Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51669
Automatic Translation
1, 2, 2
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

Summary

اندماجي 5 البروتينات الفلورية وضع علامات على الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تسمح في الجسم الحي تتبع النسيلي عبر مبائر واثنين من الفوتون المجهري، وتوفير نظرة ثاقبة العمارة المكونة للدم نخاع العظم خلال التجدد. هذا الأسلوب يسمح رسم الخرائط مصير غير الغازية مشفرة طيفيا من الخلايا المشتقة من HSPCs في أنسجة سليمة لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع.

Abstract

قمنا بتطوير والتحقق من صحة العلامات الفلورية منهجية لتتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs) مع القرار المكانية والزمانية عالية لدراسة تكون الدم في الجسم الحي باستخدام الفئران زرع نخاع العظم نموذج تجريبي. اندماجي بمناسبة الجيني باستخدام ناقلات lentiviral ترميز البروتينات الفلورية (FPS) تمكين الخرائط مصير الخلية من خلال التصوير المجهري المتقدم. استخدمت فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry إلى تنبيغ بالتزامن HSPCs، وخلق لوحة متنوعة من خلايا اللون ملحوظ: ناقلات ترميز خمسة ضباط مختلفة. التصوير باستخدام متحد البؤر / ثنائي الفوتون المجهري الهجين تمكن في وقت واحد تقييم عالية الدقة للخلايا تميز فريد وذريتها بالتزامن مع المكونات الهيكلية للأنسجة. الحجمي يحلل على مساحات واسعة تكشف عن أن مشفرة طيفيا خلايا HSPC المشتقة يمكن الكشف غير جراحية في أنسجة سليمة المختلفة، بما في ذلك نخاع العظم (BM)، لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع. دراسات حية تجمع بين multiphoton معدل الفيديو ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير في 4D تثبت إمكانية تتبع الديناميكي الخلوي والنسيلي بطريقة كمية.

Introduction

إنتاج خلايا الدم، تكون الدم يسمى، والتي تحتفظ بها عدد صغير من السكان من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف (HSPCs). هذه الخلايا الموجودة داخل نخاع العظم (BM) في محراب microenvironmental معقدة تتكون من بانيات، والخلايا اللحمية، الأنسجة الدهنية، وهياكل الأوعية الدموية، وجميع المتورطين في السيطرة على تجديد الذات والتمايز 1،2. كما كان حالها BM لا يمكن الوصول إليها تقليديا على الملاحظات المباشرة، والتفاعل بين HSPC والمكروية التي لا تزال uncharacterized إلى حد كبير في الجسم الحي. سابقا، أنشأنا منهجية لتصور العمارة 3D من BM سليمة باستخدام مضان المجهري متحد البؤر والتفكير 3. نحن تتميز توسيع HSPCs EGFP ملحوظ في BM، ولكن استخدام واحد فقط FP يمنع تحليل تجديد على مستوى النسيلي. مؤخرا جدا ونحن استغل Lentiviral جين الأنطولوجيا (ليغو) ناقلات التعبير جوهري فلوريداالبروتينات uorescent (FPS) لمارك خلايا 4،5 بكفاءة. شارك في تنبيغ HSPC مع 3 أو 5 ناقلات يولد لوحة متنوعة من الألوان اندماجي، مما يسمح تتبع متعددة استنساخ HSPC الفردية.

تميزت HSPC جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا التصوير الجديدة يسمح لتتبع الأفراد صاروخ موجه HSPC وengraftment في BM من الفئران المعرضة للإشعاع. واستخدمت ناقلات ليغو للاحتفال HSPC مع 3 أو 5 ضباط مختلفة (من فندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، وmCherry) واتبع engraftment على مر الزمن في BM بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر و2 الفوتون، مما يسمح التصور الواضح من العظام وغيرها هياكل مصفوفة، والعلاقة من الحيوانات المستنسخة HSPC لمكونات المكروية بهم. تم تنقيته HSPC والخلايا السلبية النسب من C57BL / 6 الفئران BM، transduced مع ناقلات ليغو، وreinfused بواسطة ذيل حقن الوريد حيز ذاب myelo الفئران مسانج. من خلال رصد كميات كبيرة من الأنسجة القص BM نحن تصور engraftment عظمي تحدث في وقت مبكرBM التجدد. ظهرت مجموعات الخلايا مع لون الأطياف المتنوعة في البداية على مقربة من العظام وتقدما مركزيا مع مرور الوقت. ومن المثير للاهتمام، وبعد أكثر من 3 أسابيع يتكون نخاع مجموعات نسيلي العيانية، مما يشير إلى انتشار تكون الدم المستمدة من HSPCs فرد متاخم في نخاع، بدلا من نشرها على نطاق واسع من HSPCs عبر مجرى الدم. كان هناك أقل تنوع الألوان في نقاط زمنية متأخرة، مما يشير إلى صعوبة في transducing طويلة الأجل إعادة إسكانها الخلايا مع ناقلات متعددة.

