Summary
Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.
Abstract
Nós desenvolvida e validada uma metodologia de marcação para rastreamento clonal de células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) com alta resolução espacial e temporal para estudar in vivo hematopoiese usando o transplante de medula óssea de camundongos modelo experimental fluorescente. Marcação usando lentivirais que codificam proteínas fluorescentes (FPS) combinatória genética permitem o mapeamento do destino da célula através de imagens de microscopia avançada. Vetores que codificam cinco PQ diferentes: Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato e mCherry foram utilizados para a transdução simultaneamente hspCs, criando uma paleta variada de cores de células marcadas. Imagem por microscopia confocal híbrido / two-photon permite a avaliação alta resolução simultânea de células marcadas com exclusividade e seus descendentes em conjunto com os componentes estruturais dos tecidos. Análise volumétrica ao longo de grandes áreas revelam que as células derivadas de HSPC espectralmente codificados podem ser detectados de forma não invasiva, em vários tecidos intactos, incluindo a medula óssea (BM), Por extensos períodos de tempo a seguir ao transplante. Estudos ao vivo combinando multiphoton taxa de vídeo e confocal de imagem time-lapse em 4D demonstrar a possibilidade de rastreamento de celular e dinâmica clonal de uma forma quantitativa.
Introduction
A produção de células sanguíneas, denominado hematopoiese, é mantida por uma pequena população de células estaminais e progenitoras hematopoéticas (hspCs). Estas células residir dentro da medula óssea (BM) em um nicho microambiental complexo que consiste em osteoblastos, células do estroma, tecido adiposo e estruturas vasculares, todos implicados no controlo da auto-renovação e diferenciação 1,2. Como intacta BM tem sido tradicionalmente inacessível para observações diretas, as interações entre HSPC e seu microambiente permanece em grande parte não caracterizada in vivo. Anteriormente, nós estabelecemos uma metodologia para visualizar a arquitetura 3D da BM intacto usando microscopia de fluorescência confocal e reflexão 3. Foram caracterizados expansão de hspCs EGFP-marcados na MC, mas o uso de apenas um único FP impedida análise de regeneração a um nível clonal. Muito recentemente, aproveitou a Lentivirus Gene Ontology (Lego) vetores expressando constitutivamente flproteínas uorescent (FPS) para marcar de forma eficiente as células 4,5. A co-transdução de HSPC com três ou cinco vectores gera uma paleta de cores diversas combinatórias, permitindo a localização de vários clones de HSPC individuais.
Marcado HSPC combinado com nova tecnologia de imagem permitido traçar homing indivíduo HSPC e enxerto na BM de ratos irradiados. Vetores Lego foram usadas para marcar HSPC com 3 ou 5 fps diferentes (de Cerulean, eGFP, Vênus, tdTomato e mCherry) e seguir o seu enxerto ao longo do tempo na BM por microscopia confocal e dois fótons, que permite a visualização nítida de ossos e outros estruturas de matriz, e a relação de clones HSPC de componentes do seu microambiente. HSPC foram purificados como a linhagem de células negativas de camundongos C57BL / 6 BM, transduzidas com vetores de Lego, e infundidas por injeção na veia da cauda em ratos congênitas ablated-mielo. Através do monitoramento de grandes volumes de tecido esterno BM visualizamos o enxerto intra-ósseo que ocorre no inícioBM regeneração. Grupos de células com espectros cor diversificada, parece, inicialmente, em estreita proximidade com o osso e progrediu centralmente ao longo do tempo. Curiosamente, após mais de 3 semanas, a medula consistiu de aglomerados clonais macroscópicas, sugerindo propagação da hematopoiese derivado de hspCs individuais contiguamente na medula, em vez de difusão generalizada de hspCs através da corrente sanguínea. Havia menos diversidade de cores em pontos de tempo de atraso, sugerindo dificuldade na transdução de longo prazo repovoar células com múltiplos vetores.
Além disso, hspCs aglomerados formados no baço, um órgão também responsável para a hematopoiese em ratinhos. Células individuais derivadas de HPSC poderia ser resolvido no timo, nódulos linfáticos, baço, fígado, pulmão, coração, pele, músculo esquelético, tecido adiposo, e renal bem. As imagens em 3D pode ser avaliada qualitativamente e quantitativamente a apreciar a distribuição de células com perturbações mínimas dos tecidos. Por fim, ilustramosd a viabilidade de estudos dinâmicos ao vivo em 4D, combinando multiphoton digitalização ressonante e confocal de imagem time-lapse. Esta metodologia permite que não-invasivo de alta resolução, multidimensional célula-destino traçado do espectro marcados populações de células em sua arquitetura intacta 3D, fornecendo uma ferramenta poderosa no estudo da regeneração de tecidos e patologia.
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Protocol
Todos os animais foram alojados e tratados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde, e matriculou-se em um protocolo de cuidado e uso NHLBI animal Comitê-aprovado. Feminino B6.SJL-Ptprc (d) pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) e C57BL / 6, machos, 6-12 semanas de idade, foram utilizados como dador e receptor, respectivamente.
Uma lista de materiais, reagentes, e o equipamento é fornecido na Tabela 1.
1. Lego Transdução de Rato hspCs e Transplante de Medula Óssea
Realizar procedimentos descritos abaixo, em um nível de biossegurança certificada 2 (BSL-2) gabinete (cultura de tecidos Hood).
- Produção de Lego Vetores Encoding 5fps
- Use o lentiviral "Gene Ontology" (Lego) plasmídeos vetor, cada codifica uma FP diferente de um promotor forte SFFV constitutiva, incluindo Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Vênus), a Lego-T2 (tdTomato), e lego-C2 (mCherry) gentilmente cedido pelo Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburgo, Alemanha); agora também disponível a partir Addgene 5-7.
- Para produzir vetores de Lego, sementes de 5 x 10 6 células 293T em placas de 10 cm (use 12 pratos para cada vector) 24 horas antes da transfecção em 8 ml de mídia I10 (IMDM suplementado com 10% SFB e glutamina / penicilina / estreptomicina).
- Transfecção das células com fosfato de cálcio, utilizando recomendações kit CAPHOS ligeiramente modificados:
- Para cada placa de mistura de 15 mg vetor Lego, 12 mg pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mg PREV-TAT, e 1 mg plasmídeos pMD2.G-VSV-G em presença de 50 mL de 2,5 M CaCl2, e adicione água para obter um volume total de 500 ul.
- Plasmídeos de ADN precipitado com 500 ul de 2x HeBS (HEPES-tamponado salino) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente antes de se adicionar a cada placa de células 293T.
- Incubar as células para6 h num 37 ° C 5% de CO 2 incubadora; remover a mídia e adicionar fresco cultura da mídia pós 6 hr transfecção.
- Recolher os sobrenadantes da cultura contendo partículas lentivirais de cada placa, por dia, durante 3 dias. Cada coleção sobrenadante dia seguinte adicionar mídia I10 fresco para cada placa.
- Filtrar através de poros de 0,22 um, piscina e concentrar os sobrenadantes por ultracentrifugação num rotor SW28 durante 2 horas a 71.900 xg e 4 ° C.
- Ressuspender o sobrenadante em 1 ml de meio StemSpan. Alíquota os estoques lentiv�icos em 200 mL e armazenar a -80 ° C.
- Titulação de Lentivirus
Determinar o título de partículas vetor Lego em sobrenadantes coletados via quantificação de transdução de unidades / ml, utilizando células NIH3T3. Os títulos de permitir o cálculo do volume de cada sobrenadante vector necessária para resultar na desejada relativamente multiplicidade de infecção (MOI) de alvo experimentalcélulas.- Placa de 5 x 10 4 NIH3T3 células por poço (placa de 12 poços) em 2 ml de meio I10 um dia antes da titulação.
- Preparar diluições em série de 5 vezes de sobrenadantes contendo vector em meios I10 suplementadas com sulfato de protamina (4 mg / ml é 1.000x).
- Remova a mídia das células, e substituir por 500 mL de diluições do sobrenadante contendo o equivalente a 2, 0,8, 0,32 e 0,128 l de vírus concentrado.
- Determinar o número (n) de células por poço presentes no momento da transdução, contando também um controlo.
- 6 horas após a transdução, adicionar 2 ml de meio de I10 e incubar durante 3 dias a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Colher as células de cada poço utilizando tripsina-EDTA, e determinar a percentagem de células fluorescentes (FP%) através de citometria de fluxo.
- Calcula-se o título como a seguir, a média dos títulos obtidos para cada poço (diluição), resultando num FP% entre 1 e 50%: (título de partículas de vector / ml) = nx% FP / Volume de sobrenadante vetor (ml). Calcule a média dos títulos obtidos para cada diluição, se o FP% é entre 1 e 50%.
- Colecção celular Rato, purificação, transdução, e transplantação (mostrado esquematicamente na Figura 1A adaptado de Malide et al. 4).
- Sacrifício camundongos doadores por um procedimento aprovado. Colheita de medula óssea de membros anteriores e posteriores: dissecar úmeros, o fémur ea tíbia, completamente remover todos os músculos, ligamentos e excesso de tecido a partir de ossos, corte em todo o final de cada osso mais próximo possível para a articulação, e lave a medula óssea de o osso usando uma agulha G 27-0 em uma seringa contendo mídia I10.
- Agregar as células da medula óssea inteiras durante 10 minutos a 500 xg, a 4 ° C e lisar os glóbulos vermelhos duas vezes com 50 ml de tampão ACK. Suspenda as células em 10 ml de meio I10.
- Purificar (Lin @) células progenitoras linhagem negativa com o kit de exaustão de acordo com a linhagem MACS Protoco um kit modificadol:
- Utilizar 30 ul de microesferas anti-biotina em vez de 10 mL / 10 7 células; concluir as etapas de lavagem com media I2 (IMDM suplementado com 2% de SFB) em vez de tampão.
- Insira uma etapa de lavagem entre a incubação com Cocktail Biotina-Antibody ea incubação com anti-biotina MicroBeads; e equilibrar a coluna com I10 em vez de tampão.
- Cultura de células Lin @ de 48 horas, a uma densidade de partida de 5 x 10 5 células / ml em meio StemSpan suplementado com 10 ng / ml de IL-3 murina, 100 ng / ml de IL-11 de murino, de 100 ng / ml humano Flt-3 ligando, e 50 ng / factor de células estaminais de murino ml.
- Transferência de 1 a 4 x 10 5 células de 12 poços para as placas revestidas com RetroNectin e transdução com sobrenadantes LEGO, cada um com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 6-7 para alcançar 50% de eficiência de expressão para cada FP, na presença de StemSpan meios de comunicação e citocinas detalhado acima e 4 ug / ml de sulfato de protamina.
- Transduzir célulascom cada vector LEGO individualmente, conforme descrito no passo 1.3.5 e misturar as células a seguir a transdução (denominado mistura) ou co-transdução de células com todos os sobrenadantes 5 LEGO vector simultaneamente (denominados Co). Remover as células 24 horas depois, lave uma vez com meio StemSpan sem citocinas, e ressuspender-los em mídia StemSpan sem citocinas para o transplante, ou transferi-los para meio fresco com citocinas e cultura durante 96 horas adicionais antes de microscopia confocal e citometria de fluxo.
- Realizar o transplante de medula óssea através da infusão transduzidas Lin hspCs através de injecção na veia da cauda em 11 Gy em dose única receptores pré-irradiadas (6-18 horas antes do transplante) destinatários, em um volume de 100 mL, a uma dose de células por ratinho correspondendo a 1 células -4 x 10 5 Lin @ banhado originalmente para a transdução. Em cada experimento, o transplante um grupo inteiro de animais com a mesma população de células transduzidas de doadores BM.
- Para a caracterização in vitro de transduzidas HSPEs, a cultura das células para um adicional de 4-5 dias em StemSpan suplementado com citocinas e analisar por citometria de fluxo para a eficiência de transdução, e por microscopia para a diversidade de cores.
- Sacrifício camundongos individuais e recuperar tecidos e órgãos para a imagem latente, em vários pontos de tempo até 120 dias pós-transplante.
- Spray com etanol a pele do rato e inciso da pele no lado ventral evitar a disseminação de cabelo.
- Dissecar e de consumo de acordo com os procedimentos padrão do baço, nódulos linfáticos poplíteos, pulmão, coração, pele, tecido adiposo, o músculo esquelético, rim, fígado, bem como a cabeça para o acesso a calvária.
- Como alternativa, use calvaria ou criar uma janela óssea para geração de imagens ao vivo várias vezes ao longo do tempo 2,8,9 ou imagem órgãos superficiais, como os gânglios linfáticos da pele e no animal vivo.
- Coloque órgãos individuais em 35 milímetros placas de cultura de número 0 tampa de vidro em 50-10056; l PBS para imagens-los intactos, sem corte, fixação ou processamento adicional, tal como descrito no passo 2.5.
- Para imagem volumétrica, manter os órgãos em em PBS frio até o uso. Para imagens de lapso de tempo proceder de imediato a imagens de órgãos em DMEM, 10% FBS contendo HEPES 20 mM a 37 ° C
- Sacrifício camundongos individuais e recuperar tecidos e órgãos para a imagem latente, em vários pontos de tempo até 120 dias pós-transplante.
2. confocal e de dois fótons Microscopia e Análise de Imagem
- Realizar imagem usando um microscópio confocal cinco canais e multiphoton sistema Leica SP5 equipado com multi-linha Argon, diodo 561 nm, 594 nm HeNe e HeNe 633 nm lasers visíveis. Use no modo 2-fótons, um femtosegundo pulsada laser de Ti: Safira (Ti-Sa), ajustável para excitação de 680 a 1080 nm com correção de dispersão. Utilização em experiências envolvendo vermelho-deslocado PQ (tdTomato e mCherry), um oscilador paramétrico óptico (OPO) do laser para alargar a gama de comprimentos de onda de saída, tanto quanto 1,030-1,300 nm, sequencialmente ou em simultâneo com o tele Ti-Sa a laser.
- Imagem de vários tecidos, utilizando um HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA objectiva de imersão de água (WD = 2,5 mm), um-PLAPO-CS HC 20X / 0,70 NA objectivo seco (WD = 0,6 mm), ou HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA objetiva de imersão em água (WD = 0,6 mm).
- Obter espectros de fluorescência confocal coleta de pilhas lambda (xyλ) da luz emitida em 5 nm-bandas do espectro visível a partir de células da BM transduzidas com um único vetor FP Lego, bem como do controle, não-transplantado BM.
- Processo de imagens com o software v2.4.1 Leica LAS-AF para criar todos os espectros de referência da PQ 5, bem como de autofluorescência (Figura 2A). Usando os espectros FP individual e a diferença no brilho de fluorescência (expressos como% de EGFP) de Cerúlea (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%), situado a 5 canais de imagem sequenciais do seguinte modo: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Validar a rigorosa separação PQ, como células transduzidas com cada indivíduo FP são visíveis apenas no canal correspondente e ausente do resto (Figura 2C). Além disso, esta abordagem multi-canal definido cria uma única 5-canais "ColorPrint" que permite a análise de cor e posterior acompanhamento clonal e tem a vantagem de reduzir tempos de aquisição em relação a imagem espectral.
- Processo de imagens com o software v2.4.1 Leica LAS-AF para criar todos os espectros de referência da PQ 5, bem como de autofluorescência (Figura 2A). Usando os espectros FP individual e a diferença no brilho de fluorescência (expressos como% de EGFP) de Cerúlea (79%), Vénus (156%), tdTomato (283%) e mCherry (47%), situado a 5 canais de imagem sequenciais do seguinte modo: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), e mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Emissão de fluorescência separado, no modo 2-fótons, de elevada eficiência espelhos costume dicróicas e recolher com quatro canais detector não-descanned (NDD) da seguinte forma: um espelho dicróico em 568 nm seguido por um espelho dicróico em 465 nm, seguido por a 452/45 nm filtro de emissão para SHG ou autofluorescência e Cerulean, um filtro 525/40 nm de emissão para EGFP ou Vênus, e um espelho dicróico 648 nm e 620/60 nm filtro de emissão para tdTomato ou mCherry.
- Revelar informações estruturais por microscopia de dois fótons iimaging contraste ntrinsic (como descrito acima) de autofluorescência tecido de elastina, NADH, (animado em 780 nm), e segundo harmônico sinal gerado (SHG) do osso e colágeno fibrilar (animado em 920 nm ou 860 nm coletados em um back-espalhados direção) 10,11.
- Para visualização volumétrica 3D, recolher série de imagens xyz (tipicamente 1 x 1 x 4 mm 3 de tamanho de voxel) ao longo do eixo z, a intervalos de 5 mm ao longo de um intervalo de profundidades (150-300 um) por toda a medula óssea e outros tecidos, sobre grandes regiões, utilizando a função telha do software para gerar automaticamente volumes que compõem todo um costuradas fossas esterno, aproximadamente 2,5 x 1,2 milímetros 2 (xy) e 300 um (z) (Figuras 2D-2E) e Filme 1.
- Imagem calota craniana medula diretamente através do crânio, sem o corte 2, 8.
- Seção esterno ao longo do plano sagital (bisection) e depoistransversalmente na articulação entre a imagem 2 esternal fossa e através do corte cara 3,4,12 (Resumo na Figura 1B adaptado de Takaku et ai 3).
- Para 4D lapso de tempo, colocar recentemente excisada poplítea nó de linfa, baço, pulmão, ou amostras de ossos de calvária sem cortes para pratos de 35 mm de cultura de número 0 lamela, em 50-100 ul de DMEM, FBS a 10% contendo 20 mM de HEPES a 37 ° C e usar dois fótons Ti-Sa excitação (860 nm), combinada com a excitação confocal (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) e Leica scanner de ressonância (8000 Hz / s), tendo z-stacks (~ 80 mm) em intervalos de 20 seg durante até 1 hora.
- Por três cores de uso de imagem 2P simultânea Ti-Sa sintonizado em 860 nm simultaneamente com o laser OPO (sintonizado em 1.130 nm para tdTomato; ou 1.140 nm mCherry) (Filme 2).
- Reconstrução e análise dos volumes 3D e sequências de tempo 4D
- Use Imaris x64 softwsão a versão 7.6, ou pacotes de software alternativas para transformar os azulejos-stacks de imagens RAW para prestados volume (3D) de dados de células fluorescentes dentro da medula óssea e tecidos diferentes e exportá-los como filmes 3D-rotação, como descrito anteriormente 3,4 (Filme 1) passo-a-passo exemplo:
- Em Imaris, abra a imagem z-stack; Selecione "Ultrapasse" para exibir a visualização volume 3D.
- Use "navegar" para aumentar o volume em torno de 360 °.
- Selecione "Animação" para criar uma animação; usar quadros-chave para adicionar vistas selecionadas, zoom, rotações de volume; Visualizar o filme, edite como necessário e salvar o arquivo em um formato de filme desejada (ex: avi, mov).
- Para a avaliação quantitativa das células e clone de freqüência 3D, posições, tamanhos e distribuição, outro processo de z-stacks, utilizando os módulos Imaris XT que integram aplicações MATLAB realizando distância de mediçãourements (usando um algoritmo de transformação distância) e clusters de análise, como descrito anteriormente 3,4. Transforme as seqüências de pilhas de imagens ao longo do tempo em quatro dimensões (4D) filmes prestados no volume com software x64 Imaris e usar local e análise de superfície para rastreamento semi-automático de motilidade celular em três dimensões utilizando algoritmos de movimento auto-regressivos.
- Realizar análise multiespectral de células da seguinte forma: extrair o multi-color pontos marcados, adicionando todos os 5 canais através de canal aritmética dos Imaris XT em um novo canal; determinar, para todos os pontos (células), a intensidade de fluorescência média em cada um dos canais do componente 5. Exportar os valores em software Excel para plotar gráficos que indicam o "ColorPrint" único ou seja, a relação% de cada FP em cela individual (Figura 2E gráfico). Corrija o conjunto de dados para a deriva de tecidos, e calcular a velocidade da célula e deslocamento ao longo do tempo, os comprimentos de pista, caminhos e distâncias; valores de exportação em Excel software para traçar gráficos. Montar figuras compostas com software Adobe Photoshop CSS 5.
- Use Imaris x64 softwsão a versão 7.6, ou pacotes de software alternativas para transformar os azulejos-stacks de imagens RAW para prestados volume (3D) de dados de células fluorescentes dentro da medula óssea e tecidos diferentes e exportá-los como filmes 3D-rotação, como descrito anteriormente 3,4 (Filme 1) passo-a-passo exemplo:
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Representative Results
Whole-mount 3D confocal / 2 fótons reconstruções de microscopia do curso esternal tempo de medula óssea revelou o enxerto e expansão de transplantados co-5fps em um padrão com características marcantes: clones apareceram claramente delineados, de forma homogênea marcado com ampla paleta de cores inicialmente e progresso ao longo do tempo para conter preferencialmente células de uma grande parte da cor. Configuração microscopia confocal e exemplos representativos de imagem 5ips-HSPC marcado na medula óssea do esterno estão ilustrados na Figura 2 e Filmes 1 e 2.
Reconstruções de microscopia confocal / 2 fótons inteiras de montagem 3D de tecidos intactos demonstrar a possibilidade de rastrear o destino de cor marcado células BM-derivados para longos períodos de tempo nos tecidos vivos. Exemplos representativos de células derivadas de medula óssea em hematopoiéticas e não hematopoiéticas órgãos após transplante são mostrados na Fi gura 3.
Figura 1 Visão geral dos procedimentos experimentais. A) Os passos esquemáticos ilustram isolamento de células Lin BM, transdução com vetores Lego que codificam uma variedade de variantes de cor fps e reinfusão de células transduzidas em-ablated-mielo camundongos (transplante de medula óssea). B) da medula óssea (esterno, calota craniana ), bem como vários órgãos / tecidos foram examinadas por microscopia confocal e dois fotões em diferentes pontos de tempo após o transplante. O painel A é adaptado a partir da Figura 1, em Malide et al. 4 e Painel B adaptada a partir da Figura 1, em Takaku et ai 3.
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Figura 2 configuração microscopia confocal e exemplo representativo de imagem 5fps marcado HSPC na medula óssea. A) Espectral (xyλ) de imagem usado para gravar espectros de emissão de referência para cada FP, ilustrado na histogramas normalizados pseudocolored com ciano (Cerulean), verde (EGFP), amarelo (Vênus), magenta (tdTomato) e vermelho (mCherry): animado por 594 NM- (linha vermelha sólida) em comparação com 561 NM- (linha vermelha tracejada) comprimento de onda B) Cinco canais definidos para a imagem sequencialmente emissão de:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venus ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) e mCherry (618-670 nm). Os painéis A e B são adaptados a partir da Figura 1, em Malide et al. 4 C) de imagem em esternal BM a partir de ratinhos transplantados com transduzidas com vectores PF individuais. Cada FP era visível apenas nas células transduzidas com o vector correspondente fotografada no ch apropriadaannel, e ausente dos outros (não cross-talk). D, E) Enxerto e Expansão da transplantado co-5PQ marcado células na medula óssea in vivo. No dia 4 pós-transplante (D) aglomerados de células marcadas em grande variedade de cores foram proximidade visível para a borda do osso (SHG, branco), de preferência, localizado adjacente à junção entre ambas as fossas. Por dia, 30 (E) um grande clone de cor única (verde - amarelo) tem se expandido para ocupar toda a fossa como ilustrado na mescladas, bem como únicos canais de imagens. PQ análise de conteúdo demonstra homogênea marcação por 2 PQ variantes EGFP e Vênus.
Figura 3. Exemplos de células de medula óssea derivadas de hematopoiéticas e não hematopoiéticas órgãos após transplante. Vários tissues e órgãos foram fotografadas intacta através profundezas de 150-200 fim e grandes áreas de superfície, computacionalmente costurados e renderizado em 3D como reconstruções de sombra. A) linfonodo poplíteo em 120 dias após o transplante demonstra células espalhadas principalmente marcados em amarelo (Vênus) e vermelho (mCherry) perifericamente rodeado por fibras de colágeno (branco, SHG). b) Da mesma forma, o baço, ao mesmo tempo, mostra pequenos grupos e células espalhadas principalmente de várias cores entrelaçadas por fibras colágenas rede. c) Nas células fluorescentes fígado com morfologia sugestiva de células estreladas, ou macrófagos (células de Kupffer) de várias cores foram alinhadas ao longo da rede fibras de colágeno (SHG branco) delineando estruturas lobulares hepáticas. D) Em um retalho de pele trabalhada a partir de células fluorescentes laterais dérmica de diversas cores e morfologias foram vistos, a maioria com grande tamanho e morfologia sugerindo identidade de Langerhans ou dendrítica-like, lying sob fibras de elastina (autofluorescência em 780 nm, branco) e ao longo de colágeno (SHG em 920 nm, brancas) fibras musculares e folículos pilosos. e) No coração visto do lado do epicárdio inúmeras grandes células fluorescentes individuais com morfologia de macrófagos-like originário a partir de vários clones com base em diversas cores vistas são visíveis superficialmente e também intercaladas mais profunda entre os cardiomiócitos (branco) visualizadas pelo seu intrínseco autofluorescência de dois fótons (a 780 nm). Não foram observadas PF cardiomiócitos fluorescentes. Células vizinhas (CE) da mesma cor sugerir na proliferação in situ e de curta distância de migração. F) No pulmão numerosas células fluorescentes com uma paleta variada de cores foram espalhados por toda a estrutura de laço-como o das fibras de colágeno (SHG) em todas as profundidades níveis, com morfologias variáveis sugerindo identidades celular, macrófagos e pneumócitos tipo 2 dendríticas.
Filme 1. 3D reconstrução de esternal BM em 4 dias após o transplante Co 5 fps. aglomerados de células marcadas em grande variedade de cores eram visíveis na proximidade da borda óssea (SHG, branco), preferencialmente localizado ao lado da articulação entre duas fossas. Clique aqui para ver este filme.
Filme 2. 4D lapso de tempo esternal BM de dois fótons e microscopia OPO no dia 39 pós-transplante Co 3 fps (Cerulean - branco, Venus - amarelo, tdTomato - magenta) osso (SHG em branco). Nota vários clones estáticos marcados em amarelo ou em combinação amarelo-magenta adjacente ao osso, em contraste com as células progenitoras mielóides individuais altamente móveis. Clique aqui para ver este filme.
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Discussion
Descrevemos aqui os detalhes de uma metodologia poderosa recentemente concebido para rastreamento de células clonal, combinando a grande diversidade gerada pela marcação com vetores Lego-codificação 5PQ e de imagem com confocal tandem e microscopia dois fótons para alcançar volumétrica e imagens dinâmicas em tecidos vivos combinatória. Isto estendeu o uso de cores baseada em FP marcação gravando confocal identidade espectral em 5 "distintas" canais de 8-bits. Assim, a proporção relativa de Cerulean, EGFP, Vênus, tdTomato, mCherry dentro de cada célula cria uma "ColorPrint" único para a identificação de progênie clonal. A rotulagem multicolor por 5 fps aumenta a paleta de rótulos com mais diversidade, que foi mostrado particularmente útil quando se estuda a distribuição, contatos, arranjos de azulejos e interações competitivas entre as células ou grupo de células do mesmo tipo em amostras de tecidos densos. Combinado com dois fotões de excitação características estruturais intrínsecas de vários tecidos eórgãos, pode-se controlar cores marcadas células clonais no seu ambiente nativo, sem a necessidade de fixação e de corte físico. A demonstração de que as células filhas derivadas de progenitores individuais mantém um distintivo "cor-print", apesar de diferenciação e proliferação foi demonstrado em nosso estudo publicado, com centenas de células diferenciadas encontradas em in vitro colónias individuais (UFC), mostrando o mesmo "ColorPrint."
Esta abordagem combina os benefícios de uma única célula resolvido imagens de alta resolução com seccionamento óptico através de microscopia confocal. Muito grandes X - Y (mm 2) regiões do volume intacto tecido denso pode ser examinado por geração de imagens em azulejo. Estas imagens de alta resolução de cortes ópticos podem ser usados para reconstruir computacionalmente (automaticamente e "on-the-fly") volumes completo em 3D de grande complexidade a uma profundidade de ~ 30 mm, compreendendo ~ 20-30 camadas de células,vascular, ossos e estruturas de colágeno. Reconstruções 3D pode ser usado para análises quantitativas não-invasivos morfométricas de interesse biológico. Uma ressalva importante a salientar é que grande volume / imagens de alta resolução é demorado, por exemplo 1 hora por ~ 1 mm3 de tecido (um fossas do esterno), portanto, recomendamos imagem não mais do que um rato por experiência por dia em que a medula óssea, bem como diferentes tecidos precisam ser examinados em detalhe.
Embora a técnica actualmente impossível a imagem de medula óssea do esterno, no mesmo rato repetidamente ao longo do tempo, informações valiosas pode ser obtido através do estudo de ratinhos individuais em pontos de tempo diferentes a partir de uma coorte inicialmente transplantado com a mesma população de células Lin @ LEGO transduzidas. O esterno é um excelente local para estudar a regeneração da medula óssea devido à sua reconstituição hematopoética cedo e completa, estabilidade, fácil de corte, reprodutibilidade e de grande volume. É crítico para atingir cerca de 50% de eficiência de transdução de células Lin @ para cada vector de FP indivíduo, antes de prosseguir com um transplante e imagiologia experimento, a fim de ter suficiente diversidade de cores e FP-expressando células para fazer o experimento informativo. Haverá sempre uma ressalva de que mais de um clone pode por acaso acabar com colorprints semelhantes ou idênticos, especialmente se a transdução de células é ineficiente e muitos têm apenas uma ou duas inserções. É também importante ter a certeza que cada indivíduo injecção na veia da cauda entregue perto de 100% da dose de células.
Isso prova a viabilidade de alta resolução 4D viver estudos dinâmicos, combinando multiphoton digitalização ressonante e confocal de imagem time-lapse. Ele permite não só a caracterização estática de vários clones, mas também análise das diferenças cinéticas entre as células marcadas pela mesma cor. Além disso demonstra-taxa de vídeo de três 4D FPs amostras marcadas empregando successfully em conjunto Tisa e OPO lasers para maior eficiência, menos prejudiciais, uma penetração mais profunda de tecido vivo, abrindo o caminho para dois fótons de imagem intravital. Além disso, estabelece uma opção valiosa para rastrear células ao longo de períodos prolongados (meses) superação das limitações atuais à base de corantes. Esta abordagem utiliza confocal disponíveis comercialmente e de dois fótons microscópio laser e métodos de análise de imagem interativa pelo usuário automatizados baseados em um pacote de software disponível no mercado que permite fácil aplicação em instalações de microscopia habituais.
Finalmente, este método não é limitado para a análise de hspCs. Muitos sistemas biológicos poderiam se beneficiar da capacidade de resolver arranjos espaço-temporais de elementos celulares e estruturais clonal complexas através rotulagem multicolor e confocal e imagem 2-fótons. Regeneração de órgãos, as respostas imunes e tumorais metastáticas padrões poderiam ser interrogado, sugerir apenas algumas aplicações potenciais.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
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