Summary
Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.
Abstract
Biz geliştirdik ve fare kemik iliği nakli deneysel model kullanılarak in vivo hematopozun incelemek için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hematopoetik kök hücrelerin (HSPCs) klonal takibi için metodoloji işaretleme floresan valide. Floresan proteinleri (FP) kodlayan Lentiviral vektörleri kullanılarak işaretleme Genetik kombinatoryel ileri mikroskopi görüntüleme yoluyla hücre kaderi haritalama etkin. Beş farklı FPS kodlayan vektörler: Shibuya, EGFP Venüs tdTomato ve MCherry renk işaretlenmiş hücrelerin çeşitli bir palet oluşturma, aynı zamanda HSPCs transdüksiyonu için kullanılmıştır. Konfokal / iki foton hibrid mikroskopi kullanılarak Görüntüleme aynı anda yüksek çözünürlüklü benzersiz işaretli hücrelerin değerlendirilmesi ve dokuların yapısal unsurları ile birleşik olarak da döl sağlar. Hacimsel spektral kodlu HSPC türetilmiş hücreler invasiv olmayan bir kemik iliği dahil olmak üzere çeşitli dokulara, tespit edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır (büyük alanlar üzerinde analiz BM), Transplantasyon aşağıdaki kapsamlı bir süre için. 4D video hızı multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek Canlı çalışmalar nicel bir şekilde dinamik hücresel ve klonal izleme olasılığını göstermektedir.
Introduction
Kan hücreleri olarak adlandırılan hematopoiezin üretimi, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) küçük bir nüfus tarafından muhafaza edilmektedir. Bu hücreler tüm kendini yenileme ve farklılaşma 1,2 kontrolünde rol, osteoblastlar, stromal hücreler, yağ dokusu ve vasküler yapılardan oluşan bir kompleks microenvironmental niş içinde kemik iliği (BM) içinde bulunur. Sağlam BM doğrudan gözlemlere geleneksel erişilemez olmuştur gibi, HSPC ve mikroçevresinin arasındaki etkileşimler in vivo ölçüde uncharacterized kalır. Daha önce, konfokal floresan ve yansıma mikroskobu 3 kullanılarak sağlam BM'nin 3D mimarisi görselleştirmek için bir metodoloji kurdu. Biz BM EGFP-işaretli HSPCs genişlemesi, özelliği, ancak yalnızca tek bir FP kullanımı klonal düzeyde rejenerasyonu tespiti engellemiştir. Çok yakın zamanda biz kurucu fl ifade Lentiviral Gen Ontoloji (Lego) yararlandı vektörleri aldıuorescent proteinler (FP) hücreleri verimli 4,5 işaretlemek için. 3 ya da 5 vektörlerle HSPC Co-transdüksiyon çoklu bireysel klonların HSPC izleme sağlayan, birleşik bir renk paleti çeşitli oluşturur.
İşaretli HSPC ışınlanmış farelerde BM bireysel HSPC homing ve bütünleşmesini izlemek için izin yeni görüntüleme teknolojisi ile birlikte. Lego vektörler kemik ve diğer açıkça görüntülenmesini sağlayan, (Cerulean, eGFP, Venüs, tdTomato ve mCherry itibaren) 3 veya 5 farklı aile hekimleri ile HSPC işaretlemek ve konfokal ve 2-foton mikroskopi BM zamanla kendi naklini takip etmek kullanıldı matris yapıları ve bunların mikro bileşenlerine HSPC klonların ilişkisi. HSPC lego vektörleri ile transduse edilmiş C57BL / 6 fareleri BM den soy negatif hücreleri gibi arıtıldı ve miyelo ablasyon konjenik farelerine kuyruk damarından enjeksiyon ile yeniden infüze edildi. Sternum BM doku büyük hacimli izleyerek biz erken meydana endesiteal bütünleşmesini görüntülendiBM rejenerasyon. Farklı renkli spektrumları ile hücre kümeleri kemiğe yakın ilk olarak ortaya çıktı ve zaman içinde merkezi olarak ilerledi. İlginç bir şekilde, en fazla 3 hafta sonra kemik iliği, kan akışı yoluyla oldukça yaygın HSPCs yayılması daha yakın olarak kemik iliğinde türetilen bireysel HSPCs hematopoez yayılmasını gösteren makroskopik klonal kümeleri oluşturmuştur. Daha az renk çeşitliliği çok vektörler ile hücrelerin repopulating uzun vadeli transduse güçlük göstermektedir de, geç zaman noktalarında oldu.
Buna ek olarak, HSPCs, dalakta farelerde hematopoez de sorumlu bir organ kümeleri oluşturmuştur. HPSC türetilmiş ayrı ayrı hücreler yanı sıra, timus, lenf düğümleri, dalak, karaciğer, akciğer, kalp, cilt, iskelet kas, yağ dokusu ve böbrek çözülebilirdi. 3D görüntüler dokuların en az değişimleri ile hücrelerinin dağılımını takdir nicel ve nitel olarak değerlendirilebilir. Son olarak, tasvirrezonans tarama multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek 4D canlı dinamik çalışmaların d fizibilite. Bu metodoloji doku rejenerasyonu ve patoloji çalışmada güçlü bir araç sağlayarak, onların bozulmamış 3D mimarisi Işıksal işaretlenmiş hücreler nüfus non-invaziv, yüksek çözünürlüklü, çok boyutlu hücre kaderini izlemeyi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler ev sahipliği ve Bakım ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca ele, ve bir UKAKE Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onaylı protokol alındı. Erkek B6.SJL-Ptprc (d) Pep3, (b) / 6-12 haftalık BoyJ (B6.SJL) ve C57BL / 6 fareler, sırasıyla, verici ve alıcı olarak kullanılmıştır.
Malzemeler, reaktifler ve ekipmanın bir listesi Tablo 1'de verilmektedir.
Fare HSPCs 1. Lego İletimi ve Kemik İliği Nakli
Sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) kabin (doku kültürü kaputu) aşağıda açıklanan prosedürleri uygulayın.
- Lego Vektörler Kodlama 5fps'dir Üretimi
- Lentiviral "Gen Ontoloji" (Lego) vektör plasmitler kullanın Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venüs), Lego-T2 dahil güçlü bir kurucu SFFV destekçisi, farklı bir FP kodlayan her (tdTomato), ve nazik Dr Boris Fehse (Üniversite Tıp Merkezi Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Almanya) tarafından sağlanan Lego-C2 (mCherry); Addgene 5-7 de edinilebilir şimdi.
- Lego vektörler, tohum 10 cm tabaklarda (her bir vektör için 12 tabaklar kullanın) 24 saat önce I10, ortam (% 10 FCS ve glutamin / penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş IMDM) içinde 8 ml transfeksiyondan 5 x 10 6 293T hücreleri üretmek.
- Biraz değiştirilmiş CAPHOS kiti kullanılarak öneriler Kalsiyum Fosfat ile hücrelerin transfekte:
- Her plaka karışımı 15 ug Lego vektörü, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Önceki-TAT ve 50 varlığında ul 2.5 M CaCl2 1 ug pMD2.G-VSV-G plazmidler, ve su ekleyin 500 ul toplam hacim verir.
- 2x HeBS (HEPES-Tamponlu Tuzu): 500 ul ile Çökelti, DNA plazmidler ve önce 293T hücreleri, her plaka ilave edilmeden oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir.
- Için inkübe hücreleri37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 6 saat; medyayı çıkartın ve taze kültür ortamı 6 saat sonrası transfeksiyonunu ekleyin.
- 3 gün boyunca, her gün, her plaka, lentiviral partikülleri ihtiva eden kültür süpernatantlar toplayın. Her gün şu süpernatant koleksiyon her plaka taze I10 medya ekleyebilirsiniz.
- 0.22 um gözenekler, havuz üzerinden filtre edin ve 71.900 x g ve 4 ° C'de 2 saat boyunca bir SVV28 rotor üzerinde ultra-santrifüj ile süpernatantlar konsantre edilir.
- StemSpan 1 ml'lik ortam içerisinde yeniden süspanse edilen süpernatanlan. -80 ° C'de 200 ul ve mağaza lentiviral stokları kısım.
- Lentiviral Parçacıkların titrasyonu
NIH3T3 hücreleri kullanılarak birim / ml transduse kantitasyonu yoluyla toplanan yüzer maddelerin Lego vektörü taneciklerinin titresini belirlemek. Titreler deneysel hedef için enfeksiyon (MOI) istenen rölatif çokluk sebep için gerekli olan her vektör süpernatantın hacminin hesaplanabilmesi içinhücreler.- Levha bir gün önce titrasyon I10, ortam, 2 ml oyuk (12 çukurlu plaka) başına 5 x 10 4 NIH3T3 hücreleri.
- (4 mg / ml olan 1,000x) protamin sülfat ile takviye edilmiş ortam içinde I10, vektör yüzer 5-kat seri dilüsyonları hazırlayın.
- Hücrelerden Ortamı çıkarın ve konsantre virüs 2, 0.8, 0.32 ve 0.128 ul eşdeğer yüzer seyreltilmiş 500 ul ile değiştirin.
- Iyi bir denetim sayma transdüksiyon zamanda oyuk başına mevcut olan hücre sayısını (Resim) belirler.