بالإضافة إلى ذلك، شكلت مجموعات HSPCs في الطحال، جهازا مسؤولا أيضا عن تكون الدم في الفئران. يمكن أن تحل الخلايا الفردية المستمدة HPSC في الغدة الصعترية، والعقد اللمفاوية والطحال والكبد والرئة والقلب والجلد والعضلات والهيكل العظمي، الأنسجة الدهنية، والكلى أيضا. صور 3D يمكن تقييم نوعيا وكميا لتقدير توزيع الخلايا مع الاضطرابات الحد الأدنى من الأنسجة. وأخيرا، فإننا توضيحد جدوى دراسات ديناميكية حية في 4D من خلال الجمع بين الرنانة multiphoton المسح الضوئي ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير. هذه المنهجية تمكن غير الغازية ارتفاع القرار، ومتعدد الأبعاد تتبع خلية من خلايا مصير السكان طيفيا تميز في الهندسة المعمارية 3D سليمة، وتوفير أداة قوية في دراسة تجديد الأنسجة وعلم الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتم إيواء جميع الفئران والتعامل معها وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة، والمسجلين في البروتوكول وافقت جنة رعاية واستخدام NHLBI الحيوانية. أنثى B6.SJL-Ptprc (د) Pep3 (ب) / BoyJ (B6.SJL) وC57BL / 6 الفئران، 6-12 أسابيع من العمر، استخدمت متبرع والمتلقي، على التوالي.

وترد قائمة المواد والكواشف والمعدات في الجدول 1.

1. ليغو تنبيغ من ماوس HSPCs وزرع النخاع

أداء الإجراءات الموضحة أدناه في مستوى شهادة السلامة الأحيائية 2 (BSL-2) مجلس الوزراء (زراعة الأنسجة هود).

  1. إنتاج ليغو ناقلات ترميز 5FPS
    1. استخدام lentiviral "جين علم الوجود" (ليغو) البلازميدات ناقلات، كل ترميز FP مختلفة من المروج SFFV التأسيسي قوي، بما في ذلك ليغو-Cer2 (فندق Cerulean)، ليغو-G2 (EGFP)، ليغو-V2 (فينوس)، ليغو-T2 (رdTomato)، ويغو-C2 (mCherry) التي تفضلت الدكتور بوريس Fehse (المركز الطبي بجامعة هامبورج إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا). الآن متاح أيضا من Addgene 5-7.
    2. لإنتاج ناقلات ليغو، والبذور 5 × 10 6 293T الخلايا في أطباق 10 سم (12 استخدام أطباق لكل ناقلات) 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن في 8 مل من I10 وسائل الإعلام (IMDM تستكمل مع 10٪ FCS والجلوتامين / البنسلين / الستربتومايسين).
    3. بالنقل الخلايا مع فوسفات الكالسيوم باستخدام معدلة بشكل طفيف توصيات عدة CAPHOS:
      1. لكل لوحة مزيج 15 ميكروغرام متجه ليغو، 12 ميكروغرام pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE، 4 ميكروغرام السابق-TAT، و1 ميكروغرام البلازميدات pMD2.G VSV-G-بحضور 50 ميكرولتر 2.5 M CaCl 2، وإضافة الماء ل تسفر عن إجمالي حجم 500 ميكرولتر.
      2. البلازميدات راسب الحمض النووي مع 500 ميكرولتر من 2X أنواع البسكويت العالي الطاقة (HEPES مخزنة المالحة)، واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة إلى كل لوحة من الخلايا 293T.
      3. احتضان خلايا ل6 ساعة في 37 ° C 5٪ CO 2 الحاضنة. إزالة وسائل الإعلام والثقافة وسائل الإعلام إضافة العذبة آخر 6 ساعة ترنسفكأيشن.
    4. جمع supernatants الثقافة التي تحتوي على جزيئات lentiviral من كل لوحة، يوميا، لمدة 3 أيام. كل مجموعة طاف اليوم التالي اضف الوسائط I10 جديدة لكل لوحة.
      1. تصفية من خلال 0.22 ميكرون المسام وحوض سباحة والتركيز supernatants بواسطة تنبيذ فائق على الدوار SW28 لمدة 2 ساعة في 71،900 x ج و 4 درجات مئوية.
      2. Resuspend وsupernatants في 1 مل من StemSpan سائل الإعلام. قسامة الأسهم lentiviral في 200 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. Lentiviral المعايرة من الجسيمات
    تحديد عيار من ليغو الجسيمات ناقلات في supernatants يتم جمعها عن طريق تحديد الكميات من transducing وحدة / مل باستخدام خلايا NIH3T3. التتر تسمح حساب حجم كل طاف ناقلات اللازمة ليؤدي إلى تعدد النسبي المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) للهدف التجريبيالخلايا.
    1. لوحة 5 × 10 4 NIH3T3 خلايا لكل بئر (لوحة 12 أيضا) في 2 مل من وسائل الإعلام I10 قبل يوم واحد من المعايرة.
    2. إعداد التخفيفات التسلسلية 5 أضعاف من supernatants متجه في وسائل الإعلام I10 تستكمل مع بروتامين سلفات (4 ملغ / مل هو 1،000x).
    3. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا، واستبدالها مع 500 ميكرولتر من التخفيفات طاف تحتوي على ما يعادل 2، 0.8، 0.32، 0.128 وميكرولتر من فيروس المركزة.
    4. تحديد عدد (لا) للخلايا الحالية لكل بئر في الوقت تنبيغ، عد عنصر تحكم واحد أيضا.
    5. 6 ساعة بعد تنبيغ، إضافة 2 مل من وسائل الإعلام I10 واحتضان لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    6. حصاد الخلايا من كل بئر باستخدام التربسين-EDTA، وتحديد النسبة المئوية للخلايا الفلورسنت (٪ FP) عبر التدفق الخلوي.
    7. حساب عيار النحو التالي، حيث بلغ متوسطها التتر تم الحصول عليها لكل بئر (تمييع) مما أدى إلى FP بين 1٪ و 50٪: عيار (جزيئات ناقلات / مل) = لاس٪ FP / حجم طاف ناقلات (مل). متوسط ​​التتر تم الحصول عليها لكل التخفيف إذا كان FP٪ ما بين 1 و 50٪.
  3. الماوس مجموعة خلية، تنقية، تنبيغ، وزرع (كما هو موضح تخطيطي في الشكل 1A تكييفها من Malide وآخرون. 4).
