Summary
Комбинаторные 5 флуоресцентные белки маркировки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток позволяет в естественных условиях клонального отслеживания через конфокальной и двухфотонной микроскопии, обеспечивая понимание архитектуры кроветворной костного мозга во время регенерации. Этот метод позволяет неинвазивным отображение судьба спектрально-кодированных HSPCs-клеток, полученных в здоровых тканей для длительные периоды времени после трансплантации.
Abstract
Мы разработаны и утверждены флуоресцентной маркировки методологию клонального отслеживания гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) с высоким пространственным и временным разрешением на учебу в естественных условиях кроветворения помощью пересадки костного мозга экспериментальную модель мышиной кости. Генетическая комбинаторной маркировки с помощью лентивирусные векторы, кодирующие флуоресцентные белки (FPS) включен отображение клеточных судеб с помощью передовых изображений микроскопии. Векторы, кодирующие пять различных FPS: лазурный, EGFP, Венера, tdTomato, и mCherry были использованы для одновременно преобразовывать HSPCs, создавая разнообразный палитру цветных отмечены клеток. Изображений с помощью конфокальной / двухфотонного гибридный микроскопии обеспечивает одновременную оценку с высоким разрешением однозначно меченых клеток и их потомков в сочетании с структурных компонентов тканей. Объемный анализ на больших площадях, показывают, что спектрально кодированные HSPC-производные клетки могут быть обнаружены неинвазивно в различных здоровых тканей, в том числе костного мозга (BM), Для длительные периоды времени после трансплантации. Текущие исследования, сочетающие видео-курс многофотонное и конфокальной микроскопии покадровой в 4D показывают возможность динамического сотовой и клонального слежения в количественном выражении.
Introduction
Производство клеток крови, называемых кроветворения, поддерживается небольшой популяции гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs). Эти клетки находятся в костном мозге (ВМ) в комплексной микросреды нише, состоящей из остеобластов, стромальных клеток жировой ткани, и сосудистых структур, все участвуют в контроле самообновления и дифференцировки 1,2. Как нетронутыми BM была традиционно недоступны для прямых наблюдений, взаимодействия между HSPC и их микросреды во многом остается охарактеризованный в естественных условиях. Ранее мы установили методологию для визуализации 3D архитектуру неповрежденной BM с помощью конфокальной флуоресцентной и отражения микроскопии 3. Мы характеризуется расширение EGFP-отмеченных HSPCs в БМ, но использование только одного FP исключается анализ регенерации на клональной уровне. Совсем недавно мы использовали в своих интересах Лентивирусов Джин Онтология (LEGO) векторы конструктивно выражать этлюминесцентной белки (FPS) для эффективного отметить ячейки 4,5. Co-трансдукция HSPC с 3 или 5 векторов порождает разнообразную палитру комбинаторных цветах, что позволяет отслеживать несколько отдельных клонов HSPC.
Помечено HSPC в сочетании с новой технологией обработки изображений разрешено проследить индивидуальный HSPC самонаведения и приживление в BM облученных мышей. Lego векторы использовали для обозначения HSPC с 3 или 5 различных кадров в секунду (от Cerulean, EGFP, Венера, tdTomato и mCherry) и следовать их приживление в течение долгого времени на БР по конфокальной и 2-фотонной микроскопии, позволяя четкую визуализацию костей и другие матричные структуры, а отношение HSPC клонов с компонентами их микросреды. HSPC очищали, как линии передачи отрицательных клеток от мышей C57BL / 6 Б.М., трансдуцированных LEGO векторов, и реинфузии путем инъекции в хвостовую вену в миело-абляции конгенных мышах. Контролируя большие объемы грудины BM ткани мы визуализировали эндостальные приживление происходящих в началеРегенерации BM. Сотовые кластеры с разнообразной спектров цвета появились первоначально в непосредственной близости от кости и прогрессировала централизованно в течение долгого времени. Интересно, что после более чем 3 недели мозг состоял из макроскопических клоновых кластеров, предполагая распространение кроветворения, полученных от отдельных HSPCs непрерывно в костном мозге, а не широкого распространения HSPCs через кровоток. Был менее цвет разнообразие на поздних временных точках, предлагая трудности в трансдуцирующих долгосрочные заселения клетки с несколькими векторами.