- 6 saat sonra, transdüksiyon, I10, ortam, 2 ml ilave edilir ve 37 ° C'de,% 5 CO2 ile 3 gün inkübe edilir.
- Her bir göze tripsin-EDTA kullanarak hücreleri hasat ve akış sitometresi aracılığı ile flüoresan hücrelerin yüzdesi (% FP) belirler.
- Resim Titre (vektörü tanecikleri / mL) =: 1 ile% 50 arasında bir% FP ile sonuçlanan her çukura (seyreltme) için elde edilen ortalama titreleri, aşağıdaki gibi titreyi hesaplamakvektör sıvı (ml) x% FP / Cilt. FP% 1 ile% 50 arasında ise, her bir seyreltme için elde edilen ortalama titreleri.
- Fare Hücre Toplama, Arıtma, Transdüksiyon ve Transplantasyon (şematik Şekil 1A gösterilmiştir Malide ark. 4 uyarlanmıştır).
- Onaylı bir prosedürle verici fareler kurban. Anterior ve posterior bacaklarda Hasat kemik iliği: iyice eklem mümkün olduğunca yakın, her kemiğin sonuna kesen kemiklerden tüm kas, ligament ve aşırı doku kaldırmak ve dışarı kemik iliği yıkayın, humerus, femur ve tibia teşrih I10, ortam ihtiva eden bir şırınga ile bir 27-0 G iğne kullanılarak kemik.
- 500 xg, 4 ° C'de 10 dakika boyunca, komple kemik iliği hücrelerini pellet haline getirmek ve 50 ml tampon ile iki kez ACK kırmızı hücreler lize edildi. 10 ml I10 medyada süspanse hücreler.
- Değiştirilmiş bir kiti Protoco göre MACS soy tükenme kiti soy negatif (Lin-) progenitör hücrelerinin saflaştırılmasıl:
- Anti-Biyotin mikro, 30 ul yerine 10 ul / 10 7 hücreleri kullanır; I2 ortamı (% 2 FCS ile takviye edilmiş IMDM) yerine tampon ile yıkama adımları.
- Biyotin-antikor kokteyli ile inkübasyon ve Anti-biotin mikro, ile inkübasyon arasındaki bir yıkama aşamasını kaydedin; ve I10 yerine, tampon ile kolon dengeye getirin.
- 10 ng / ml fare IL-3, 100 ng / ml fare IL-11, 100 ng / ml insan Flt-3 ile takviye edilmiş ortam içinde StemSpan 5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir başlangıç yoğunluğunda 48 saat süre ile kültür edilen Lin-hücrelerin ligandı, veya 50 ng / ml fare kök hücre faktörü.
- StemSpan mevcudiyetinde 4 x 10 5 hücre 12 oyuklu plakaları, her AP% 50 verim elde etmek için ekspresyon RetroNectin ile kaplanmış ve bir enfeksiyon çokluğu 6-7 (MOI) Lego'nın süpernatanları her transdüse, transfer 1 Ortam ve sitokinler yukarıda ayrıntıları ve 4 ug / ml protamin sülfat.
- Hücreleri nakletmekHer Lego vektör ayrı olarak adım 1.3.5 tarif ve iletimi aşağıdaki hücrelerin karışımı ile (Mix adlandırılır) veya aynı anda tüm 5 Lego vektör supernatantlarla hücreleri ko-transduce (Co olarak adlandırılır). , 24 saat sonra hücreleri çıkarmak sitokinler olmaksızın StemSpan medya ile bir kez yıkayın ve nakli için sitokinler olmaksızın StemSpan medyada onları tekrar süspansiyon veya konfokal mikroskopi önce ek 96 saat taze sitokinler ile medya ve kültür aktarmak ve akım sitometri.
- 1 'e tekabül fare başına hücre dozda, 100 ul bir hacim içinde, 11 Gy tek doz öncesi ışınlanmış alıcıya (6-18 saat, transplanttan önce) alıcıları olarak kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla Lin HSPCs transduse infüzyonu ile kemik iliği nakli gerçekleştirmek -4 x 10 5 Lin-hücreleri tarafından salgılanan bir iletimi için kaplama. Her deneyde, verici BM hücrelerinin transduse aynı nüfusu ile bütün bir hayvan kohort nakli.
- Transdüksiyona H in vitro karakterizasyonu içinSPC, kültür StemSpan ek bir 4-5 gün hücreler, sitokinler ile takviye edilmiş ve transdüksiyon verimliliği için akış sitometrisi ile analiz edilir, ve renk çeşitliliği için mikroskopla.
- Bireysel fareler kurban ve çeşitli zaman transplantasyon sonrası 120 güne kadar çiziyor, görüntüleme için doku ve organları almak.