    1. التضحية الفئران المانحة بواسطة إجراء المعتمدة. حصاد نخاع العظم من أطرافه الأمامية والخلفية: تشريح العضد، وعظام الفخذ tibias، وإزالة شاملة في جميع العضلات والأربطة والأنسجة الزائدة من العظام، تتقاطع مع نهاية كل العظام في أقرب وقت ممكن إلى المفاصل، وطرد نخاع العظام من العظم باستخدام إبرة G 27-0 على حقنة تحتوي على وسائل الاعلام I10.
    2. بيليه خلايا نخاع العظم بأكملها لمدة 10 دقيقة في 500 x ج، 4 ° C وليز خلايا الدم الحمراء مرتين مع 50 مل ACK العازلة. خلايا resuspend في 10 مل سائل الإعلام I10.
    3. تنقية نسب سلبية (Lin-) الخلايا الاصلية مع MACS عدة نضوب النسب وفقا لعدة protoco تعديلل:
      1. استخدام 30 ميكرولتر من بلي مكافحة البيوتين بدلا من 10 ميكرولتر / 10 7 خلايا. استكمال خطوات الغسيل مع وسائل الإعلام I2 (IMDM تستكمل مع 2٪ FCS) بدلا من العازلة.
      2. إدراج خطوة غسل واحد بين الحضانة مع كوكتيل البيوتين الأجسام المضادة والحضانة مع مكافحة البيوتين بلي. ويوازن العمود مع I10 بدلا من العازلة.
    4. ثقافة خلايا Lin- لمدة 48 ساعة في مناطق ذات كثافة الانطلاق من 5 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام StemSpan تستكمل مع 10 نانوغرام / مل IL-3 الفئران، و 100 نانوغرام / مل الفئران IL-11، 100 نانوغرام / مل البشري العميد بحري-3 يجند، و 50 نانوغرام / مل الفئران عامل الخلايا الجذعية.
    5. نقل 1-4 × 10 5 خلايا إلى 12 جيدا لوحات مغطاة RetroNectin وتنبيغ مع supernatants ليغو، كل في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 6-7 إلى تحقيق 50٪ كفاءة التعبير لكل FP، في حضور StemSpan وسائل الإعلام والسيتوكينات المفصلة أعلاه و 4 ميكروغرام / مل سلفات بروتامين.
    6. تنبيغ الخلايامع كل متجه ليغو بشكل فردي كما هو موضح في الخطوة 1.3.5 والخلايا مزيج التالية التنبيغ (وهو ما يسمى ميكس) أو زملاء تنبيغ الخلايا مع جميع supernatants 5 ناقلات ليغو في وقت واحد (وهو ما يسمى مجموعة). إزالة الخلايا بعد 24 ساعة، ويغسل مرة واحدة مع StemSpan سائل الإعلام دون السيتوكينات، و resuspend لهم في وسائل الإعلام StemSpan دون السيتوكينات للزرع، أو نقلها إلى وسائل الإعلام الطازجة مع السيتوكينات، والثقافة لمدة 96 ساعة إضافية قبل المجهري متحد البؤر والتدفق الخلوي.
      1. إجراء زرع نخاع العظم عن طريق غرس transduced Lin- HSPCs عبر الذيل حقن الوريد إلى 11 جرعة واحدة غراي المتلقين قبل المشع (6-18 ساعة قبل الزرع) المتلقين، في حجم 100 ميكرولتر، بجرعة خلية في الماوس الموافق 1 خلايا -4 × 10 5 Lin- مطلي أصلا لترنسدوكأيشن. في كل تجربة، وزرع فوج كامل من الحيوانات مع نفس السكان من الخلايا المانحة BM transduced.
      2. لتوصيف في المختبر من transduced Hالبلدان المشمولة بالبرمجة الاستراتيجية والثقافة الخلايا لمدة 4-5 أيام إضافية في StemSpan تستكمل مع السيتوكينات وتحليل التدفق الخلوي لكفاءة ترنسدوكأيشن، وبواسطة المجهر لتنوع الألوان.
        1. التضحية الفئران الفردية واسترداد الأنسجة والأعضاء التصوير، في وقت نقاط مختلفة تصل إلى 120 يوما بعد زرع.
          1. رذاذ مع الايثانول الفراء من الماوس وشق الجلد على الجانب البطني تجنب نشر الشعر.
          2. تشريح والمكوس وفقا للإجراءات القياسية الطحال، الغدد الليمفاوية المأبضية والرئة والقلب والجلد والأنسجة الدهنية والعضلات والهيكل العظمي والكلى والكبد، وكذلك الرأس إلى الوصول إلى calvaria.
          3. بدلا من ذلك، استخدم calvaria أو إنشاء نافذة العظام للتصوير الحي مرارا وتكرارا على مر الزمن 2،8،9 أو صورة أجهزة سطحية مثل الجلد والعقد الليمفاوية في الحيوانات الحية.
        2. وضع الأجهزة الفردية في 35 ملم الأطباق ثقافة الرقم 0 غطاء زجاجي في 50-10056؛ ل PBS لتصوير لهم على حالها دون باجتزاء، تثبيت أو مزيد من المعالجة كما هو موضح في الخطوة 2.5.
        3. للتصوير الحجمي، والحفاظ على الأجهزة في في برنامج تلفزيوني الباردة حتى الاستخدام. عن الوقت الفاصل بين التصوير الشروع فورا في أجهزة التصوير في DMEM، و 10٪ FBS تحتوي على 20 ملي HEPES في 37 ° C