Кроме того, HSPCs формируется кластеров в селезенке, орган также отвечает за кроветворение у мышей. HPSC полученных отдельные клетки могут быть решены в тимусе, лимфатических узлов, селезенки, печени, легких, сердца, кожи, скелетных мышцах, жировой ткани и почек, а также. 3D-изображения можно оценить качественно и количественно оценить распределение клеток с минимальными возмущениями тканях. Наконец, мы проиллюстрируемд целесообразность живых динамических исследований в 4D путем объединения резонансную многофотонное сканирования и конфокальной микроскопии покадровой. Эта методика позволяет неинвазивным высокого разрешения, многомерная судьбы клеток трассировку спектрально отмеченных населения клеток в их нетронутыми 3D архитектуры, что является мощным инструментом в изучении регенерации тканей и патологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все мыши были размещены и обрабатываются в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных Институтов Здоровья, и поступил в НИСЛК по уходу за животными и использование Комитет-утвержденным протоколом. Женский B6.SJL-Ptprc (г) Pep3 (б) / BoyJ (B6.SJL) и мыши C57BL / 6, 6-12 недель, были использованы в качестве донора и реципиента, соответственно.
Перечень материалов, реагентов и оборудования представлены в таблице 1.
1 Lego Трансдукция Mouse HSPCs и трансплантации костного мозга
Выполните процедуры, описанные ниже в сертификационный уровень биобезопасности 2 (BSL-2) кабинет (капот культуры ткани).
- Производство Lego векторов, кодирующих 5fps
- Используйте лентивирусные "Джин Онтология" (Lego) векторные плазмиды, каждый из которых кодирует другой FP от сильного конститутивного SFFV промоутера, в том числе Lego-Cer2 (Лазурная), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Венера), Lego-T2 (тdTomato), и LEGO-C2 (mCherry), любезно предоставленные доктором Борисом Fehse (University Medical Center Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия); теперь доступна также Addgene 5-7.
- Для получения LEGO векторы, семян 5 × 10 6 клеток 293Т в 10 см чашки (используют 12 блюда для каждого вектора) 24 часа до трансфекции в 8 мл I10 информации (IMDM с добавлением 10% FCS и глутамин / пенициллин / стрептомицин).
- Трансфекции клеток с фосфатом кальция, используя слегка измененные рекомендации CAPHOS комплекта:
- Для каждого пластина смеси 15 мкг LEGO вектора, 12 мкг pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 мкг пред-ТАТ, и 1 мкг pMD2.G-VSV-G плазмид в присутствии 50 мкл 2,5 М CaCl 2, и добавить воды, чтобы получая 500 мкл общего объема.
- Осадить ДНК плазмиды с 500 мкл 2x HeBS (HEPES-буферным солевым раствором) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре перед добавлением к каждой пластине клеток 293Т.
- Инкубируйте клетки для6 ч в 37 ° C 5% CO 2 инкубаторе; удалить медиа и добавьте свежий культура СМИ 6 ч после трансфекции.
- Сбор культуральных супернатантов, содержащих лентивирусов частиц от каждой пластины, ежедневно, в течение 3 дней. Каждый день после сбора супернатант добавить свежий I10 СМИ на каждую пластину.
- Фильтр по 0,22 мкм поры, бассейн и сосредоточиться супернатантами ультрацентрифугированием на роторе SW28 течение 2 ч при 71 900 мкг в и 4 ° С.
- Ресуспендируют супернатантов в 1 мл StemSpan массовой информации. Алиготе лентивирусные запасы в 200 мкл и хранить при температуре -80 ° С.
- Титрование лентивирусов частиц
Определить титр векторных частиц LEGO в собранных супернатантах через количественного трансдуцирующих ед / мл, используя клеток NIH3T3. Титры позволяют расчет объема каждого вектора супернатанта необходимого, приведет к желаемой относительной множественности заражения (МВД) для экспериментальной целиклетки.- Пластина 5 х 10 4 NIH3T3 клеток на лунку (12-луночного планшета) в 2 мл I10 СМИ за день до титрования.
- Подготовка 5-кратные серийные разведения векторных супернатантов в I10 среде с сульфатом протамина (4 мг / мл 1,000x).
- Извлеките носитель из клеток, и заменить 500 мкл надосадочной разведений, содержащих эквивалент 2, 0,8, 0,32, и 0,128 мкл концентрированной вируса.
- Определить количество (NO) из клеток, присутствующих на лунку в момент трансдукции, считая один контрольный колодец.
- 6 ч после трансдукции, добавить 2 мл I10 СМИ и инкубировать в течение 3 дней при 37 ° С, 5% СО 2.
- Сбора клеток из каждой лунки с помощью трипсин-EDTA, и определить процент флуоресцирующих клеток (% FP) через проточной цитометрии.
- Рассчитать титр как следуем, усреднения титры, полученные для каждого а (разбавления), в результате% FP между 1 и 50%: титр (вектор частицы / мл) = Нетх% FP / Объем вектора супернатанта (мл). Среднее значение на основании титры, полученные для каждого разведения, если ФП% находится в диапазоне от 1 до 50%.
- Мышь сотовый Сбор, очистка, трансдукции и трансплантации (схематически показано на фиг.1А адаптированы из Malide и соавт. 4).
- Жертвоприношение мышей-доноров по утвержденной процедуре. Урожай костного мозга от передней и задней конечностей: рассекать плечевые кости, бедра и большеберцовые кости, тщательно удалить мышцы, связки и лишнюю ткань от костей, нарезать поперек конца каждой кости как можно ближе к суставу, и промойте костный мозг из кость, используя 27-0 G иглу на шприц, содержащий i10 СМИ.
- Гранул целые клетки костного мозга в течение 10 мин при 500 х г, 4 ° С и лизировать красные клетки дважды с 50 мл буфера ACK. Ресуспендируют клеток в 10 мл I10 СМИ.
- Очищают линия отрицательные (линейно) клеток-предшественников с обедненной линия комплекте MACS в соответствии с модифицированным комплекте Protocoл:
- Используйте 30 мкл анти-биотин Microbeads вместо 10 мкл / 10 7 клеток; завершить этапы промывки I2 информации (IMDM с добавлением 2% FCS) вместо буфера.
- Вставьте один этап промывки между инкубации с биотин-антитело Коктейль и инкубации с анти-биотин Microbeads; и уравновесить колонку с I10 вместо буфера.
- Культура Lin- клетки в течение 48 ч при начальной плотности 5 × 10 5 клеток / мл в StemSpan среде с добавлением 10 нг / мл мышиного IL-3, 100 нг / мл мышиного IL-11, 100 нг / мл человеческого Flt-3 лигандом, и 50 нг / мл мышиного фактора стволовых клеток.
- Передача от 1 до 4 х 10 5 клеток на 12-луночных планшетах, покрытых RetroNectin и преобразовывать с LEGO супернатантов, каждый при множественности инфекции (MOI) 6-7 для достижения 50% эффективности экспрессии для каждого FP, в присутствии StemSpan СМИ и цитокины описано выше и 4 мкг / мл протамина сульфат.
- Преобразовывать клеткикаждый вектор с LEGO отдельности, как описано в шаге 1.3.5 и смешать клетки следующие трансдукции (называется Mix) или со-трансдукции клеток со всеми 5 LEGO векторных супернатантов одновременно (называемый CO). Удалить клетки 24 часа спустя, мыть один раз с StemSpan СМИ без цитокинов, и ресуспендируйте их в StemSpan СМИ без цитокинов для трансплантации, или перенести их на свежий СМИ с цитокинов и культуры для дополнительного 96 часов до конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.
- Выполнение трансплантации костного мозга путем инфузии трансдуцированных линейно HSPCs с помощью инъекции в хвостовую вену в 11 Гр однократной дозы предварительно облученных реципиентов (6-18 ч до трансплантации) получателей, в объеме 100 мкл, при дозе клеток на мышь, соответствующей 1 -4 х 10 5 Lin- клетки изначально покрытием для трансдукции. В каждом эксперименте, пересадить всю когорту животных с той же популяции трансдуцировали доноров BM клеток.
- Для характеристики в пробирке трансдуцированные HSPCs, культура клетки для еще 4-5 дней в StemSpan дополнен цитокинов и анализировать с помощью проточной цитометрии для эффективности трансдукции, и с помощью микроскопии для цветной разнообразия.
- Жертвоприношение отдельных мышей и получить тканей и органов для работы с изображениями, в различные моменты времени до 120 дней после трансплантации.
- Спрей с этанолом мех мыши и надрезать кожу на брюшной стороне, избегая распространения волос.
- Рассеките и акцизные в соответствии со стандартными процедурами, селезенки, подколенных лимфатических узлов, легких, сердца, кожи, жировой ткани, скелетных мышцах, печени, почек, а также головки доступа к свода черепа.
- Кроме того, использование свода черепа или настроить окно кости для живого изображения неоднократно в течение долгого времени 2,8,9 или изображений поверхностных органов, таких как кожи и лимфатических узлов в живого животного.
- Место отдельных органов в 35 мм число 0 защитное стекло чашки для культивирования в 50-10056; л PBS для визуализации их нетронутыми без секционирования, записи или дальнейшей обработки, как описано на стадии 2.5.
- Для объемной визуализации, не держите органы в холодной PBS до использования. Для покадровой обработки изображений немедленно перейти к визуализации органов в DMEM, 10% FBS, содержащей 20 мМ HEPES при 37 ° C
- Жертвоприношение отдельных мышей и получить тканей и органов для работы с изображениями, в различные моменты времени до 120 дней после трансплантации.
2 конфокальной и Двухфотонное микроскопии и анализа изображений
- Выполните микроскопии изображений, используя Leica SP5 пять каналов конфокальной и многофотонную систему, оснащенную многострочного аргона, диод 561 нм, HeNe 594 нм, и He-Ne 633 нм лазеров видимого диапазона. Использование в режиме 2-фотона, импульсного фемтосекундного Ti: Sapphire (Ti-Сб) лазера, перестраиваемого для возбуждения от 680 до 1080 нм с коррекцией дисперсии. Использование в экспериментах с красным смещением кадров в секунду (tdTomato и mCherry), ПГС (OPO) лазер расширить диапазон длин волн выходного насколько 1,030-1,300 нм, последовательно или одновременно с тон Ti-Sa лазер.
- Image различные ткани с использованием НСХ-IRAPO-L 25X / 0,95 NA вода погружения цели (WD = 2.5 мм), HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA сухой объективную (WD = 0,6 мм), или УВ-PL-IRAPO 40X /1.1 Н.А. погружением в воду цель (WD = 0,6 мм).
- Получить конфокальной флуоресцентной спектры сбор лямбда стеки (xyλ) излучаемого света в 5 нм полосы пропускания видимого спектра от БМ трансдуцированных одном векторе FP Lego, а также контроля, не подвергшихся трансплантации BM.
- Изображения процесса с v2.4.1 программного обеспечения Leica LAS-AF для создания эталонных спектров всех 5 кадров в секунду, а также из автофлуоресценции (рисунок 2А). Использование индивидуальных спектров FP и разницу в яркости флуоресценции (выражается в% от EGFP) из Cerulean (79%), Венера (156%), tdTomato (283%) и mCherry (47%), установленного 5 последовательных каналов визуализации следующим образом: Церулеан (458 / 468-482 нм), EGFP (488 / 496-514 нм), Венера (514 / 523-558 нм), tdTomato (561 / 579-597 нм), и mCherry (594 / 618-670 нм) (
- Подтвердить точный разделение FPS, как клетки трансдуцированы каждого отдельного FP видны только в соответствующем канале и отсутствует в покое (Рисунок 2C). Кроме того, это определяется подход многоканальный создает уникальные 5-каналов "ColorPrint", которая позволяет последующий анализ цвета и клональную отслеживание и имеет то преимущество, сокращая время сбора по сравнению с спектральных изображений.
- Изображения процесса с v2.4.1 программного обеспечения Leica LAS-AF для создания эталонных спектров всех 5 кадров в секунду, а также из автофлуоресценции (рисунок 2А). Использование индивидуальных спектров FP и разницу в яркости флуоресценции (выражается в% от EGFP) из Cerulean (79%), Венера (156%), tdTomato (283%) и mCherry (47%), установленного 5 последовательных каналов визуализации следующим образом: Церулеан (458 / 468-482 нм), EGFP (488 / 496-514 нм), Венера (514 / 523-558 нм), tdTomato (561 / 579-597 нм), и mCherry (594 / 618-670 нм) (
- Отдельный флуоресценции, в режиме 2-фотона, по высокой эффективностью обычай Дихроичные зеркала и собирать с четырех каналов без descanned детектор (NDD) следующим образом: дихроичное зеркало на 568 нм с последующим зеркальные при 465 нм, с последующим 452/45 нм фильтра выбросов для ГВГ или автофлуоресценции и Cerulean, фильтр 525/40 нм излучения для EGFP или Венеры, и 648 нм зеркальные и 620/60 нм фильтра выбросов для tdTomato или mCherry.
- Выявить структурную информацию по двухфотонного микроскопии Intrinsic контраст изображения (как описано выше) из ткани автофлуоресценции от эластина, NADH, (возбужденного в 780 нм), и вторая гармоника генерируется сигнал (SHG) из костей и фибриллярного коллагена (возбужденное в 920 нм или 860 нм, собранного в обратно-рассеянных направление) 10,11.
- Для 3D-рендеринга объема, собирать серию изображений XYZ (обычно 1 х 1 х 4 мкм 3 размер воксела) вдоль оси на 5 мкм интервалами в диапазоне глубин (150-300 мкм) в течение костного мозга и других тканей, более крупные регионы, использующие функцию плитки программного обеспечения для автоматического создания сшитые объемы, включающие весь грудины ямок, примерно 2,5 х 1,2 мм 2 (ху) и 300 мкм (г) (данные 2D-2E) и Movie 1.
- Изображение свода черепа Кабачок непосредственно через череп без секционирования 2, 8.
- Раздел грудины вдоль сагиттальной плоскости (деления пополам), а затемпоперечно по суставу между 2 грудины рвом и изображения через поверхность среза 3,4,12 (Обзор в рисунке 1b адаптированный Такаку др 3).
- Для 4D покадровой обработки изображений, разместить недавно вырезали подколенных лимфатических узлов, селезенки, легких, или свода черепа образцы костных режиссерский на 35 мм число 0 покровного стекла чашек для культивирования, в 50-100 мкл DMEM, 10% FBS, содержащей 20 мМ HEPES при 37 ° С и использовать 2-фотонов Ti-SA (возбуждение 860 нм) в сочетании с конфокальной возбуждения (458 нм, 488 нм, 514 нм, 561 нм, 594 нм) и Leica резонансного сканера (8000 Гц / сек), с Z-стеки (~ 80 мкм) при 20-секундными интервалами в течение 1 часа.
- Для одновременного трехцветный использования изображений 2P Ti-Sa настроен на 860 нм одновременно с ОПГ лазера (настроенного на частоту 1130 нм для tdTomato, или 1140 нм mCherry) (Movie 2).
- Реконструкция и анализ 3D Объемы и 4D временной последовательности
- Используйте Imaris x64 обновлявляются версия 7.6, или альтернативные программные пакеты для преобразования плиточные-стеки необработанных изображений в громкости вынесено (3D) данные флуоресцентных клеток внутри костного мозга и различных тканях и экспортировать их как 3D-вращения фильмов, как описано выше 3,4 (Фильм 1) шаг за шагом, например:
- В Imaris, Откройте изображение г-стека; Выберите "Превзойти" для того, чтобы отобразить визуализации 3D громкости.
- Используйте "перемещаться" повернуть том вокруг 360 °.
- Выберите "Анимация" для создания анимации; использовать ключевые кадры, чтобы добавить выбранные виды, зум, повороты объема; Предварительный просмотр кино, редактировать по мере необходимости и сохранить файл в нужный формат фильма (например: AVI, MOV).
- Для количественной оценки 3D частот клеток и клонирования, позиций, размеров и распределения, в дальнейшем процесс Z-стеки, использующие модули Imaris XT, которые объединяют приложения MATLAB выполняющих расстояния МПСрения (при использовании алгоритма расстояния преобразования) и кластеры анализ, как описано выше 3,4. Transform последовательности изображений стеков в течение долгого времени в объемные оказанные четырехмерных (4D) фильмы с x64 программного обеспечения Imaris, и использовать место и анализ поверхности для полуавтоматической отслеживания подвижности клеток в трех измерениях, используя алгоритмы авторегрессионных движения.
- Выполните мультиспектральных анализ клеток следующим образом: извлечь многоцветной меченых пятна, добавив все 5 каналов через арифметики канала Imaris XT в новое русло; определения для всех пятен (ячеек) средней интенсивности флуоресценции в каждом из каналов 5 компонентов. Экспорт значения в программном обеспечении Excel для построения графиков, показывающих уникальный "ColorPrint", то есть относительной% каждого FP в отдельной ячейке (Рисунок 2E график). Исправьте, установленные для ткани дрейфа данные, и рассчитать скорость клеток и смещение с течением времени, длины дорожки, пути и расстояния; стоимость экспорта в Excel СОФtware построить график. Соберите композитных цифры с Adobe Photoshop CSS 5 программного обеспечения.
- Используйте Imaris x64 обновлявляются версия 7.6, или альтернативные программные пакеты для преобразования плиточные-стеки необработанных изображений в громкости вынесено (3D) данные флуоресцентных клеток внутри костного мозга и различных тканях и экспортировать их как 3D-вращения фильмов, как описано выше 3,4 (Фильм 1) шаг за шагом, например:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Всего монтажа 3D конфокальной / 2-фотонной микроскопии реконструкции грудины времени конечно костного мозга показали приживление и расширение пересаженных со-5к в модели с замечательными характеристиками: клоны появились четко разграничены, равномерно отмечены широкой палитрой цветов изначально и прогресса в течение долгого времени, чтобы преимущественно содержат клетки в основном из одного цвета. Конфокальной микроскопии установки и характерные примеры изображений 5fps отмеченное HSPC в грудины костного мозга показано на рисунке 2 и Фильмы 1 и 2.
Целые монтажа 3D конфокальной / 2-фотона микроскопии реконструкции здоровых тканей продемонстрировать возможность проследить судьбу выделенные цветом BM-клеток, полученных в течение длительных периодов времени в живых тканях. Характерные примеры полученных костного мозга клеток в кроветворных и не кроветворных органов после трансплантации приведены в Интернет фигура 3.
Рисунок 1. Обзор экспериментальных процедур. А) схематические шаги показывают, изоляцию Lin- BM клеток, трансдукция с Lego векторов, кодирующих различные FPs цветовых вариантах, и реинфузии трансдуцированных клеток в-миело-абляции мышей (трансплантации костного мозга). B) костного мозга (грудина, свода черепа ), а также различных органов / тканей были исследованы с помощью конфокальной и двухфотонной микроскопии при различных временных точках следующей пересадки. Панель адаптирована из рисунка 1 в Malide и др. 4 и панель В адаптированы из рисунка 1 в Такаку соавт 3.
2highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок установки 2 конфокальной микроскопии и представитель примером для визуализации 5fps маркировку HSPC в костном мозге. А) Спектральный (xyλ) томография используется для записи спектров излучения опорного для каждого FP, показанном в нормированных гистограмм псевдоцветной с голубой (Cerulean), зеленый (EGFP), желтый (Венера), пурпурный (tdTomato), и красный (mCherry): рады по 594 NM- (сплошная красная линия) по сравнению с 561 nm-(пунктирная красная линия) длина волны B) Пять каналы, помеченные как изображения последовательно эмиссии:. Cerulean (468-482 нм), EGFP (496-514 нм), Венеры ( 523-558 нм), tdTomato (579-597 нм) и mCherry (618-670 нм). Панели А и В взяты из фиг.1, в Malide и соавт. 4 С) Визуализация грудины BM от мышей с трансплантированной трансдуцированных отдельных векторов ПС. Каждый FP было видно только в трансдуцированных соответствующего вектора, изображенного на ней соответствующей чAnnel, и отсутствует в других (не перекрестных помех). D, E) Приживление и расширения трансплантированной сотрудничества 5FP отмечены клетки в костном мозге в естественных условиях. В день 4 после трансплантации (D) скопления клеток, помеченных в широкой цветовой гамме были видны близость к кости края (ГВГ, белый), преимущественно расположен рядом с соединения между двумя ямки. К 30 день (E) один большой клон уникальный цвет (зеленый - желтый) расширила занять весь ямок, как показано на объединены, а также одиночных каналов изображений. FPs контент-анализ демонстрирует однородное маркировки на 2 FPs варианты EGFP и Венеру.
Рисунок 3 Примеры полученных костного мозга клеток в кроветворных и некроветворных органов после трансплантации. Различные тиспросы и органы были обследованы нетронутыми через глубин 150-200 мкм и больших площадей, в вычислительном сшитые и в 3d как теневые реконструкций. A) подколенных лимфатических узла на 120 дней после трансплантации демонстрирует разбросанные клетки в основном, отмеченные желтым (Венеры) и красный (mCherry) по периферии окружено коллагеновых волокон (белый, ГСП). B) Кроме того, селезенки, в то же время, отображается небольшие кластеры и в основном разбросанные клетки различных цветов переплетенных с волокнами коллагена сети. С) в печени флуоресцентных клеток с Морфология наводящий звездчатых клеток, или макрофаги (клетки Купфера) различных цветов были выровнены по сети коллагеновых волокон (SHG белый) разграничения печени очаговая структуры. D) В кожного лоскута изображаемого от кожной побочных люминесцентных клеток различных цветов и морфологии были замечены, большинство с большим размером и морфологией предполагая идентичность Лангерганса или дендритных как, Lyiнг под эластиновых волокон (аутофлюоресценция при 780 нм, белый) и вдоль коллагена (SHG на 920 нм, белые) мышечные волокна и волосяные фолликулы. E) В самом сердце смотреть с эпикардиальной стороне многочисленные отдельные крупные люминесцентные клетки с макрофагами как морфология, происходящих из нескольких клонов, основанных на разнообразных цветов видел видны внешне, а также перемежаются глубже между кардиомиоцитов (белых), визуализированных с помощью своей внутренней двухфотонного автофлуоресценции (при 780 нм). Не наблюдалось FP люминесцентные кардиомиоциты. Ближайшие клетки (CE) из того же цвета предложить пролиферации месте и на короткие расстояния миграции. F) в легких многочисленные флуоресцентные клетки с многообразной палитры цветов были разбросаны по всей кружевной структуры коллагеновых волокон (ГСП) на всю глубину уровней, с переменными морфологии предлагая дендритных клеток, макрофагов, и тип 2 пневмоцитов самобытность.
Фильм 1 3D повторностроительство грудины BM через 4 дня после трансплантации Co 5fps. скопления клеток, помеченных в широкой цветовой гамме были видны в непосредственной близости от края кости (SHG, белый), преимущественно расположена в непосредственной близости к стыку между двух ямок. Пожалуйста, нажмите здесь чтобы посмотреть этот фильм.
Фильм 2 4D промежуток времени грудины BM двухфотонного и ОПГ микроскопия день 39 сообщение трансплантации Co 3fps (Cerulean - белый, Венеры - желтый, tdTomato - пурпурный) костной ткани (ГВГ в белый). Примечание несколько статических клонов отмечены желтым цветом или в желто-пурпурный комбинации, прилегающей к кости в отличие от высоко подвижных отдельных миелоидных клеток-предшественников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть этот фильм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем здесь подробности мощного методологии недавно разработанной для отслеживания клонального клеток, сочетая большой разнообразие сгенерированный комбинаторной маркировки с 5FP-кодирования LEGO векторов и изображений с тандемной конфокальной и 2-фотонной микроскопии для достижения объемного и динамических изображений в живых тканях. Это расширило использование FP-основе цветовой маркировкой по записи конфокальной спектральную идентичность в 5 "различных" 8-бит каналов. Таким образом, относительная отношение Cerulean, EGFP, Венера, tdTomato, mCherry в каждой ячейке создает уникальный "ColorPrint" для идентификации клонального потомства. Многоцветная маркировка на 5fps увеличивает палитру этикетки с более разнообразия, который был показан особенно полезно при изучении распределения, контакты, плиточные договоренности и конкурентные взаимодействия между клетками или группы клеток того же типа в образцах плотных тканей. В сочетании с 2-фотонного возбуждения внутренних структурных особенностей различных тканей иорганы, мы можем отследить цвета отмечены клоновых клетки в их родной среде без необходимости фиксации и физической срезов. Демонстрация того, что дочерние клетки, полученные из отдельных предшественников сохранить своеобразную «цвет-ПРИНТ", несмотря дифференцировки и пролиферации была продемонстрирована в нашей опубликованном исследовании, с сотнями дифференцированных клеток в колониях отдельных в пробирке (КОЕ), показывающих ту же «ColorPrint."
Этот подход сочетает в себе преимущества одноклеточных решен изображений с высоким разрешением совместно с оптическим срезов через конфокальной микроскопии. Очень большие X - Y (мм 2) регионы неповрежденной объема плотной ткани могут быть рассмотрены путем создания плиточные-изображения. Эти изображения с высоким разрешением от оптических секций могут быть использованы для вычислительно реконструировать (автоматически и "на лету") в комплекте 3D объемов большой сложности до глубины ~ 30 мкм, включающий ~ 20-30 слоев клеток,сосудистой, костной и коллагеновые структуры. 3D реконструкции могут быть использованы для морфометрические неинвазивных количественного анализа биологической интерес. Важным предостережением отметить, является то, что большой объем / высокая изображений разрешение отнимает много времени, например 1 час за ~ 1 мм 3 ткани (один ямок грудины), поэтому мы рекомендуем томография не более 1 мышь за экспериментом за день, когда костный мозг, а также различные ткани должны быть подробно рассмотрены.
Хотя в настоящее время технически невозможно представить грудины костного мозга в той же мыши неоднократно в течение долгого времени, ценная информация может быть получена при изучении отдельных мышей в различные моменты времени из когорты первоначально пересаженной с тем же населением LEGO-трансдуцированных клеток линейно. Грудина является идеальным местом для изучения регенерации костного мозга в связи с его раннее и полное восстановления гемопоэза, стабильности, простого срезов, воспроизводимости и большого объема. Это имеет решающее значение для достижения около 50% эффективности трансдукции линейно клеток для каждого отдельного FP вектора, перед началом работы с трансплантации и изображений эксперимента, чтобы иметь достаточно цвет разнообразия и FP-клетки, экспрессирующие чтобы сделать эксперимент информативным. Там всегда будет один нюанс, что более чем один клон может случайно в конечном итоге с аналогичных или идентичных colorprints, особенно если трансдукция является неэффективные и многие клетки имеют только один или два вставки. Кроме того, важно, чтобы быть уверенным в том, что каждый отдельный инъекции в хвостовую вену доставляются близка к 100% дозы клеток.
Это доказывает целесообразность высокого разрешения 4D жить динамических исследований путем объединения резонансную многофотонное сканирования и конфокальной микроскопии покадровой. Это позволяет не только статическое характеристику различных клонов, но и анализ кинетических различий между клетками, отмеченных же цвета. Кроме того демонстрирует видео-курс 4D визуализации трех FPs меченых образцов, использующих суccessfully в тандемных Тиса и ОПГ лазеров для повышения эффективности, меньше вредных, более глубокого проникновения живой ткани, что открывает путь для 2-фотона прижизненной визуализации. Кроме того, устанавливает ценный вариант для отслеживания клетки в течение продолжительного периода (месяца) Преодоление ограничений текущие на основе красителей. Этот подход использует имеющийся в продаже конфокальной и двухфотонного лазерного микроскопа и автоматизированные пользовательские интерактивные методы анализа изображений на основе коммерчески доступного программного пакета, позволяющего легко реализовать в обычных объектов микроскопии.
Наконец, эта методика не ограничивается анализа HSPCs. Многие биологические системы могут извлечь выгоду из способности решать пространственно-временные аранжировки клонально сложных клеточных и структурных элементов через многоцветного мечения и конфокальной и визуализации 2-фотона. Регенерации органов, иммунные реакции, и опухолевых метастатических модели может быть допрошен, чтобы предложить всего несколько потенциальных применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