- Etanol ile fare kürk sprey ve saç yayılmasını önlemek ventral tarafta cilt insizyon.
- Standart prosedürler dalak popliteal lenf düğümleri, akciğer, kalp, deri, yağ dokusu, iskelet kası, böbrek, karaciğer, hem de calvaria erişmek için kafasına göre inceleyin ve tüketim.
- Seçenek olarak ise, calvaria kullanımı veya canlı hayvanda deri ve lenf düğümleri gibi zaman 2,8,9 yüzeysel organ veya görüntü üzerinde tekrar tekrar canlı görüntüleme için, kemik kurma penceresi.
- 50-100 35 mm numarası 0 cam kapak kültür yemekleri tek tek organlara yerleştirin56, adım 2.5 de tarif edildiği gibi, kesit tespit ya da daha fazla bir işleme tabi tutulmadan, onları etkilemeden onlara görüntülenmesi için PBS.
- Volumetrik görüntüleme için, soğuk PBS kullanıma kadar organları tutun. Zaman atlamalı görüntüleme için, 20 mM HEPES ihtiva eden ve% 10 FBS, 37 ° C de DMEM organ görüntüleme hemen devam
- Bireysel fareler kurban ve çeşitli zaman transplantasyon sonrası 120 güne kadar çiziyor, görüntüleme için doku ve organları almak.
2. Eşodaklı ve İki foton Mikroskopi ve Görüntü Analizi
- Multi-line Argon, diyot 561 nm, HeNe 594 nm ve HeNe 633 nm görülebilir lazer ile donatılmış bir Leica SP5 beş kanal konfokal ve multiphoton sistemi kullanılarak mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. 680 dağılım düzeltme ile 1.080 nm uyarma için Sapphire (Ti-Sa) lazer, ayarlanabilir: 2-foton modunda, bir darbeli femtosaniye Ti kullanın. T ile arka arkaya ya da aynı anda, 1,030-1,300 nm kadarıyla çıkış dalga boyu aralığını genişletmek için kırmızı-kaydırılmış fps (tdTomato ve mCherry), bir optik parametrik osilatör (OPO) lazer içeren deneylerinde kullanılmakTi-Sa lazer diye.
- -IRAPO-L Hcx 25X / 0.95 NA su daldırma hedefi (WD = 2,5 mm), bir HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA kuru objektif (WD = 0.6 mm), ya da HC-PL-IRAPO 40X bir kullanarak görüntü değişik dokular /1.1 NA su daldırma objektif (WD = 0.6 mm).
- Kontrolün yanı sıra tek bir AP Lego vektörüyle transdüksiyona BM hücrelerinden görünür spektrum 5 nm bant genişliklerinde yayılan ışığın lambda yığınları (xyλ) toplama konfokal floresan spektrumu elde edilir, BM nakledilmiş değildir.
- Leica LAS-AF v2.4.1 yazılımı ile işlem görüntüler tüm 5 hekimi referans spektrumları yanı otofloresanm olarak (Şekil 2A) oluşturmak için. Bireysel AP spektrumları ve floresans parlaklık farkı kullanılarak aşağıdaki gibi 5 ardışık görüntü kanalları da Cerulean (% 79), Venüs (156%), tdTomato (283%) ve mCherry (% 47) (EGFP% 'si olarak ifade edilmiştir): Shibuya (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venüs (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm) ve MCherry (594 / 618-670 nm) (
- Her bir FP ile transdükte edilmiş hücrelerin geri kalanı (Şekil 2C) için sadece karşılık gelen kanal görünür ve mevcut olmadığı gibi, doğru FP ayırma doğrulama. Buna ek olarak, bu çok-kanallı tanımlandığı yaklaşım sonraki renk analizi ve klonal takip edilmesine olanak sağlar ve spektral görüntüleme yöntemlerine göre toplama zamanı azaltma avantajına sahip olan bir tek-5 kanal "COLORPRINT" oluşturur.
- Leica LAS-AF v2.4.1 yazılımı ile işlem görüntüler tüm 5 hekimi referans spektrumları yanı otofloresanm olarak (Şekil 2A) oluşturmak için. Bireysel AP spektrumları ve floresans parlaklık farkı kullanılarak aşağıdaki gibi 5 ardışık görüntü kanalları da Cerulean (% 79), Venüs (156%), tdTomato (283%) ve mCherry (% 47) (EGFP% 'si olarak ifade edilmiştir): Shibuya (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venüs (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm) ve MCherry (594 / 618-670 nm) (
- , 2-foton modunda, dört kanalları olmayan descanned dedektörü (NDD) olarak topladığımız özel çift renkli aynalar yüksek verimlilik ve ayrı ayrı floresan emisyon aşağıda: 465 nm renkli aynaya ardından 568 nm'de bir dikroik ayna, ardından Sonohisterografi veya otofloresansı ve Cerulean, tdTomato veya mCherry için EGFP veya Venüs için 525/40 nm emisyon filtresi ve 648 nm dikroik ayna ve 620/60 nm emisyon filtresi için 452/45 nm emisyon filtresi.
- İki foton mikroskopi i yapısal bilgiler ortayantrinsic kontrast (780 nm'de uyarılmış) elastin, NADH, doku otofloresanm (yukarıda anlatıldığı gibi) görüntüleme ve ikinci harmonik arka dağılmış toplanan 920 nm ya da 860 nm (uyarılmış kemik ve fibriler kolajen sinyali (SHG) üretilir yönü) 10,11.
- 3D volume rendering için, kemik iliği ve diğer dokulara boyunca derinliklerinde bir dizi (150-300 mikron) göre 5 mikron aralıklarla z ekseni boyunca xyz görüntülerin dizi (tipik olarak 1 x 1 x 4 mikron 3 Voksel boyutu) toplamak, yazılımın kiremit işlevini kullanarak büyük bölgeler otomatik olarak tüm bir sternum fossa, yaklaşık 2.5 x 1.2 mm 2 (xy) ve 300 mikron (z) (Şekil 2D-2E) ve Sinema 1 oluşan dikişli birimleri üretmek üzerine.
- Görüntü 2, 8, kesit olmadan kafatası yoluyla doğrudan ilik kalvarial.
- Sonra sagital düzlemde (İkiye bölme) ve birlikte Bölüm sternumçapraz kesim yüz 3,4,12 2 ile sternum fosse ve görüntü arasındaki birleşme yerinde (Takaku uyarlanmıştır Şekil 1B ve diğerleri genel 3).
- 4D zaman atlamalı görüntüleme için 50-100 ul, 35 mm numarası 0 coverglass kültür tabakları üzerine, taze kesilmiş kesilmemiş popliteal lenf düğümleri, dalak, akciğer, veya kalvaryal kemik örnekleri yer 37 ° C 'de 20 mM HEPES içeren DMEM,% 10 FBS ve ~ (z-yığınları alarak konfokal uyarma (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) ve Leica rezonans tarayıcı (8000 Hz / sn) ile birlikte 2-foton Ti-Sa uyarma (860 nm) kullanın kadar 1 saat boyunca 20 saniye aralıklarla 80 um).
- Eşzamanlı üç renkli 2P görüntüleme kullanımı Ti-Sa için 860 at ayarlanmış nm anda OPO (tdTomato için 1,130 nm ayarlı veya 1.140 nm mCherry) lazer ile (Film 2).
- 3D Hacmi ve 4D zaman dizilerinin İmar ve Analizi
- Imaris x64 yazılım bil kullanınDaha önce 3,4 açıklandığı gibi, sürüm 7.6, veya hacim-render (3D) içine ham görüntüleri kiremitli-yığınları dönüştürmek için alternatif yazılım paketleri, kemik iliği ve farklı doku ve 3D-rotasyon filmleri olarak dışa içten floresan hücrelerin veriler (Film 1) adım adım örnek:
- Imaris yılında, z-yığın görüntü açın; Seçin 3D ses görselleştirme görüntülemek için "Aşmak".
- 360 ° etrafında sesini açmak için "gidin" kullanın.
- Bir animasyon oluşturmak için "Animasyon" seçeneğini seçin; Seçilen manzarası, zoom, hacim rotasyonlar eklemek için anahtar kare kullanın; , Film önizleme gerektiği gibi düzenleyin ve istediğiniz bir film formatta dosyayı kaydetmek (örn: avi, mov).
- 3D cep ve klon frekansı, Kutup, boyutları ve dağıtım kantitatif değerlendirilmesi, ileri bir işlem için mesafe ölç performans MATLAB uygulamaları entegre Imaris XT modüllerini kullanarak z yığınları(Mesafe, bir transformasyon algoritmasını kullanarak) ölçümler ve kümeler analizi, daha önce tarif edilen 3,4. Imaris x64 yazılımı ile hacim render dört boyutlu (4D) filmlerin içine zamanla görüntü yığınlarının dizileri Transform ve otoregresif hareket algoritmaları kullanarak üç boyutlu hücre motilitesi yarıotomatize takibi için yer ve yüzey analiz kullanmak.
- Aşağıdaki gibi hücrelerin çokbantlı analizini gerçekleştirmek: çok renkli yeni bir kanal içine Imaris XT kanal aritmetik aracılığıyla tüm 5 kanal ekleyerek etiketli noktalar ayıklamak; Bütün noktalar (hücreler) 5 bileşen kanalların her biri ortalama yoğunluğu floresan belirler. Tek bir hücrenin her FP (Şekil 2E grafik) nispi% yani eşsiz "COLORPRINT" gösteren grafikler çizmek Excel yazılımı değerleri ihracat. Doku sürüklenme için belirlenen verileri düzeltmek ve hücre hız ve deplasman zamanla, parça uzunlukları, yolları ve mesafeleri hesaplamak; Excel sof ihracat değerlerigrafikler çizmek için tware. Adobe Photoshop CSS 5 yazılımı ile kompozit rakamları birleştirin.
- Imaris x64 yazılım bil kullanınDaha önce 3,4 açıklandığı gibi, sürüm 7.6, veya hacim-render (3D) içine ham görüntüleri kiremitli-yığınları dönüştürmek için alternatif yazılım paketleri, kemik iliği ve farklı doku ve 3D-rotasyon filmleri olarak dışa içten floresan hücrelerin veriler (Film 1) adım adım örnek:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm montaj 3D konfokal sternum kemik iliği zaman tabii / 2-foton mikroskopi rekonstrüksiyon olağanüstü özelliklere sahip bir desen uyumunu ve nakledilen ko-5fps'dir genişlemesini ortaya: klon açıkça belirlenen, homojen başlangıçta geniş renk paleti ve ilerleme ile işaretlenmiş çıktı zamanla tercihen çoğunlukla tek renk hücreleri içeren. Konfokal mikroskopi kurulum ve sternal kemik iliği görüntüleme 5fps'dir-işaretli HSPC temsili örnekleri, Şekil 2 ve Film 1 ve 2'de gösterilmiştir.
Sağlam dokuların Tüm montaj 3D konfokal / 2-foton mikroskopi rekonstrüksiyon renk kaderi canlı dokularda, uzun süre BM-türetilen hücreler işaretli iz olasılığını göstermektedir. Transplantasyon sonrası hematopoyitik ve non-hematopoetik organlarda kemik iliği kökenli hücrelerden temsili örnekleri Fi gösterilmiştir Güre 3.
Deneysel prosedürün 1. Genel Bakış Şekil. A) şematik bir adım Lin BM hücrelerinin izole edilmesini görüntülemektedir Lego'nın FP renk seçeneğiyle çok çeşitli kodlayan vektörler ve içine miyelo-ablasyon farelerin kalıt aktarımlı hücrelerin reinfüzyon (kemik iliği nakli). B) Kemik iliği ile transdüksiyon (sternum kalvaryal ), yanı sıra çeşitli organ / doku naklinden sonra farklı zaman noktalarında konfokal ve iki-fotonlu mikroskopisi ile incelendi. Panel A, Malide ve diğ. 4, Şekil 1 'den uyarlanmıştır ve Panel B, et al Takaku 3, Şekil 1' den uyarlanmıştır.
2highres.jpg "width =" 600 "/>
Görüntüleme için Şekil 2. Konfokal mikroskopi kurulum ve temsili bir örneği, kemik iliğinde HSPC 5fps'dir-oldu. A) Spektral (xyλ) görüntüleme, her sarı yeşil mavi (Cerulean ile yalancı normalize histogramlarda gösterilen FP), (EGFP), (Venüs), kırmızı (tdTomato) ve kırmızı (mCherry) için referans emisyon spektrumları kaydetmek için kullanılır: heyecanlı karşılaştırıldığında 594 `/flj- (katı kırmızı çizgi) ile 561` /flj- (kesikli kırmızı çizgi) dalga boyu B) görüntü sırayla emisyona ayarlanmış Beş kanalları:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venüs ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) ve MCherry (618-670 nm). A ve B panelleri Malide et al, Şekil 1 'den uyarlanmıştır. Bireysel AP vektörleri ile dönüştürülmüş olan nakledilen farelerden alınan sternum DM'nin 4 ° C) Görüntüleme. FP sadece uygun kanal görüntülü gelen vektör ile kalıt aktarımlı hücrelerde görünürfrekanslarını ve diğerleri (çapraz konuşma). D, E) ve transplant Aşı eş 5FP genişleme devamsızlık in vivo olarak kemik iliği hücreleri oldu. 4 gün nakil sonrası (d) en çok çeşitli renk işaretlenmiş hücre kümeleri tercihen ikiye fossa arasındaki birleşme yerinin bitişiğinde bulunan kemik kenar (beyaz SHG) görünür yakınlığı idi. 30. günde (D) benzersiz bir renk (yeşil - sarı) oluşan büyük bir klon birleştirilmiş olduğu gibi, münferit kanalların görüntüleri de gösterildiği gibi bütün fossanın işgal şekilde genişlemiştir. FP içerik analizi FP EGFP ve Venüs varyantları 2 ile işaretleme homojen gösterir.
Şekil transplantasyonundan sonra hematopoietik olan ve olmayan hematopoietik organlarda kemik iliği kökenli hücrelerden 3. örnekler. Çeşitli TISsues ve organlar 150-200 um ve büyük yüzey alanlarının derinliklerine sağlam görüntülendi, hesaplama dikişli ve 120 gün nakil sonrası çoğunlukla sarı (Venüs işaretlenmiş dağınık hücreleri gösterir) ve en gölge rekonstrüksiyon. A) Popliteal lenf düğümü olarak 3D render çevresel olarak kollajen lifleri (beyaz SHG) b.) ile çevrili kırmızı (MCherry) Benzer şekilde, aynı zamanda dalak, küçük gruplar ve flüoresan karaciğer hücreleri kolajen liflerin ağ. ° C) ile iç içe çeşitli renklerde daha çok dağınık hücreleri görüntüler çeşitli renklerde Yıldızsı hücrelerin, ya da makrofajlar (Kupffer hücreleri) düşündüren morfolojisi, görüldü farklı renk ve morfolojilerin dermal yan floresan hücrelerden görüntülü bir cilt flep hepatik lobüler yapılar. D) belirler (SHG beyaz) kolajen lifleri ağı boyunca hizalanmış edildi Langerhans veya dendritik-benzeri kimliğini öne büyüklüğü ve morfolojisi ile en LYIelastin lifleri altında ng (780 nm otofloresansı, beyaz) ve kolajen boyunca (920 nm SHG, beyaz) makrofaj-benzeri morfoloji menşeli çok sayıda tek tek büyük floresan hücreler epikardiyal taraftan bakıldığında kalbinde kas lifleri ve saç köklerinin. e) görülen farklı renklere göre birden fazla klonlar görünür ve yüzeysel de serpiştirilmiş derin (780 nm) kendi içsel iki foton otofloresansı tarafından görüntülenmiştir kardiyomiyositlerin (beyaz) arasındadır. Hiçbir FP floresan kardiyomiyositler gözlendi. Aynı renkteki Yakın hücreleri (CE) renklerin çeşitli bir palet ile çok sayıda floresan hücreler her derinlikte kollajen lifleri (SHG) dantel-benzeri yapıya saçıldıkları Akciğerde yerinde çoğalması ve kısa mesafeli göç. F) önermek dendritik hücre, makrofaj ve tip 2 pnömosit kimlikleri öne değişken morfolojilerindeki seviyeleri.
Film 1. 3D yenidenrenk çok çeşitli işaretli hücrelerin 4 gün post-transplant Co: 5fps'dir. kümeyle sternum BM yapımında tercihen ikisi fossa arasındaki bağlantı bitişik olarak bulunur (beyaz SHG) kemik kenarına yakın görünür. burada tıklayın Bu filmi görmek için.
Film 2. 4D time lapse sternum BM iki foton ve günlük 39 transplantasyon sonrası Co 3fps (Cerulean - beyaz, Venüs - sarı, tdTomato - eflatun) en OPO mikroskobu kemik (beyaz Sonohisterografi). Sarı ya da son derece hareketli bireysel miyeloid progenitör hücrelerinin aksine kemiğe bitişik sarı-kırmızı kombinasyonu işaretlenmiş birçok statik klonlar unutmayın. Bu filmi görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz canlı dokularda hacimsel ve dinamik görüntüleme elde etmek için tandem confocal ve 2-foton mikroskopi ile 5FP kodlayan LEGO vektörler ve görüntüleme ile işaretleme kombinasyonal tarafından oluşturulan büyük çeşitliliğini birleştirerek, burada son zamanlarda klonal hücre izleme için tasarlanmış güçlü bir metodoloji ayrıntılarını anlatacağız. Bu 5 "farklı" 8-bit kanallarda confocal spektral kimliğini kaydederek işaretleme FP-tabanlı renk kullanımı genişletilmiş. Böylece her bir hücre içinde Cerulean, EGFP Venüs, tdTomato, mCherry nispi oranı klonal döl tanımlanması için tek bir "COLORPRINT" oluşturur. 5fps'dir tarafından çok renkli etiketleme hücreleri veya yoğun doku örneklerinde aynı tip hücrelerin grubunda dağılımı, kişileri, kiremitli düzenlemeler ve rekabetçi etkileşimleri inceleyerek özellikle yararlı gördü daha fazla çeşitlilik ile etiket paleti artırır. Çeşitli dokularda içsel yapısal özellikleri 2-foton uyarılması ile kombine veorganları, biz tespit ve fiziksel kesit için gerek kalmadan kendi doğal ortamında renk işaretli klonal hücrelerin izleyebilirsiniz. Bireysel atalarıdır türetilen yavru hücre farklılaşması ve çoğalması rağmen kendine has bir "renk baskı" korumak gösteri aynı gösteren bireysel in vitro koloniler (CFU) bulunan farklılaşmış hücrelerin yüzlerce, bizim yayınlanan çalışmada gösterildi "COLORPRINT."
Bu yaklaşım konfokal mikroskobu ile optik kesit ile birlikte yüksek çözünürlüklü görüntüleme çözülmesi tek hücrenin faydalarını birleştirir. Çok büyük x - y (mm 2) bozulmamış yoğun doku hacminin bölgeler kiremitli-görüntüler oluştururken tarafından muayene edilebilir. Optik bölümleri bu yüksek çözünürlüklü görüntüler, ~ içeren, (otomatik ve "on-the-fly") büyük bir karmaşıklık tam 3D hacimleri ~ 30 mikron derinliklerde hesaplama yeniden hücrelerin 20-30 katmanları kullanılabilirvasküler, kemik ve kollajen yapıları. 3D rekonstrüksiyon biyolojik ilgi morfometrik non-invaziv kantitatif analiz için kullanılabilir. Doku (sternum biri fossalar) ~ 1 mm 3, bu nedenle deney başına görüntüleme fazla 1 fareyi başına tavsiye başına işaret etmek önemli bir uyarı büyük hacimli / yüksek çözünürlüklü görüntüleme örneği 1 saat, zaman alıcı olduğunu gün kemik iliği gibi farklı dokular ayrıntılı olarak incelenecek gerektiğinde.
Tekrar tekrar zaman içinde aynı fare sternal kemik iliği görüntü etmek teknik olarak mümkün olmakla birlikte, değerli bilgiler orijinal Lego transdüksiyona Lin hücrelerin aynı nüfusu ile nakledilen bir grup farklı zaman noktalarında bir fareyi incelenmesiyle elde edilebilir. Sternum nedeniyle erken ve eksiksiz hematopoetik sulandırma, istikrar, kolay kesit, tekrarlanabilirlik ve büyük hacimli kemik iliği rejenerasyon çalışması için mükemmel bir yerdir. Bu deneme için yeterli bilgi renk çeşitliliği ve AP-ifade eden hücrelere sahip olmaları amacıyla bir transplantasyon ve görüntüleme deney başlamadan önce, her bir vektör için, Lin-AP hücrelerin% 50 transdüksiyon verimliliği yakın ulaşmak için çok önemlidir. Her zaman birden fazla klon tesadüfen iletimi verimsiz ve birçok hücreler sadece bir ya da iki eklemeleri var, özellikle eğer, benzer veya aynı colorprints ile sona erebilir bir uyarı olacaktır. Her bireyin kuyruk ven enjeksiyon hücre dozun% 100'e yakın teslim emin olmak da önemlidir.
Bu rezonans tarama multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek dinamik çalışmaları canlı 4D yüksek çözünürlüklü fizibilitesini kanıtlıyor. Statik çeşitli klonların karakterizasyonu ama aynı zamanda aynı renk ile işaretlenmiş hücreleri arasında kinetik farklılıkların analizi değil sadece izin verir. Ayrıca Herhangi yüzeylerin kullanan üç FP etiketli örneklerin video hızı 4D görüntüleme gösteriyorccessfully 2-foton Intravital görüntüleme için önünü daha az zararlı daha yüksek verim, canlı doku derin penetrasyonu, tandem TISA ve OPO lazerler. Buna ek olarak, mevcut boya bazlı olumsuzlukları ortadan kaldırmak için uzun süreli (ay) hücreleri izlemek için değerli bir seçenek oluşturur. Bu yaklaşım piyasada mevcut konfokal ve iki-foton lazer mikroskobu ve her zamanki mikroskopi tesislerinde kolay uygulanmasını sağlayan piyasada satılan bir yazılım paketine dayalı otomatik kullanıcı etkileşimli görüntü analizi yöntemleri kullanır.
Son olarak, bu yöntem HSPCs bir analiz edilmesi ile sınırlı değildir. Birçok biyolojik sistemler çok renkli etiketleme ve confocal ve 2-foton görüntüleme ile klonal kompleks hücresel ve yapısal elemanların zamanmekansal düzenlemeleri çözmek için yeteneği yararlanabilir. Organ yenilenmesi, bağışıklık CEVAPLAR ve tümörün metastatik desenleri, sadece birkaç potansiyel uygulamaları önermek, sorguya olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