2. متحد البؤر وثنائي الفوتون الميكروسكوب وتحليل الصور

  1. أداء التصوير المجهري باستخدام خمس قنوات متحد البؤر وmultiphoton نظام ايكا SP5 مجهزة متعدد الخطوط الأرجون وديود 561 نانومتر، 594 نانومتر الحنة، والحنة 633 نانومتر ليزر مرئية. استخدام في وضع 2 الفوتون، وهو الفيمتو ثانية نابض تي: الياقوت (تي سا) الليزر، والانضباطي لالإثارة من 680 إلى 1،080 نانومتر مع تصحيح التشتت. استخدام في التجارب التي تنطوي الأحمر تحول إطارا في الثانية (tdTomato وmCherry)، وهو مذبذب حدودي البصرية (OPO) الليزر لتوسيع نطاق الطول الموجي الناتج بقدر 1،030-1،300 نانومتر، أو بالتتابع في وقت واحد مع تيتي انه سا الليزر.
  2. صورة الأنسجة المختلفة باستخدام HCX IRAPO-L-25X / 0.95 NA الهدف غمس المياه (WD = 2.5 ملم)، وعلى PLAPO HC-CS 20X / 0.70 NA الهدف الجاف (WD = 0.6 ملم)، أو HC-PL-40X IRAPO /1.1 NA الهدف الغمر بالماء (WD = 0.6 ملم).
  3. الحصول متحد البؤر مضان أطياف جمع أكوام امدا (xyλ) من الضوء المنبعث في 5 نانومتر عرض الموجات من الطيف المرئي من خلايا BM transduced مع واحد FP يغو ناقلات فضلا عن السيطرة، وليس زرع-BM.
    1. صور عملية مع البرنامج v2.4.1 لايكا LAS-AF لخلق أطياف مرجعية من كل 5 ضباط، فضلا عن تألق ذاتي (الشكل 2A). باستخدام الأطياف FP الفردي والفرق في السطوع مضان (معبرا عنها كنسبة مئوية من EGFP) من فندق Cerulean (79٪)، والزهرة (156٪)، tdTomato (283٪) وmCherry (47٪) ضبط 5 قنوات التصوير متتابعة كما يلي: فندق Cerulean (458 / 468-482 نانومتر)، EGFP (488 / 496-514 نانومتر)، والزهرة (514 / 523-558 نانومتر)، tdTomato (561 / 579-597 نانومتر)، وmCherry (594 / 618-670 نانومتر) (
    2. التحقق من صحة دقيق الفصل إطارا في الثانية، وخلايا transduced مع كل فرد FP مرئية فقط في القناة المقابلة وغائبة عن بقية (الشكل 2C). وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج المحددة متعدد القنوات يخلق فريدة 5 قنوات "colorprint" التي تمكن من تحليل اللون اللاحق وتتبع النسيلي وله ميزة خفض أوقات الاستحواذ مقارنة التصوير الطيفي.
  4. الانبعاثات مضان منفصل، في وضع 2 الفوتون، من خلال الكفاءة العالية المرايا مزدوج اللون مخصصة وجمع مع أربع قنوات غير descanned كاشف (NDD) على النحو التالي: مرآة مزدوج اللون في 568 نانومتر تليها مرآة مزدوج اللون في 465 نانومتر، تلتها و452/45 نانومتر تصفية الانبعاثات لمجموعات المساعدة الذاتية أو تألق ذاتي وفندق Cerulean، مرشح 525/40 نانومتر الانبعاثات لEGFP أو فينوس، و648 نانومتر مزدوج اللون المرآة و620/60 نانومتر تصفية الانبعاثات لtdTomato أو mCherry.
    1. تكشف المعلومات الهيكلية من قبل اثنين من الفوتون المجهري طالتصوير النقيض ntrinsic (كما هو موضح أعلاه) من تألق ذاتي الأنسجة من الإيلاستين، NADH، (متحمس في 780 نانومتر)، والثاني إنشاء إشارة التوافقي (SHG) من العظام والكولاجين لييفي (متحمس في 920 نانومتر أو 860 نانومتر التي تم جمعها في مبعثرة العودة الاتجاه) 10،11.
  5. لتقديم 3D حجم، سلسلة من الصور XYZ (عادة 1 × 1 × 4 ميكرون حجم فوكسل 3) جمع على طول محور ض في 5 ميكرون فترات خلال مجموعة من الأعماق (150-300 ميكرون) في جميع أنحاء نخاع العظام والأنسجة الأخرى، على مناطق واسعة باستخدام وظيفة البلاط من البرنامج لتوليد كميات مخيط تتألف من الحفرة بأكملها القص، ما يقرب من 2.5 × 1.2 مم 2 (س ص) و 300 ميكرومتر (ض) (أرقام 2D-2E) وفيلم 1 تلقائيا.
    1. صورة قبي النخاعية مباشرة من خلال الجمجمة دون باجتزاء 2، 8.
    2. قسم القص على طول المستوى السهمي (التنصيف) ثمعرضيا في المفصل بين 2 القصية الخندق والصورة من خلال خفض الوجه 3،4،12 (لمحة عامة في الشكل 1B مقتبس من ياكاكا وآخرون 3).
  6. ل4D الوقت الفاصل بين التصوير، ومكان رفعه حديثا المأبضية العقدة الليمفاوية والطحال والرئة، أو عينات العظام قبي مختصر على 35 ملم الأطباق ثقافة الرقم 0 ساترة، في 50-100 ميكرولتر DMEM، و 10٪ FBS تحتوي على 20 ملي HEPES في 37 ° C واستخدام 2 الفوتون تي سا الإثارة (860 نانومتر) جنبا إلى جنب مع الإثارة مبائر (458 نانومتر، 488 نانومتر، 514 نانومتر، 561 نانومتر، 594 نانومتر) والماسح الضوئي لايكا الرنانة (8000 هرتز / ثانية)، مع ض مداخن (~ 80 ميكرون) في 20 ثانية فترات لمدة تصل إلى 1 ساعة.
    1. لفي وقت واحد ثلاثة ألوان استخدام التصوير 2P تي سا ضبطها في 860 نانومتر في وقت واحد مع ليزر OPO (ضبطها في 1،130 نانومتر لtdTomato، أو 1،140 نانومتر mCherry) (فيلم 2).
  7. إعادة الإعمار وتحليل وحدات التخزين 3D و 4D متواليات الوقت
    1. استخدام Imaris إلى x64 تحديثات برامج المزودالبيانات هي الخلايا الفلورسنت داخل نخاع العظام والأنسجة المختلفة وتصديرها كما أفلام 3D-تناوب النسخة 7.6، أو حزم البرامج البديلة لتحويل أكوام المغطى من الصور الخام حيز حجم المقدمة (3D)، كما هو موضح سابقا 3،4 (فيلم 1) خطوة بخطوة سبيل المثال:
      1. في Imaris، افتح الصورة ض المكدس. حدد "تفوق" من أجل عرض حجم التصور 3D.
      2. استخدام "تنقل" لتحويل الصوت لنحو 360 درجة.
      3. حدد "الرسوم المتحركة" لخلق الرسوم المتحركة. استخدام الأطر الرئيسية لإضافة وجهات محددة، والتكبير، والتناوب من الحجم؛ معاينة الفيلم، تحرير الضرورة وحفظ الملف في شكل فيلم المطلوب (مثلا: AVI، MOV).
    2. عن التقييم الكمي للخلية واستنساخ تردد 3D، مواقف والأحجام والتوزيع، المزيد من عملية ض المداخن باستخدام وحدات Imaris XT التي تدمج تطبيقات MATLAB أداء الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المسافةurements (باستخدام خوارزمية تحول بعد) ومجموعات التحليل، كما هو موضح سابقا 3،4. تحويل سلاسل من مداخن صورة مع مرور الوقت إلى أربع الأبعاد (4D) الأفلام المقدمة مع حجم Imaris البرمجيات إلى x64، واستخدام بقعة وتحليل السطح لتتبع semiautomated من حركية خلية في ثلاثة أبعاد باستخدام خوارزميات الحركة الانحدار الذاتي.
    3. إجراء تحليل متعدد الأطياف من الخلايا كما يلي: استخراج متعددة الألوان البقع المسمى بإضافة جميع القنوات من 5 إلى قناة الحساب من Imaris XT إلى قناة جديدة؛ تحديد لجميع البقع (خلايا) كثافة مضان يعني في كل من قنوات مكون 5. تصدير القيم في برنامج إكسل لرسم الرسوم البيانية عرض "colorprint" فريدة أي٪ النسبية لكل FP في الخلية الفردية (الشكل 2E الرسم البياني). تصحيح البيانات المحددة للالانجراف الأنسجة، وحساب سرعة الخلية والتشريد على مر الزمن، طول المسار، والمسارات، والمسافات. قيمة الصادرات في Excel البرمجtware لرسم الرسوم البيانية. تجميع الأرقام المركبة مع أدوبي فوتوشوب CSS 5 البرمجيات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكشف كامل جبل 3D متحد البؤر / 2 الفوتون المجهري إعادة البناء من نخاع العظام دوام القصية وengraftment والتوسع في زرع المشارك 5FPS في نمط ذات الخصائص الرائعة: استنساخ بدا محددة بوضوح، وتميز متجانس مع لوحة واسعة من الألوان في البداية والتقدم على مر الزمن لاحتواء تفضيلي خلايا الغالب لون واحد. موضحة متحد البؤر المجهر الإعداد والأمثلة النموذجية على بعلامات 5FPS التصوير HSPC في نخاع العظم القصي في الشكل 2 و أفلام 1 و 2.

إعادة البناء متحد البؤر / 2 الفوتون المجهري كلها جبل 3D الأنسجة سليمة تثبت إمكانية تتبع مصير اللون علامة خلايا BM المشتقة لفترات زمنية ممتدة في الأنسجة الحية. وترد أمثلة تمثيلية من خلايا النخاع العظمي المكونة للدم والمشتقة في غير المكونة للدم زرع في الأجهزة التالية فاي جوري 3.

الشكل 1
الرقم 1. نظرة عامة على الإجراءات التجريبية. أ) توضح الخطوات التخطيطي عزل الخلايا Lin- BM، تنبيغ مع ناقلات ترميز ليغو مجموعة متنوعة من المتغيرات اللون إطارا في الثانية، وإعادة التسريب الخلايا transduced إلى-ذاب myelo الفئران (زرع نخاع العظام). B) نخاع العظام (القص، calvaria )، فضلا عن مختلف الأجهزة / تم فحص الأنسجة بواسطة المجهر متحد البؤر واثنين من الفوتون في نقاط زمنية مختلفة بعد الزرع. لوحة A هو مقتبس من الشكل 1 في Malide وآخرون. 4 و B لوحة مقتبسة من الشكل 1 في ياكاكا وآخرون 3.

2highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم الإعداد 2. متحد البؤر المجهري والمثال التمثيلي للتصوير 5FPS علامة-HSPC في نخاع العظام. A) الطيفية (xyλ) التصوير يستخدم لتسجيل إشارة الأطياف الانبعاثات لكل FP، ويتضح في رسوم بيانية pseudocolored تطبيع مع السماوي (فندق Cerulean)، والأخضر (EGFP) والأصفر (فينوس)، البنفسجي (tdTomato)، والأحمر (mCherry): متحمس بواسطة 594 nm- (خط أحمر الصلبة) مقارنة مع 561 nm- (خط أحمر متقطع) طول الموجة B) خمسة قنوات المقرر أن صورة الانبعاثات بالتتابع من: فندق Cerulean (468-482 نانومتر)، EGFP (496-514 نانومتر)، والزهرة ( 523-558 نانومتر)، tdTomato (579-597 نانومتر) وmCherry (618-670 نانومتر). وحات A و B هي مقتبسة من الشكل 1 في Malide وآخرون. 4 C) التصوير من القصية BM من الفئران المزروعة مع transduced مع ناقلات الفردية FP. كان كل FP مرئيا فقط في الخلايا transduced مع ناقلات المناظر المصورة في الفصل المناسبannel، وغاب عن الآخرين (لا عبر الحديث). D، E) Engraftment والتوسع في زرع المشارك 5FP تميز الخلايا في نخاع العظم في الجسم الحي. في يوم 4 بعد زرع (D) وكانت مجموعات من الخلايا ملحوظ في مجموعة واسعة من الألوان مقربة مرئية إلى حافة العظام (مجموعات المساعدة الذاتية والأبيض)، وتقع تفضيلي المتاخمة للمشترك بين اثنين من الحفرة. بعد يوم 30 (E) واحد استنساخ كبير من لون فريد من نوعه (أخضر - أصفر) وسعت لاحتلال كامل للحفرة كما هو موضح في دمجها وكذلك قنوات الصور واحدة. ضباط تحليل المحتوى يوضح متجانسة بمناسبة بنسبة 2 ضباط المتغيرات EGFP والزهرة.

الرقم 3
الرقم 3. أمثلة على خلايا النخاع العظمي المكونة للدم والمشتقة في غير المكونة للدم زرع الأجهزة التالية. تيس مختلفتم تصوير السويس والأعضاء سليمة من خلال عمق 150-200 ميكرون والمساحات السطحية الكبيرة، مخيط حسابيا والمقدمة في 3D وإعادة البناء الظل. A) العقدة الليمفاوية المأبضية في 120 يوما بعد الزرع يوضح خلايا متناثرة تميزت معظمها في الأصفر (فينوس) و الأحمر (mCherry) تحيط محيطيا من ألياف الكولاجين (الأبيض ومجموعات المساعدة الذاتية). B) وبالمثل، فإن الطحال في نفس الوقت، يعرض مجموعات صغيرة والخلايا المنتشرة في معظمها من ألوان مختلفة تتشابك بواسطة شبكة ألياف الكولاجين. C) في خلايا الكبد مع الفلورسنت تم الانحياز التشكل من موحية الخلايا النجمية، أو الضامة (خلايا كوبفر) من مختلف الألوان على طول شبكة ألياف الكولاجين (SHG أبيض) ترسيم الهياكل مفصص الكبد. D) وفي رفرف الجلد تصويرها من جانب خلايا الجلد الفلورسنت من الألوان والأشكال التضاريسية المتنوعة شوهدت، معظم مع حجم كبير والتشكل مما يدل على هوية انغرهانس أو تشبه شجيري، lyiنانوغرام تحت ألياف الإيلاستين (تألق ذاتي في 780 نانومتر والأبيض) وعلى طول الكولاجين (SHG في 920 نانومتر، أبيض) ألياف العضلات وبصيلات الشعر. E) في قلب ينظر اليها من الجانب النخابية العديد من الخلايا الفردية الفلورسنت كبيرة مع مثل بلعم التشكل منشؤها من استنساخ متعددة على أساس الألوان المتنوعة ينظر مرئية بشكل سطحي وأيضا يتخلل أعمق بين العضلية (أبيض) تصور بحكم جوهري تألق ذاتي ثنائي الفوتون (في 780 نانومتر). لم يلاحظ أي FP العضلية الفلورسنت. الخلايا المجاورة (CE) من نفس اللون تشير إلى انتشار الموقع والهجرة لمسافات قصيرة. F) في الرئة وتناثرت العديد من الخلايا الفلورسنت مع لوحة متنوعة من الألوان في جميع أنحاء هيكل يشبه الدانتيل من ألياف الكولاجين (SHG) في كل عمق في المستويات، مع الأشكال التضاريسية متغير يشير شجيري هويات الخلية، والبلاعم، والنوع 2 خلية رئوية.

الفيلم 1. 3D إعادةكان بناء القصية BM في 4 أيام بعد زرع المشارك 5FPS. مجموعات من الخلايا ملحوظ في مجموعة واسعة من الألوان وضوحا على مقربة من حافة العظام (مجموعات المساعدة الذاتية والأبيض)، وتقع تفضيلي المتاخمة للمشترك بين اثنين من الحفرة. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيلم.

فيلم 2. 4D الفاصل الزمني القصية BM ثنائي الفوتون المجهري وOPO في يوم 39 آخر زرع المشارك 3FPs (فندق Cerulean - أبيض، فينوس - أصفر، tdTomato - أرجواني) العظام (SHG باللون الأبيض). ملاحظة عدة استنساخ ثابتة تميزت باللون الأصفر أو الأصفر، أرجواني مزيج المجاور للعظم على النقيض من خلايا الدم النخاعي السلف الفردية متحركة للغاية. يرجى النقر هنا لمشاهدة هذا الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفنا هنا تفاصيل منهجية قوية وضعت مؤخرا لتتبع خلية نسيلي، والجمع بين التنوع الكبير التي تولدها بمناسبة اندماجي مع ترميز 5FP ناقلات ليغو والتصوير مع متحد البؤر جنبا إلى جنب و 2 الفوتون المجهري لتحقيق الحجمي والتصوير الديناميكي في الأنسجة الحية. هذا مدد استخدام الألوان استنادا FP علامات الهوية عن طريق تسجيل متحد البؤر الطيفية في 5 "متميزة" قنوات 8 بت. وبالتالي فإن نسبة النسبية للفندق Cerulean، EGFP، الزهرة، tdTomato، mCherry داخل كل خلية يخلق "colorprint" فريدة من نوعها لتحديد النسل نسيلي. وضع العلامات متعدد الألوان بواسطة 5FPS يزيد من لوحة التسمية مع مزيد من التنوع، التي كانت تظهر مفيدة بشكل خاص عند دراسة التوزيع، والاتصالات، وترتيبات القرميد والتفاعلات التنافسية بين الخلايا أو مجموعة من الخلايا من النوع نفسه في عينات الأنسجة الكثيفة. جنبا إلى جنب مع 2 الفوتون الإثارة من الميزات الهيكلية الكامنة في الأنسجة المختلفة وأجهزة، يمكننا تتبع لون تميز الخلايا نسيلي في بيئتهم المحلية من دون الحاجة لتثبيت وباجتزاء البدني. وقد تجلى المظاهرة أن الخلايا ابنة المستمدة من الأسلاف الفردية تحتفظ مميزة "اللون الطباعة" على الرغم من التمايز والانتشار في دراستنا المنشورة، مع مئات من خلايا متباينة وجدت في المستعمرات الفردية في المختبر (كفو) تدل على نفس "colorprint".

هذا النهج يجمع بين فوائد خلية واحدة تحل التصوير عالية الدقة مع باجتزاء البصرية عبر المجهري متحد البؤر. س كبيرة جدا - ذ (مم 2) المناطق من حجم الأنسجة الكثيفة سليمة يمكن فحص عن طريق توليد-الصور القرميد. هذه الصور عالية الدقة من المقاطع البصرية يمكن استخدامها لإعادة بناء الحسابية (تلقائيا و"على ذبابة") مجلدات 3D كاملة من تعقيد كبير لأعماق ~ 30 ميكرون، تضم ~ 20-30 طبقات من الخلايا،الأوعية الدموية والعظام والهياكل الكولاجين. إعادة البناء 3D يمكن استخدامها لتحليل كمي غير الغازية المظهرية التي تهم البيولوجية. واحد التحذير المهم أن نشير إلى أن حجم كبير / التصوير عالية الدقة هو مضيعة للوقت، على سبيل المثال 1 ساعة لكل ~ 1 ملم 3 من الأنسجة (للحفرة واحدة من القص)، لذلك نوصي التصوير لا يزيد عن 1 الماوس في التجربة في اليوم عندما نخاع العظام وكذلك الأنسجة المختلفة تحتاج إلى أن تدرس بالتفصيل.

على الرغم من أنه هو حاليا من المستحيل من الناحية الفنية لصورة نخاع العظم القصي في نفس الفأر مرارا وتكرارا على مر الزمن، ويمكن الحصول على معلومات قيمة من خلال دراسة الفئران الفردية في نقاط زمنية مختلفة من فوج المزروعة أصلا مع نفس السكان من خلايا Lin- ليغو transduced. القص هو موقع ممتاز لدراسة تجديد نخاع العظم بسبب المبكرة وإعادة كاملة للدم، والاستقرار، وسهلة باجتزاء، استنساخ، والحجم الكبير. فمن الأهمية بمكان أن تصل إلى ما يقرب من 50٪ كفاءة ترنسدوكأيشن الخلايا Lin- لكل FP ناقلات الأفراد، قبل الشروع في تجربة زرع والتصوير، من أجل الحصول على ما يكفي من تنوع الألوان وFP-معربا عن الخلايا لجعل تجربة غنية بالمعلومات. سيكون هناك دائما التحذير من أن استنساخ أكثر من واحد قد بالصدفة في نهاية المطاف مع colorprints مماثلة أو مطابقة، وخاصة إذا التنبيغ هي خلايا غير فعالة ولها العديد من واحد فقط أو اثنين من الإدراج. ومن المهم أيضا أن تكون واثقا أن كل حقن الوريد الذيل الفردي تسليم ما يقرب من 100٪ من الجرعة الخلية.

هذا يثبت جدوى عالية الدقة 4D العيش الدراسات الديناميكية من خلال الجمع بين الرنانة multiphoton المسح الضوئي ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير. فإنه لا يسمح توصيف ثابت لمختلف الحيوانات المستنسخة ولكن أيضا تحليل الاختلافات بين الخلايا الحركية تميزت نفس اللون. وعلاوة على ذلك يدل على معدل الفيديو 4D التصوير من ثلاث عينات المسمى ضباط توظيف سوccessfully جنبا إلى جنب تيزا وOPO الليزر لأعلى كفاءة، أقل ضررا، واختراق أعمق من الأنسجة الحية، مما يمهد الطريق ل2 الفوتون التصوير حيوي داخلي. بالإضافة إلى ذلك، يضع خيارا قيما لتعقب الخلايا على مدى فترات طويلة (أشهر) التغلب على القيود القائمة على صبغ الحالية. يستخدم هذا النهج متحد البؤر المجهر ومتوفرة تجاريا ليزر ثنائي الفوتون وطرق تحليل الصور المستخدم التفاعلي الآلي على أساس مجموعة من البرامج المتاحة تجاريا يسمح سهل التنفيذ في منشآت المجهري المعتاد.

أخيرا، هذه المنهجية لا يقتصر على تحليل HSPCs. العديد من النظم البيولوجية يمكن أن تستفيد من القدرة على حل الترتيبات الزمانية المكانية من العناصر الخلوية والهيكلية المعقدة clonally عبر الوسم متعدد الألوان ومتحد البؤر والتصوير 2 الفوتون. يمكن استجوابه تجديد الجهاز، الاستجابات المناعية، والورم النقيلي أنماط، تشير إلى عدد قليل من التطبيقات المحتملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Production of Viruses
LeGO-Cer2 Addgene 27338 Expression of Cerulean
LeGO-G2 Addgene 25917 Expression of eGFP
LeGO-V2 Addgene 27340 Expression of Venus
LeGO-T2 Addgene 27342 Expression of tdTomato
LeGO-C2 Addgene 27339 Expression of mCherry
Calciumm Phosphate Transfection Kit Sigma CAPHOS-1KT
Tissue culture dish BD Falcon 353003
IMDM Gibco, Life Technology 12440-053
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma F4135-500ML
Pen Strep Glutamine Gibco, Life Technology 10378-016
Centrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW28 Ultracentrifuge Beckman Coulter L60
Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) Millipore SLGS033SS
Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation
ACK lysing buffer Quality Biologicals Inc. 118-156-101
Lineage Cell Depletion Kit (mouse) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-090-858
LS columns + tubes Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-306
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-407
StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) StemCell Technologies Inc  9650
Murine IL-11 CF R & D Systems Inc 418-ML-025/CF 100 µg/ml is 1,000x
Recombinant murine SCF RDI Division of Fitzgerald Industries Intl  RDI-2503 100 µg/ml is 2,000x
Recombinant murine IL-3 R & D Systems Inc 403-ML-050 20 µg/ml is 2,000x
FLT-3 Ligand Miltenyi Biotec Inc. USA 130-096-480 100 µg/ml is 1,000x
12-well plates, Costar Corning Inc. 3527
Retronectin Takara Bio Inc T100A/B Resuspend at 50 µg/ml
Protamine Sulfate Sigma P-4020 4 µg/ml is 1,000x
Confocal and Two-photon Microscopy
DMEM Lonza 12-614F
1 M Hepes Cellgro, Mediatech Inc. 25-060-CI
Glass bottom culture dish P35G-0-20-C MatTek Corporation P35G-0-20-C
Glass bottom culture dish P35G-0-14-C MatTek Corporation P35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well Thermo Scientific 155383
Coverslips 22 mm No 2 Thomas Scientific 6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope Leica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm Coherent
Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm Coherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
Imaris software version 7.6 Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
  2. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
  3. Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
  4. Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
  6. Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
  7. Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
  8. Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
  9. Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
  10. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
  11. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  12. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).

Tags

بيولوجيا الخلايا الجذعية، العدد 90، والتصوير ليغو، وتتبع النسيلي، البروتينات الفلورية، المجهري متحد البؤر، multiphoton المجهري، تكون الدم، ناقلات lentiviral، والخلايا الجذعية المكونة للدم
<em>في الجسم الحي</em> تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malide, D., Métais, J. Y.,… More

Malide, D., Métais, J. Y., Dunbar, C. E. In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51669, doi:10.3791/51669 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter