوط الخلايا المحددة. هذا يجعل اتش ناقل موثوق بها للتعبير الجينات. مستويات عالية من البروتين المشفرة بواسطة ناقلات اتش تطوير غضون 48 ساعة بعد تنبيغ، وأنها يمكن أن تستمر لعدة أسابيع 17. ومع ذلك، عيب واحد لاستخدام اتش للتعبير البروتين هو أن تطوير ادي المؤتلفnovirus على حد سواء معقدة وتستغرق وقتا طويلا. يشرح هذا العيب في جزء منه لماذا كثير من الباحثين قد تحول إلى lentiviruses عن المؤتلف التعبير الجيني. على عكس يبني الغدانية، وتوليد بناء lentiviral هو سهل وسريع. على الرغم من lentiviruses عموما أقل كفاءة من تنبيغ من الفيروسات الغدية، في كل من الانقسام وعدم تقسيم الخلايا، فإنها لا الاندماج في الجينوم المضيف. بالتالي، التعبير عن الجينات transduced أكثر استقرارا لlentiviruses من الفيروسات الغدية ل.
بسبب التقدم التكنولوجي في مجال المجهر، انه من الاسهل بكثير لالتقاط الصور الخلية الحية من الخلايا معربا عن البروتينات المؤتلف. هذا ينطبق حتى على سرعات معدل الفيديو الشراء. وهذا يسمح للمحقق لتحديد كيفية إجراء تعديلات خاصة في البروتين يؤثر في المصالح وظيفيا الخلية في الوقت الحقيقي. المجهر القرص الغزل مبائر لديها العديد من السمات الرئيسية التي تجعل من أسلوب الأمثل لليفالتصوير الخلية ه 18،19. الغزل يوكوجاوا القرص يسمح لأكثر من ذلك بكثير الحصول على الصور بسرعة، بينما في الوقت نفسه استخدام طاقة أقل بكثير من الليزر المسح الضوئي نقطة المجاهر متحد البؤر. كل من هذه الميزات الخاصة ومن المقرر أن القرص الغزل، والذي يحتوي على العديد من الثقوب متحد البؤر من خلالها الليزر يمر في وقت واحد للعينات. خلال الاستحواذ، القرص نفسه يدور بسرعة وبشكل مستمر 18-20. باستخدام نظام ضبط تلقائي للصورة من المجهر، يتم الاحتفاظ التركيز مستقرة على مدى فترات طويلة من الزمن. هذا يسمح للباحثين لاتخاذ ركز جيدا الصور الخلية الحية. لعبت الصور المكتسبة يعود إلى ملف الفيلم. ويتم تحليل هذه الصور باستخدام برامج تحليل الصور مثل يماغيج 21،22، 23 في فيجي، أو غيرها من البرمجيات المتاحة تجاريا.
لطالما استخدمت العضلية الأولية المعزولة من الفئران حديثي الولادة لدراسة وظائف cardiomyocyte في المختبر. يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل العضلية حديثي الولادة من الجراء الفئران باستخدام خطوتين طريقة انزيم الهضم، هضم الأول مع التربسين O / N عند 4 درجة مئوية ثم كولاجيناز ا?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
2% gelatin | Sigma | G1393 | |
One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
Aluminium foil | any brand | ||
parafilm | Sigma | P7543 | |
Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
Cell counter | |||
Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
Section 2 lentiviral transduction | |||
three packaging plasmids | |||
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
transfection reagent | |||
polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
HEPES | Sigma | H3375 | |
10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Section 3 Adenoviral transduction | |||
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
Section 4 live cell imaging | |||
Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
Medium | |||
CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |