Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51669
Automatic Translation
1, 2, 2
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

Summary

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

Abstract

פיתחנו ומאומתים ניאון סימון המתודולוגיה למעקב משובט של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה ללמוד בhematopoiesis vivo תוך שימוש במודל ניסיוני להשתלת מח העצם עכברי. קומבינטורית גנטי סימון באמצעות וקטורי lentiviral קידוד חלבוני ניאון (fps) אפשר מיפוי גורל תא באמצעות הדמיה מיקרוסקופית מתקדמת. וקטורי קידוד חמישה FPS שונה: Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry שמשו לtransduce מקביל HSPCs, יצירת צבעים מגוונים של תאי צבע מסומן. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ ההיברידי confocal / שני פוטונים מאפשרת הערכה בו זמנית ברזולוציה גבוהה של תאים מסומנים באופן ייחודי וצאצאיהם בשיתוף עם רכיבים מבניים של הרקמות. נפח ניתוחים על פני שטחים גדולים מגלה כי ניתן לאתר תאים נגזרים HSPC מקודדים ספקטרלי הלא פולשני ברקמות שלמות שונות, כוללים מח העצם (BM), לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה. מחקרים חיים שילוב multiphoton וידאו שער והזמן לשגות הדמיה confocal ב4D להדגים את האפשרות של מעקב סלולארי ומשובט דינמי באופן כמותי.

Introduction

ייצור תאי דם, hematopoiesis מכונה, מתוחזק על ידי אוכלוסייה קטנה של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs). תאים אלה נמצאים בתוך מח העצם (BM) בנישה microenvironmental מורכבת הכוללת אוסטאובלסטים, תאי סטרומה, רקמת שומן, ומבנים של כלי דם, כל מעורבים בשליטה של התחדשות עצמית ובידול 1,2. כBM שלם באופן מסורתי נגיש לתצפיות ישירות, יחסי הגומלין בין HSPC וmicroenvironment שלהם נשארים uncharacterized במידה רבה in vivo. בעבר, הקמנו מתודולוגיה לדמיין את ארכיטקטורת 3D של BM שלם באמצעות הקרינה confocal והשתקפות מיקרוסקופיה 3. אנו מתאפיינים הרחבת HSPCs המסומן EGFP בBM, אבל השימוש רק FP יחיד מנע ניתוח של התחדשות ברמה משובט. מאוד לאחרונה אנו ניצלנו את lentiviral ג'ין אונטולוגיה (לגו) וקטורים constitutively להביע flחלבוני uorescent (FPS) כדי לסמן ביעילות תאים 4,5. Co-התמרה של HSPC עם 3 או 5 וקטורים יוצרת צבעים מגוונים של צבעים קומבינטורית, המאפשר מעקב של שיבוטים HSPC בודדים מרובים.

שילוב HSPC המסומן בטכנולוגיית הדמיה חדשה רשאית להתחקות ביות HSPC פרט וקליטתם בBM של עכברים המוקרנים. וקטורים לגו שמשו כדי לסמן HSPC עם 3 או 5 fps שונה (מCerulean, eGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry) ובצעו את קליטתם שלהם לאורך הזמן בBM על ידי מיקרוסקופ confocal ו2 פוטונים, המאפשרים הדמיה ברורה של עצם ואחר מבני מטריצה, ואת הקשר של שיבוטים HSPC לרכיבים של microenvironment. HSPC היו מטוהר כתאי שושלת שליליים מC57Bl / 6 עכברים BM, transduced עם וקטורים לגו, וreinfused על ידי הזרקה לוריד זנב לעכברי congenic-מלוטש myelo. על ידי מעקב אחר כמויות גדולות של רקמת עצם החזה BM אנו דמיינו engraftment endosteal מתרחש בתחילתהתחדשות BM. צבירי תאים עם ספקטרום צבעים מגוון הופיעו בתחילה בסמוך לעצם והתקדם באופן מרכזי על פני זמן. מעניין, אחרי יותר מ 3 שבועות מח מורכב מאשכולות משובטים מאקרוסקופי, המצביע על התפשטות hematopoiesis נגזר מHSPCs הבודד בסמיכות במוח, ולא הפצה נרחבת של HSPCs באמצעות זרם הדם. היה גיוון צבע פחות בנקודות זמן מאוחרות, המצביע על הקושי בtransducing לטווח ארוך אכלוס מחדש תאים עם וקטורים מרובים.

בנוסף, HSPCs נוצר אשכולות בטחול, איבר אחראי גם על hematopoiesis בעכברים. תאים בודדים המופק HPSC יכולים להיפתר בבלוטת התימוס, בלוטות לימפה, טחול, כבד, ריאות, לב, עור, שרירי שלד, רקמת שומן, וכליות, כמו גם. ניתן להעריך תמונות 3D איכותית וכמותית להעריך את חלוקת תאים עם הפרעות מינימליות של הרקמות. לבסוף, אנו מדגימיםד ההיתכנות של מחקרים דינמיים חיים ב4D על ידי שילוב של multiphoton סריקת תהודה וזמן לשגות הדמיה confocal. מתודולוגיה זו מאפשרת רזולוציה גבוהה שאינו פולשנית, רב ממדית מעקב תא גורלם של אוכלוסיות תאים מסומנות ספקטרלי באדריכלות 3D שלמה שלהם, מתן כלי רב עוצמה במחקר של התחדשות ופתולוגיה רקמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העכברים שוכנו ויטופלו בהתאם למדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של המכון הלאומי לבריאות, ונרשם בפרוטוקול שאושר בועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים NHLBI. נקבה B6.SJL-Ptprc (ד) Pep3 (ב) / BoyJ (B6.SJL) וC57Bl / 6 עכברים, 6-12 שבועות, שמשו כתורם למקבל, בהתאמה.

רשימה של חומרים, חומרים כימיים, וציוד מסופקת בטבלה 1.

.1 לגו התמרה של עכבר HSPCs והשתלת מח עצם

בצע את ההליכים מתוארים להלן בקבינט (מכסה המנוע בתרבית רקמה) רמת בטיחות ביולוגית מוסמכת 2 (BSL-2).

  1. ייצור של לגו וקטורי קידוד 5fps
    1. השתמש בlentiviral "ג'ין אונטולוגיה" (לגו) פלסמידים וקטור, כל קידוד FP שונה מאמרגן חזק מכונן SFFV, כוללים לגו-Cer2 (Cerulean), לגו-G2 (EGFP), לגו-V2 (ונוס), לגו-T2 (TdTomato), והגו-C2 (mCherry) סיפק באדיבות על ידי ד"ר בוריס Fehse (אוניברסיטת המרכז הרפואי Hamburg-אפנדורף, המבורג, גרמניה); עכשיו זמין גם מAddgene 5-7.
    2. כדי לייצר וקטורים לגו, זרע 5 x 10 6 293T תאים ב10 מנות סנטימטר (להשתמש 12 מנות לכל וקטור) 24 שעות לפני transfection ב8 מ"ל של תקשורת I10 (IMDM השלים עם FCS 10% וגלוטמין / פניצילין / סטרפטומיצין).
    3. Transfect תאים עם פוספט סידן באמצעות המלצות ערכת CAPHOS שונה מעט:
      1. עבור כל וקטור תמהיל צלחת 15 מיקרוגרם לגו, 12 מיקרוגרם pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 מיקרוגרם קודם-TAT, ו1 מיקרוגרם פלסמידים pMD2.G-VSV-G בנוכחות של 50 μl 2.5 M CaCl 2, ומוסיף מים עד ל תניב נפח כולל 500 μl.
      2. פלסמידים המשקע DNA עם 500 μl של 2x HeBS (HEPES שנאגרו מלוח) ו דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר לפני הוספה לכל צלחת של תאי 293T.
      3. דגירה תאים עבור6 שעות ב5% 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2; להסיר תקשורת ולהוסיף הודעה hr transfection תרבות תקשורת 6 הטרי.
    4. לאסוף supernatants התרבות המכיל חלקיקי lentiviral מכל צלחת, יומי, במשך 3 ימים. כל אוסף supernatant למחרת להוסיף מדיה I10 טרי לכל צלחת.
      1. לסנן דרך 0.22 מיקרומטר נקבוביות, בריכה ולהתרכז supernatants ידי ultracentrifugation על הרוטור SW28 לשעה 2 ב 71,900 XG ו4 ° C..
      2. Resuspend supernatants ב1 מ"ל של תקשורת StemSpan. Aliquot מניות lentiviral ב200 μl ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. טיטרציה של lentiviral חלקיקים
    לקבוע את כייל של חלקיקי וקטור לגו בsupernatants נאסף באמצעות לכמת transducing יחידות מ"ל / שימוש בתאי NIH3T3. Titers לאפשר חישוב הנפח של כל supernatant וקטור הדרוש כדי לגרום לריבוי היחסי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) ליעד ניסויתאים.
    1. צלחת 5 x 10 4 NIH3T3 תאים לכל טוב (12 גם צלחת) ב2 מ"ל של תקשורת I10 יום אחד לפני טיטרציה.
    2. הכן דילולים סידוריים פי 5 של supernatants וקטור בתקשורת I10 תוספת סולפט protamine (4 מ"ג / מ"ל ​​הוא 1,000x).
    3. הסר את המדיה מהתאים, ולהחליף עם 500 μl של דילולים supernatant המכילים את המקבילה של 2, 0.8, 0.32, ו0.128 μl של נגיף מרוכז.
    4. לקבוע את המספר (לא) של תאים נוכחים לכל גם בעת התמרה, ספירת שליטה אחד גם.
    5. 6 שעות לאחר התמרה, להוסיף 2 מ"ל של תקשורת I10 ודגירה במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    6. קציר התאים מכל גם באמצעות טריפסין-EDTA, ולקבוע את אחוז תאי ניאון (% FP) באמצעות cytometry זרימה.
    7. חשב את כייל כדלקמן, בממוצע titers התקבל לכל היטב (דילול) וכתוצאה מכך FP% בין 1% ו50: כייל (מ"ל / חלקיקי וקטור) = לאx% FP / עוצמת קול של supernatant וקטור (מ"ל). ממוצע titers התקבל לכל דילול אם FP% הוא בין 1% ו50.
  3. אוסף נייד עכבר, טיהור, התמרה, והשתלה (סכמטי שמוצגת באיור 1 א מותאם מMalide et al. 4).
    1. להקריב את עכברי תורם על ידי נוהל שאושר. מח עצם קציר מגפיים קדמי ואחוריים: לנתח humeri, עצמות ירך וtibias, ביסודיות להסיר את כל השרירים, רצועות ורקמות עודפות מעצמות, חצה את סופו של כל עצם קרוב ככל האפשר למפרק, ולשטוף את מח העצם מתוך העצם באמצעות מחט G 27-0 במזרק המכיל תקשורת I10.
    2. גלולה כל התאים במח עצם עבור 10 דקות ב XG 500, 4 ° C וlyse תאים אדומים פעמיים עם 50 מ"ל חיץ ACK. תאים גלולים ב10 מ"ל תקשורת I10.
    3. לטהר שלילי שושלת תאי אב (Lin-) עם ערכת דלדול שושלת MACS לפי protoco ערכה שונהl:
      1. השתמש 30 μl של microbeads אנטי ביוטין במקום 10 μl / 10 7 תאים; השלם את שלבי כביסה עם תקשורת I2 (IMDM בתוספת 2% FCS) במקום חיץ.
      2. הכנס צעד כביסה אחת בין הדגירה עם קוקטייל ביוטין-נוגדן והדגירה עם Anti-ביוטין microbeads; ולאזן את העמודה עם I10 במקום חיץ.
    4. תאי Lin- תרבות ל48 שעות בצפיפות התחלה של 5 x 10 5 תאים / מ"ל בתקשורת StemSpan תוספת 10 ng / IL-3 מ"ל העכברי, 100 ng / ml העכברי IL-11, 100 ng / ml האנושי Flt-3 ליגנד, ו50 ng / גורם תאי גזע עכברי מ"ל.
    5. העברת 1 עד 4 x 10 5 תאים ל12 גם צלחות מצופות RetroNectin וtransduce עם supernatants לגו, כל אחד בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 6-7 כדי להשיג 50% יעילות ביטוי לכל FP, בנוכחות StemSpan תקשורת וציטוקינים שפורטו לעיל ו4 מיקרוגרם / סולפט protamine מ"ל.
    6. Transduce תאיםעם כל וקטור לגו בנפרד כמתואר בשלב 1.3.5 ולערבב תאים הבאים התמרה (שמכונה Mix) או עמיתים לtransduce תאים עם כל supernatants הווקטור 5 לגו בו זמנית (שמכונה Co). הסרת תאים 24 שעות מאוחר יותר, לשטוף פעם עם תקשורת StemSpan ללא ציטוקינים, וresuspend אותם בתקשורת StemSpan ללא ציטוקינים להשתלה, או להעביר אותם לתקשורת טריות עם ציטוקינים, ותרבות ל96 שעות נוספות לפני מיקרוסקופיה confocal וcytometry זרימה.
      1. לבצע השתלת מח עצם על ידי יציקת transduced Lin- HSPCs באמצעות הזרקה לוריד זנב למקבלי 11 מנה אחת Gy מראש מוקרנים-(6-18 שעות לפני השתלה) נמענים, בהיקף של 100 μl, במינון תא לכל עכבר המתאים ל1 תאי -4 x 10 5 Lin- מצופה במקור לתמרה. בכל ניסוי, השתלת עוקבה שלמה של בעלי חיים עם אותה האוכלוסייה של תאי BM תורם transduced.
      2. לאפיון במבחנה של H transducedהחברות הייעודיות, תרבות התאים ל4-5 ימים נוספים בStemSpan השלימו עם ציטוקינים ולנתח על ידי cytometry זרימה ליעילות התמרה, ועל ידי מיקרוסקופ לגיוון צבע.
        1. להקריב את העכברים בודדים ולאחזור רקמות ואיברים להדמיה, בשעה שונות מצביעה עד 120 ימים לאחר השתלה.
          1. תרסיס עם אתנול הפרווה של העכבר ולחתוך את העור בצד הגחון הימנעות הפצת שיער.
          2. לנתח ובלו על פי נהלים קבועים בטחול, בלוטות לימפה popliteal, ריאות, לב, עור, רקמת שומן, שריר שלד, בכליות, בכבד, כמו גם את הראש לגישה לcalvaria.
          3. לחלופין, להשתמש calvaria או להגדיר חלון עצם הדמיה לחיות שוב ושוב לאורך זמן 2,8,9 או איברים שטחיים תמונה כגון בלוטות העור ולימפה בחי.
        2. מניחים איברים בודדים במנות תרבות מכסה זכוכית מספר 0 35 מ"מ ב50-10056; l PBS להדמיה אותם בשלמות ללא חתך, קיבעון או עיבוד נוסף כמתואר בשלב 2.5.
        3. הדמיה נפח, לשמור על האיברים בPBS הקר עד לשימוש. הדמיה זמן לשגות פנו מייד להדמית איברים בDMEM, 10 FBS% מכיל 20 HEPES מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס

מיקרוסקופית 2 Confocal ושני פוטונים וניתוח תמונה

  1. לבצע הדמיה מיקרוסקופית באמצעות מערכת confocal חמישה ערוצים וmultiphoton Leica SP5 מצויד בקו רב ארגון, ננומטר 561 דיודה, ננומטר HeNe 594, וHeNe לייזרים גלויים 633 ננומטר. השתמש במצב 2 פוטונים, femtosecond פעמו טי: ספיר לייזר (Ti-Sa), מתכונן לעירור מ680 ננומטר 1,080 עם תיקון פיזור. השתמש בניסויים הכוללים אדום העביר FPS (tdTomato וmCherry), מתנד פרמטרים אופטיים (OPO) לייזר להארכת טווח אורכי גל הפלט ככל 1,030-1,300 ננומטר, ברצף או בו זמנית עם tהוא לייזר Ti-Sa.
  2. רקמות שונות תמונה באמצעות HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 אובייקטיבי NA טבילה במים (WD = 2.5 מ"מ),-PLAPO-HC CS / 0.70 אובייקטיבי 20X NA יבש (WD = 0.6 מ"מ), או HC-PL-IRAPO 40X /1.1 מטרת טבילה במי NA (WD = 0.6 מ"מ).
  3. לקבל ספקטרום הקרינה confocal איסוף ערימות מבדה (xyλ) של אור הנפלט ב5 ננומטר-רוחבי פס של הספקטרום הנראה מתאי BM transduced עם וקטור FP לגו בודד כמו גם של שליטה, לא-מושתל BM.
    1. תמונות תהליך עם תוכנת v2.4.1 Leica LAS-AF כדי ליצור ספקטרום התייחסות של כל 5 FPS כמו גם של autofluorescence (איור 2 א). שימוש בספקטרום FP הבודד וההבדל בבהירות הקרינה (מבוטא% מEGFP) של Cerulean (79%), ונוס (156%), tdTomato (283%) וmCherry (47%) להגדיר 5 ערוצי הדמיה רציפים כדלקמן: Cerulean (458/468-482 ננומטר), EGFP (488/496-514 ננומטר), ונוס (514/523-558 ננומטר), tdTomato (561/579-597 ננומטר), וmCherry (594/618-670 ננומטר) (
    2. לאמת הפרדת FPS מדויקת, כמו התאים transduced עם כל FP פרט גלויים רק בערוץ המקביל ונעדר מהשאר (איור 2 ג). בנוסף, גישה מרובות ערוצים מוגדרים זה יוצרת 5 ערוצים ייחודיים "colorprint" המאפשר ניתוח צבע שלאחר מכן ומעקב משובט ויש את היתרון של הפחתת פעמים רכישה בהשוואה להדמיה של רוח רפאים.
  4. פליטת הקרינה נפרדת, במצב 2 פוטונים, על ידי יעילות גבוהה מראות dichroic המותאם אישית ולאסוף עם ארבעה ערוצים שאינם descanned גלאי (NDD) באופן הבא: מראה dichroic ב568 ננומטר ואחריו מראה dichroic ב465 ננומטר, ואחריו 452/45 מסנן פליטת ננומטר לSHG או autofluorescence וCerulean, מסנן 525/40 ננומטר פליטה לEGFP או ונוס, ומראה dichroic 648 ננומטר ו620 / 60 ננומטר מסנן פליטה לtdTomato או mCherry.
    1. לחשוף מידע מבני על ידי i מיקרוסקופ שני פוטוניםהדמיה ניגוד ntrinsic (כמתואר לעיל) של autofluorescence רקמות מאלסטין, NADH, (נרגש ב780 ננומטר), והרמוני שני שנוצרו אות (SHG) מקולגן העצם ופיברילציה (נרגשת ב920 ננומטר או 860 ננומטר שנאסף במפוזר גב כיוון) 10,11.
  5. עבור נפח 3D טיוח, לאסוף סדרה של תמונות xyz (בדרך כלל גודל voxel 1 x 1 x 4 מיקרומטר 3) לאורך ציר z ב5 מיקרומטר מרווחים על פני טווח של מעמקים (150-300 מיקרומטר) בכל רחבי מוח העצם ורקמות אחרות, על פני אזורים גדולים באמצעות פונקצית האריח של התוכנה כדי ליצור באופן אוטומטי כרכי רקמה של הכוללים את כל fossae עצם החזה, כ 2.5 x 1.2 מ"מ 2 (XY) ו300 מיקרומטר (z) (2D-2E דמויות) ו1 סרט.
    1. תמונת calvarial מח ישירות דרך הגולגולת ללא חתך 2, 8.
    2. עצם החזה סעיף לאורך המישור הסגיטלי (ביתור) ולאחר מכןtransversally במפרק בין 2 sternal פוסי ותדמית באמצעות פניה לחתוך 3,4,12 (הסקירה באיור 1 ב מותאם מTakaku et al 3).
  6. הדמיה הזמן לשגות 4D, מקום טרי נכרתה בלוטה לימפה, טחול, ריאות popliteal, או דגימות עצם calvarial נימולה על מנות תרבות מספר 0 coverglass 35 מ"מ, ב50-100 μl DMEM, 10% FBS המכיל 20 HEPES מ"מ ב 37 מעלות צלזיוס ולהשתמש 2 פוטון עירור Ti-Sa (860 ננומטר) בשילוב עם עירור confocal (458 ננומטר, 488 ננומטר, 514 ננומטר, 561 ננומטר, 594 ננומטר) וסורק תהודה לייקה (8000 הרץ / sec), לוקח z-ערימות (~ 80 מיקרומטר) בשעה 20 מרווחי שניות לשעה עד 1.
    1. לשימוש הדמיה 2P שלושה צבעים בו זמנית Ti-Sa מכוון ב860 ננומטר בו זמנית עם לייזר OPO (מכוון ב1,130 ננומטר לtdTomato; או 1,140 ננומטר mCherry) (סרט 2).
  7. שיקום וניתוח של כרכי 3D ורצפי זמן 4D
    1. השתמש softw Imaris x64הם גרסת 7.6, או חבילות תוכנה חלופיות להפוך את הרעפים ערימות של תמונות גלם לשניתנו נפח (3D) נתונים של תאי ניאון בתוך מח עצם ורקמות שונות ולייצא אותם כסרטי 3D-סיבוב, כפי שתואר בעבר 3,4 (סרט 1) שלב אחר שלב דוגמא:
      1. בImaris, פתח את תמונת z-הערימה; בחר באפשרות "לעלות" על מנת להציג את ההדמיה נפח 3D.
      2. השתמש "לנווט" להגביר את עוצמת הקול בסביבת 360 °.
      3. בחר "אנימציה" כדי ליצור אנימציה; משתמש במסגרות מפתח כדי להוסיף צפיות נבחרו, הזום, סיבובים של הנפח; בתצוגה מקדימה של הסרט, לערוך את צורך ולשמור את הקובץ בפורמט רצוי סרט (לשעבר: avi, mov).
    2. להערכה כמותית של תדירות תא ושיבוט 3D, עמדות, הגדלים והפצה, תהליך נוסף z-הערימות באמצעות מודולים Imaris XT המשלבים יישומי MATLAB ביצוע שקילת משקל הג מרחקurements (באמצעות אלגוריתם שינוי מרחק) ואשכולות ניתוח, כפי שתואר לעיל 3,4. להפוך את הרצפים של ערימות תמונה לאורך זמן לסרטים שניתנו נפח ארבעת ממדים (4D) עם תוכנת x64 Imaris, ולהשתמש בנקודה וניתוח שטח למעקב semiautomated של תנועתיות תא בשלושה ממדים באמצעות אלגוריתמי תנועת אוטורגרסיה.
    3. לבצע ניתוח multispectral של תאים באופן הבא: לחלץ את הצבע רב כתמים שכותרתו על ידי הוספת כל 5 הערוצים באמצעות חשבון ערוץ של Imaris XT לערוץ חדש; לקבוע עבור כל הנקודות (תאים) את הקרינה בעוצמה הממוצעת בכל אחד מ5 ערוצי הרכיב. לייצא את הערכים בתוכנת Excel לעלילת גרפים המציגים את "colorprint" הייחודי כלומר% יחסי של כל FP בתא בודד (גרף איור 2E). לתקן את הנתונים שנקבעו לנדידת רקמה, ולחשב תא מהירות ותזוזה לאורך זמן, אורכי מסלול, שבילים, ומרחקים; ערכי יצוא בExcel תוכנה עבור מtware לתכנן גרפים. להרכיב דמויות מורכבות עם תוכנת Adobe Photoshop CSS 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההר-כל confocal 3D שחזורי מיקרוסקופיה / 2 פוטונים של קורס זמן מח עצם sternal חשף את הקליטה ולהרחבה של שיתוף 5fps המושתל בתבנית עם מאפיינים ראויים לציון: שיבוטים הופיעו מסומנים בצורה ברורה, מסומן homogenously עם פלטה רחבה של צבעים בתחילה והתקדמות לאורך זמן כדי להכיל באופן מועדף תאים של בעיקר בצבע אחד. התקנת מיקרוסקופיה confocal ודוגמאות מייצגות של HSPC המסומן 5fps הדמיה במוח עצם sternal הן באיור 2 וסרטים 1 ו -2.

שחזורי מיקרוסקופיה confocal / 2 פוטון כל ההר 3D של רקמות שלמות להדגים את האפשרות לאתר את גורלו של צבע מסומן נגזרים תאי BM לתקופות זמן ממושכים ברקמות החיות. דוגמאות מייצגות של תאי מח עצם נגזרים באיברי hematopoietic ולא hematopoietic לאחר ההשתלה מוצגות בFi תרשים 3.

איור 1
איור 1 סקירה כללית של הפרוצדורות. ) הצעדים סכמטי להמחיש בידוד של תאי Lin- BM, התמרה עם וקטורים לגו קידוד מגוון של גרסאות צבע FPS, וreinfusion של תאי transduced ל- מלוטש myelo עכברים (השתלת מח עצם). מח עצם ב) (עצם החזה, calvaria ), כמו גם איברים / רקמות שונות נבדקו על ידי מיקרוסקופ confocal ושני פוטונים בנקודות זמן שונים לאחר השתלה. לוח מותאם באיור 1 בMalide et al. 4 ולוח ב 'מותאם באיור 1 בTakaku et al 3.

"Width =" 2highres.jpg 600 "/>
איור התקנת 2 מיקרוסקופיה Confocal ודוגמא מייצגת להדמיה 5fps מסומנת HSPC במח העצם. ) ספקטרלי הדמיה (xyλ) משמשת להקלטת ספקטרום פליטת התייחסות לכל FP, שמודגם בהיסטוגרמות מנורמלת pseudocolored עם ציאן (Cerulean), ירוק (EGFP), צהוב (ונוס), מגנטה (tdTomato), ואדום (mCherry): מתרגש על ידי 594 (קו מוצק אדום) nm- לעומת 561 nm- (קו אדום מקווקו) גל B) חמישה ערוצים מוגדרים פליטה ברצף תמונה של:. Cerulean (468-482 ננומטר), EGFP (496-514 ננומטר), ונוס ( 523-558 ננומטר), tdTomato (579-597 ננומטר) וmCherry (618-670 ננומטר). פנלים וB מותאמים באיור 1 בMalide et al. הדמיה) 4 C של BM sternal מעכברים מושתלים עם transduced עם וקטורי FP בודדים. כל FP היה גלוי רק בתאים transduced עם הווקטור המקביל צילם בפרק המתאיםannel, ונעדר מאחרים (לא מדברים חוצי). D, E) engraftment והרחבה של שיתוף 5FP המושתל מסומן תאים במח העצם בגוף חי. ביום 4 לאחר ההשתלה (ד) אשכולות של תאים מסומנים במגוון רחב של צבעים היו קרבה גלויה קרובה לקצה העצם (SHG, לבן), הממוקמת בסמוך למעדיפים המשותף בין שני fossae. ביום 30 (E) שיבוט אחד גדול של צבע ייחודי (ירוקה - צהוב) הרחיבה לכבוש את כל fossae כפי שמודגמת בהתמזג כמו גם תמונות ערוצים בודדות. ניתוח תוכן FPS מדגים הומוגנית סימון על ידי 2 FPS גרסאות EGFP וונוס.

איור 3
איור 3 דוגמאות של תאי מח עצם נגזרים באיברי hematopoietic ולא hematopoietic לאחר השתלה. Tis שונהתתבע ואיברים הם צילמו ללא פגע דרך מעמקים של 150-200 מיקרומטר ושטח פנים גדול, תפור המחשוב ושניתנו ב 3D כמו שחזורי צל.) בלוטה לימפה popliteal ב120 ימים לאחר ההשתלה מדגימה תאים מפוזרים לרוב מסומנים בצהוב (ונוס) ו אדום (mCherry) מוקפים שולי על ידי סיבי קולגן (לבן, SHG). B) באופן דומה, הטחול באותו הזמן, מציג אשכולות קטנים ותאים בעיקר מפוזרים בצבעים שונים שזורים על ידי סיבי קולגן רשת. ג) בתאי ניאון כבד עם מורפולוגיה מרמזת על תאים דמויים כוכב, או מקרופאגים (תאי Kupffer) בצבעים שונים היו מיושרת לאורך רשת סיבי קולגן (SHG לבן) התוויית מבני אונתית כבד. ד) בדש עור צילם מתאי ניאון צד עורי של צבעים ומורפולוגיות מגוונים נראו, רוב עם גודל גדול ומורפולוגיה מרמז זהות של Langerhan או דמוי דנדריטים, lying תחת סיבי האלסטין (autofluorescence ב780 ננומטר, לבן) ולאורך קולגן (SHG ב920 ננומטר, לבנים) סיבי שריר וזקיקי שיער. E) בלב במבט מהצד epicardial תאי ניאון גדולים בודדים רבים עם המורפולוגיה כמו מקרופאג שמקורם משיבוטים מרובים המבוססים על הצבעים המגוונים ראו נראה באופן שטחי וגם ביניהם עמוקים יותר בין שריר לב (לבן) דמיין ידי autofluorescence שני פוטוניהם הפנימיים (ב780 ננומטר). אין שריר לב ניאון FP נצפה. תאים סמוכים (CE) של אותו הצבע מציעים באתרו ושגשוג למרחקים קצרי הגירה. F) בריאות תאי ניאון רבים עם צבעים מגוונים של צבעים היו מפוזרים בכל המבנה דמוי תחרה של סיבי קולגן (SHG) בכל העומק רמות, עם מורפולוגיות משתנים המצביעות על זהות התא, מקרופאג, וסוג 2 pneumocyte דנדריטים.

סרט 1 3D מחדשהבנייה של BM sternal ב 4 ימים לאחר ההשתלה Co 5fps. אשכולות של תאים מסומנים במגוון רחב של צבעים נראו בסמיכות לקצה העצם (SHG, לבן), הממוקם באופן מועדף בסמוך לחיבור בין שתי fossae. אנא לחץ כאן לצפייה בסרט הזה.

sternal זמן לשגות .2 4D סרט BM שני פוטונים ומיקרוסקופיה OPO ביום 39 לאחר ההשתלה Co 3FPs (Cerulean - הלבן, ונוס - הצהוב, tdTomato - מגנטה) עצם (SHG בלבן). שים לב כמה שיבוטים סטטי המסומנים בצהוב או בשילוב צהוב מגנטה הסמוך לעצם בניגוד לתאי אב ניעתי מאוד בודדים מיאלואידית. אנא לחץ כאן לצפייה בסרט הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מתארים כאן את הפרטים של מתודולוגיה חזקה המציאה לאחרונה למעקב תא משובט, המשלבים את המגוון הגדול שנוצר על ידי קומבינטורית סימון עם וקטורי קידוד-5FP לגו והדמיה עם confocal טנדם ומיקרוסקופיה 2 פוטונים כדי להשיג נפח והדמיה דינמית ברקמות חיות. זו הרחיבה את השימוש בצבע המבוסס על FP סימון על ידי הקלטת זהות רפאים confocal ב5 ערוצים 8 סיביות "ברורים". כך היחס היחסי של Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, mCherry בתוך כל תא יוצר "colorprint" ייחודי לזיהוי צאצאים משובטים. תיוג ססגוניות ידי 5fps מגדיל את לוח התווית עם מגוון יותר, שהוצג שימושי במיוחד כאשר בוחנים את החלוקה, אנשי קשר, הסדרי רעפים ואינטראקציות תחרותיות בין תאים או קבוצת תאים מאותו הסוג בדגימות רקמה צפופות. בשילוב עם עירור 2 פוטונים של תכונות מבניות הפנימיות של רקמות שונות ואיברים, אנו יכולים לעקוב אחר תאים משובטים צבע מסומן בסביבה הטבעית שלהם ללא הצורך בקיבוע וחתך פיזי. ההפגנה שתאי בת נגזרים מאבות אדם לשמור על "צבע הדפסה" ייחודית למרות בידול ושגשוגם הודגמה במחקר שפורסם, עם מאות תאים מובחנים מצאו במבחנת מושבות בודדות (CFU) מראים את אותו הדבר "colorprint."

גישה זו משלבת את היתרונות של תא בודד נפתר הדמיה ברזולוציה גבוהה יחד עם חתך אופטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal. x הגדול מאוד - y (2 מ"מ) אזורים שלם צפוף נפח הרקמה ניתן לבדוק על ידי יצירת רעפים תמונות. תמונות ברזולוציה גבוהה אלה מחלקים אופטיים יכולות לשמש כדי לשחזר המחשוב (באופן אוטומטי ו" על-the-fly ") כרכי 3D המלא של מורכבות גדולות לעומקים של ~ 30 מיקרומטר, הכוללות ~ 20-30 שכבות של תאים,כלי דם, עצמות ומבני קולגן. 3D שחזורים יכולים לשמש לניתוחים כמותיים לא פולשנית morphometric של עניין ביולוגי. אזהרה חשובה אחד כדי להצביע היא שנפח גדול / הדמיה ברזולוציה גבוהה היא זמן רב, במשך שעה למשל 1 ל~ 1 מ"מ 3 של רקמה (fossae אחד של עצם החזה), ולכן אנו ממליצים עכבר הדמיה לא יותר מ 1 לכל ניסוי ל יום שבו מח עצם, כמו גם רקמות שונות יש לבחון בפירוט.

למרות זאת הוא כרגע מבחינה טכנית בלתי אפשרי לתמונת מח עצם sternal באותו העכבר לאורך זמן שוב ושוב, ניתן להשיג מידע רב ערך על ידי לימוד עכברים בודדים בנקודות זמן שונות מעוקבה המושתלת במקור עם אותה האוכלוסייה של תאי Lin- transduced לגו. עצם החזה הוא מיקום מצוין ללמוד התחדשות מח עצם כתוצאה מהכינון מחדש hematopoietic המוקדם ומלא, היציבות שלה, חתך קל, שחזור, ונפח גדול. זה קריטי כדי להגיע קרוב ל 50% יעילות התמרה של תאי Lin- עבור כל וקטור FP בודד, לפני שתמשיכו עם ניסוי השתלה והדמיה, כדי שיהיה לי תאי גיוון צבע מספיק וFP-להביע לעשות הניסוי אינפורמטיבי. תמיד תהיה אזהרה כי שיבוט אחת או יותר יכול במקרה בסופו של colorprints דומה או זהה, במיוחד אם התמרה היא תאים לא יעילים ורבים אחד או שתיים בלבד הוספות. כמו כן, חשוב להיות בטוח שכל הזרקה לוריד זנב בודד נמסרה קרובה לשל מינון התא 100%.

זה מוכיח את הכדאיות של רזולוציה גבוהה 4D לחיות מחקרים דינמיים על ידי שילוב של multiphoton סריקת תהודה וזמן לשגות הדמיה confocal. זה לא רק מאפשר אפיון סטטי של שיבוטים שונים, אלא גם ניתוח של הבדלים הקינטית בין התאים המסומנים באותו צבע. יתר על כן מדגים הדמיה 4D וידאו שער של שלוש דגימות שכותרתו FPS העסקת successfully במקביל לייזרים תשא וOPO ליעילות גבוהה יותר, פוגענית פחות, חדירה עמוקה יותר של רקמת חיה, סוללת את הדרך להדמית intravital 2 פוטונים. בנוסף, קובע אפשרות יקרה כדי לעקוב אחר תאים על פני תקופות ממושכות (חודשים) להתגבר על מגבלות המבוסס על צבע נוכחי. גישה זו משתמשת בconfocal זמין מסחרי ומיקרוסקופ לייזר שני פוטונים ושיטות ניתוח תמונה אוטומטיות למשתמש אינטראקטיבי המבוססות על חבילת תוכנה זמינה באופן מסחרי המאפשרת יישום קל במתקנים מיקרוסקופי רגילים.

לבסוף, מתודולוגיה זו אינה מוגבלת לניתוח HSPCs. מערכות ביולוגיות רבות יכולות להפיק תועלת מהיכולת לפתור הסדרי spatiotemporal של אלמנטים הסלולר ומבניים clonally מורכבים באמצעות תיוג ססגוניות וconfocal והדמיה 2 פוטונים. התחדשות איבר, תגובות חיסוניות, וגידול דפוסים גרורתי יכולים להיחקר, להציע רק כמה יישומים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Production of Viruses
LeGO-Cer2 Addgene 27338 Expression of Cerulean
LeGO-G2 Addgene 25917 Expression of eGFP
LeGO-V2 Addgene 27340 Expression of Venus
LeGO-T2 Addgene 27342 Expression of tdTomato
LeGO-C2 Addgene 27339 Expression of mCherry
Calciumm Phosphate Transfection Kit Sigma CAPHOS-1KT
Tissue culture dish BD Falcon 353003
IMDM Gibco, Life Technology 12440-053
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma F4135-500ML
Pen Strep Glutamine Gibco, Life Technology 10378-016
Centrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW28 Ultracentrifuge Beckman Coulter L60
Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) Millipore SLGS033SS
Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation
ACK lysing buffer Quality Biologicals Inc. 118-156-101
Lineage Cell Depletion Kit (mouse) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-090-858
LS columns + tubes Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-306
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-407
StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) StemCell Technologies Inc  9650
Murine IL-11 CF R & D Systems Inc 418-ML-025/CF 100 µg/ml is 1,000x
Recombinant murine SCF RDI Division of Fitzgerald Industries Intl  RDI-2503 100 µg/ml is 2,000x
Recombinant murine IL-3 R & D Systems Inc 403-ML-050 20 µg/ml is 2,000x
FLT-3 Ligand Miltenyi Biotec Inc. USA 130-096-480 100 µg/ml is 1,000x
12-well plates, Costar Corning Inc. 3527
Retronectin Takara Bio Inc T100A/B Resuspend at 50 µg/ml
Protamine Sulfate Sigma P-4020 4 µg/ml is 1,000x
Confocal and Two-photon Microscopy
DMEM Lonza 12-614F
1 M Hepes Cellgro, Mediatech Inc. 25-060-CI
Glass bottom culture dish P35G-0-20-C MatTek Corporation P35G-0-20-C
Glass bottom culture dish P35G-0-14-C MatTek Corporation P35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well Thermo Scientific 155383
Coverslips 22 mm No 2 Thomas Scientific 6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope Leica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm Coherent
Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm Coherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
Imaris software version 7.6 Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

Tags

ביולוגיה של תאי גזע גיליון 90 הדמיה לגו מעקב משובט חלבוני ניאון מיקרוסקופיה confocal מיקרוסקופיה multiphoton hematopoiesis וקטורי lentiviral תאי גזע hematopoietic
<em>במשובט</em> מעקב <em>vivo</em> של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malide, D., Métais, J. Y.,… More

Malide, D., Métais, J. Y., Dunbar, C. E. In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51669, doi:10.3791/51669 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter