Summary
造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。
Abstract
私たちは、開発し、マウスの骨髄移植実験モデルを用いたin vivoでの造血に勉強する高い空間および時間分解能で、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）のクローン追跡のための方法論を蛍光マーキングを検証しました。蛍光タンパク質をコードするレンチウイルスベクターを用いてマーキング遺伝子コンビナトリアル（FPS）は、高度な顕微鏡撮影により細胞運命マッピングを可能にした。五つの異なるFPをコードするベクター：セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、そしてmCherryをカラーマークされたセルの多様なパレットを作成し、同時にHSPCsを伝達するために使用された。共焦点/ 2光子ハイブリッド顕微鏡を用いて画像化は、同時高解像度一意にマークされた細胞の評価と組織の構造部品に関連してその子孫を可能にします。スペクトル的に符号化されたHSPC由来細胞は、骨髄（BM含むさまざまな無傷の組織に非侵襲的に検出することができる体積が大きい面積にわたって分析明らかにする）、移植後の時間の広範な期間について。 4Dにビデオレートの多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせたライブの研究では、定量的にダイナミックな細胞およびクローン追跡の可能性を実証している。
Introduction
血液細胞の産生、造血と呼ばれるが、造血幹細胞および前駆細胞（HSPCs）の小集団によって維持される。これらの細胞はすべて、自己再生および分化1,2の制御に関与し、骨芽細胞、間質細胞、脂肪組織、及び血管構造からなる複合微小環境ニッチにおける骨髄（BM）内に存在する。無傷のBMは直接観察に伝統的にアクセスできなくなっているように、HSPCとその微小環境との相互作用は、生体内での大部分は未同定のまま。以前は、私たちは共焦点蛍光および反射顕微鏡3を使用して、無傷のBMの3次元構造を可視化する方法論を確立した。私たちは、BM中のEGFP-マークHSPCsの拡大を特徴とするが、単一のFPの使用は、クローンレベルでの再生の分析を排除。ごく最近、私たちは、構成的にFLを発現するレンチウイルス遺伝子オントロジー（LEGO）ベクターを利用しました効率的に細胞4,5をマークするuorescentタンパク質（FPS）。 3または5ベクターとHSPCの共同形質導入は、複数の個別HSPCクローンの追跡を可能にする、組み合わせの色の多様なパレットを生成します。
マークの新しいイメージング技術と組み合わせたHSPCは、照射されたマウスのBM中の個別のHSPCホーミングおよび生着をトレースすることを許可。 LEGOベクターは、骨やその他の明確な可視化を可能にする、（セルリアン、EGFP、金星、tdTomato、およびmCherryをから）3または5異なるのFPにHSPCをマークし、共焦点および2光子顕微鏡によるBM中の時間をかけて彼らの生着に従うために使用されたマトリックス構造、及びそれらの微小環境の成分にHSPCクローンの関係。 HSPCはLEGOベクターで形質導入したC57BL / 6マウスのBMからの系統陰性細胞、のように精製し、そして骨髄アブレーションコンジェニックマウスに尾静脈注射によって再注入された。胸骨骨髄組織を大量に監視することにより、私たちは、初めに発生した骨内膜移植を可視化BMの再生。多様な色のスペクトルを有する細胞クラスターは、骨に近接して、最初に登場し、時間をかけて集中的に進行した。興味深いことに、3週間以上後に骨髄ではなく、血流を介してHSPCsの広範な普及よりも、連続して骨髄中の個別HSPCsから派生造血の広がりを示唆し、巨視的なクローンのクラスタで構成されていた。後半の時点ではあまり色の多様性は、複数のベクターとの長期的な再増殖細胞に形質導入することが困難で示唆がありました。
また、HSPCsは、脾臓において、マウスにおける造血を担う臓器をクラスターを形成した。 HPSC由来の個体の細胞は、同様に、胸腺、リンパ節、脾臓、肝臓、肺、心臓、皮膚、骨格筋、脂肪組織、および腎臓において解決することができる。 3D画像は、組織の最小限の摂動を有する細胞の分布を理解するために定性的および定量的に評価することができる。最後に、説明共振スキャニング多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせることにより、4Dでのライブの動的試験のdの実現可能性。この方法論は、組織再生および病理学の研究で強力なツールを提供し、彼らの無傷の3Dアーキテクチャでスペクトル的にマークされた細胞集団の非侵襲的な高解像度、多次元細胞運命のトレースを可能にします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
全てのマウスを飼育し、取り扱う国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って、およびNHLBI動物実験委員会が承認したプロトコルに登録された。雌B6.SJL-Ptprc（d）は6-12週齢PEP3（b）に/ BoyJ（B6.SJL）およびC57BL / 6マウスを、それぞれ、ドナーとレシピエントとして使用した。
材料、試薬、および機器のリストを表1に提供される。
マウスHSPCs 1。LEGO伝達および骨髄移植
認定されたバイオセーフティーレベル2（BSL-2）キャビネット（組織培養フード）に以下の手順を実行します。
- LEGOベクターのエンコーディング5FPSの生産
- レンチウイルス「遺伝子オントロジー」（LEGO）ベクタープラスミドを使用してくださいLEGO-CER2（セルリアン）、レゴ-G2（EGFP）、レゴ-V2（金星）、レゴ-T2などの強力な構成SFFVプロモーターから異なるFPをコードする各（TdTomato）、そして親切に博士ボリスFehse（大学医療センターハンブルク·エッペンドルフ、ハンブルグ、ドイツ）により提供さLEGO-C2（mCherryを）; Addgene 5-7からも利用可能になりました。
- I10メディア8mlにLEGOベクトル、トランスフェクション前に10cmの皿（各ベクトルのための12の皿を使用）、24時間でのシード5×10 6個の293T細胞を作製するために、（IMDM、10％FCS及びグルタミン/ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）。
- わずかに変更されたCAPHOSキットの推奨を使用して、リン酸カルシウムと細胞をトランスフェクション：
- 各プレートミックス15μgのレゴベクトルの場合、12μgのpCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE、4μgのPREV-TAT、および1μgpMD2.G-VSV-Gプラスミドを50μlの2.5MのCaCl 2の存在下で、および水を加える500μlの総容量が得られます。
- 2×HEBS（HEPES緩衝生理食塩水）500μlのプラスミドDNAを沈殿させ、前293T細胞の各プレートに添加する室温で20分間インキュベートする。
- のために細胞をインキュベート37℃、5％CO 2インキュベーター中で6時間;メディアを取り出し、新鮮な培養培地6時間後に、トランスフェクションを追加します。
- 3日間、毎日、各プレートからレンチウイルス粒子を含む培養上清を収集します。毎日、以下の上清の収集を各プレートに新鮮I10メディアを追加します。
- 0.22μmの細孔を、プールを通して濾過し、71900×gで、4℃で2時間SW28ローターに超遠心分離によって上清を集中。
- ステムスパン培地1 mlの上清を再懸濁する。 -80℃で200μlの、店舗でのレンチウイルス株を分注し。
- レンチウイルス粒子の滴定
NIH3T3細胞を用いて、単位/ mlに形質導入の定量を介して収集上清中のレゴベクター粒子の力価を決定します。力価は、実験対象のための感染（MOI）の所望の相対多数になるために必要な各ベクトル上清の体積を計算することができ細胞。- プレート1日滴定前I10メディア2ml中のウェル（12ウェルプレート）当たり5×10 4 NIH3T3細胞。
- （4 mg / mlのは1,000倍である）、硫酸プロタミンを補充したI10メディアのベクトル上清の5倍連続希釈液を調製する。
- 細胞から培地を除去し、濃縮したウイルスの2、0.8、0.32、及び0.128μlのと同等のものを含む上清の希釈液を500μlと交換してください。
- うまくつのコントロールを数える、形質導入の際にウェル当たり存在する細胞数（なし）を決定します。
- 形質導入後6時間、I10培地2 mlを追加し、37°C、5％CO 2で3日間インキュベートする。
- 各ウェルトリプシン-EDTAを使用してから細胞を採取し、フローサイトメトリーを介した蛍光細胞の割合（％FP）を決定。
- 無価（ベクター粒子/ ml）= 1〜50％％のFP結果として各ウェル（希釈）について得られた力価の平均を、以下のような力価を計算するベクター上清（ミリリットル）のX％、FP /音量。 FPは1〜50％の間である％あれば各希釈について得られた力価を平均する。
- マウスの細胞採取、精製、形質導入、および移植（模式的に図1Aに示すがMalide ら 4から採用）。
- 承認された手順により、ドナーマウスを生け贄に捧げる。前部と後部の手足から収穫骨髄：、上腕骨、大腿骨と脛骨を解剖徹底的に骨からすべての筋肉、靭帯および余分な組織を除去し、関節にできるだけ近い各骨の終わりを横断し、外に骨髄をフラッシュI10メディアを入れた注射器に27-0 Gの針を用いて骨。
- 500×gで、4℃で10分間、全骨髄細胞をペレット化し、50mlのACK緩衝液で2回赤血球を溶解。 10ミリリットルI10培地中の細胞を再懸濁。
- 修正されたキットのprotocoに従って、MACS系統枯渇キットで系統陰性（リニア）前駆細胞を精製L：
- 抗ビオチンマイクロビーズ30μlの代わりに10μlの/ 10 7個の細胞を使用してください。 I2メディア（2％FCSを添加したIMDM）の代わりに緩衝液での洗浄ステップを完了します。
- ビオチン抗体カクテルとのインキュベーションと抗ビオチンマイクロビーズとのインキュベーションの間に1つの洗浄工程を挿入します。とI10の代わりに緩衝液を用いてカラムを平衡化。
- 10ng / mlのネズミIL-3、100ng / mlのネズミIL-11、100ng / mlのヒト体Flt-3を補充したステムスパン培地中で5×10 5細胞/ mlの出発密度で48時間培養リニア細胞リガンド、および50ng / mlのマウス幹細胞因子。
- レトロネクチンでコーティングした12ウェルプレートに移す1〜5×10 4個の細胞およびステムスパンの存在下で、それぞれのFPのための50％の発現効率を達成するために6-7のLEGO上清を、感染多重度での各（MOI）で形質導入するメディアやサイトカインは、上記に詳述し、4 / mlの硫酸プロタミン。
- 細胞を形質導入各LEGOベクターによる個別同時にすべて5 LEGOベクター上清と共に形質導入（ミックスと呼ばれる）または共形質導入細胞を、次のステップ1.3.5で説明して混合細胞など（株と呼ばれる）。 、24時間後に細胞を除去するサイトカインずにステムスパンメディアで1回洗浄し、移植のためのサイトカインなしにステムスパンメディアで再懸濁し、またはサイトカインで新鮮な培地に転送し、さらに96時間の培養、共焦点顕微鏡の前およびフローサイトメトリー。
- 1に対応したマウスあたり細胞用量で、100μlの容量で、11 Gyの単回投与前の放射線照射レシピエント（6-18時間移植前の）レシピエントに尾静脈注射を介して伝達リニアHSPCsを注入することにより、骨髄移植を行います-4×10 5リニアもともと形質導入のためにプレーティングした細胞。各実験において、形質導入されたドナーBM細胞の同じ集団での動物のコホート全体を移植。
- 形質導入されたH のin vitro特徴付けのためSPCはは、文化ステムスパンで追加の4-5日間、細胞がサイトカインを補充し、導入効率のために、フローサイトメトリーによって分析して、色の多様性のための顕微鏡法による。
- 個別のマウスを犠牲にし、さまざまな時間は、移植後120日までの時点で、イメージングのための組織や臓器を取り出す。
- エタノールでマウスの毛皮をスプレーし、髪の普及を回避腹側の皮膚を切開。
- 標準的な手順脾臓、膝窩リンパ節、肺、心臓、皮膚、脂肪組織、骨格筋、腎臓、肝臓だけでなく、頭蓋冠へのアクセスへのヘッドによれば解剖と消費税。
- または、頭蓋冠を使用するか、またはそのような生きた動物での皮膚やリンパ節などの時間2,8,9-や画像、表在臓器にわたって繰り返し、ライブイメージングのための骨のウィンドウを設定します。
- 50-100で35ミリメートル数0カバーガラス培養皿に、個別の器官を配置56;ステップ2.5で説明したように、切片、固定またはさらなる処理なし無傷でそれらを画像化するためのPBS。
- ボリュームイメージングのために、冷PBS中で使用するまで臓器をしてください。タイムラプスイメージングのために、20mMのHEPESを含有する10％FBS、37℃でDMEM中で臓器を画像化するに直ちに進む
- 個別のマウスを犠牲にし、さまざまな時間は、移植後120日までの時点で、イメージングのための組織や臓器を取り出す。
2共焦点と二光子顕微鏡と画像解析
- マルチラインアルゴン、ダイオード561 nmのヘリウムネオン594ナノメートル、およびヘリウムネオン633nmの可視光レーザーを搭載したライカSP5 5チャンネル共焦点および多光子システムを使用して、顕微鏡イメージングを実行します。 680から分散補正と1,080 nmの励起用サファイアチタン（Ti-SA）レーザー、波長可変：2光子モード、パルス状のフェムト秒チタンで使用してください。 tと共に順次または同時に、1,030-1,300 nmのものであれば、出力波長範囲を拡張するために赤色にシフトしたFP（tdTomatoおよびmCherryを）、光パラメトリック発振器（OPO）レーザーを含む実験で使用のTi-Saのレーザー彼。
- HCX-IRAPO-L 25X / 0.95 NA水浸漬対物レンズ（WD = 2.5ミリメートル）、HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA乾燥対物レンズ（WD = 0.6ミリメートル）、またはHC-PL-IRAPO 40Xを用いた画像さまざまな組織/1.1 NA水浸対物レンズ（WD = 0.6 mm）である。
- コントロールのと同様に、単一のFP LEGOベクターで形質導入骨髄細胞から可視スペクトルの5nmの帯域幅で発光した光のラムダスタック（xyλ）を収集し、共焦点蛍光スペクトルを取得し、BMを移植しない。
- ライカLAS-AFのV2.4.1ソフトウェアとプロセスイメージは、すべて5 FPの参照スペクトルだけでなく、自家蛍光のように（ 図2A）を作成する。個別のFPスペクトルおよび蛍光の明るさの差を使用して次のように5シーケンシャルイメージングチャネルを設定セルリアン（79％）、金星（156mg％）、tdTomato（283％）およびmCherryを（47％）の（EGFPの％として表される）。セルリアン（458/468から482 nm）を、EGFP（488/496から514 nm）を、ヴィーナス（514/523から558 nm）で、tdTomato（561/579から597 nm）を、そしてmCherryを（594/618から670 nm）を（
- 各個別のFPで形質導入された細胞が残ります（ 図2C）からのみ対応するチャネルに表示して存在しないように、正確なfpsの分離を検証します。また、この定義されたマルチチャネルアプローチは、その後の色分析およびクローン追跡を可能にし、スペクトルイメージングと比較して、取得時間を減少させるという利点を有するユニークな5チャンネル "colorprint」を作成する。
- ライカLAS-AFのV2.4.1ソフトウェアとプロセスイメージは、すべて5 FPの参照スペクトルだけでなく、自家蛍光のように（ 図2A）を作成する。個別のFPスペクトルおよび蛍光の明るさの差を使用して次のように5シーケンシャルイメージングチャネルを設定セルリアン（79％）、金星（156mg％）、tdTomato（283％）およびmCherryを（47％）の（EGFPの％として表される）。セルリアン（458/468から482 nm）を、EGFP（488/496から514 nm）を、ヴィーナス（514/523から558 nm）で、tdTomato（561/579から597 nm）を、そしてmCherryを（594/618から670 nm）を（
- 高効率のカスタムダイクロイックミラーによる2光子モードでの個別の蛍光発光、および以下のように非デスキャン検出器（NDD）、4つのチャネルで収集し、続いて465 nmのダイクロイックミラーに続く568 nmのダイクロイックミラーを、 SHGまたは自己蛍光及びセルリアンための45分の452 nmの発光フィルター、EGFPや金星のための40分の525 nmの発光フィルター、および648 nmのダイクロイックミラーとtdTomatoまたはmCherryをするための60分の620 nmの発光フィルター。
- 二光子顕微鏡iで構造情報を明らかにするntrinsicコントラストエラスチンからの組織自己蛍光画像化（上述のように）、NADH、（780で励起）であり、第2高調波は、骨および後方散乱収集920 nm以上860 nmでの線維性コラーゲン（興奮からの信号（SHG）を生成し方向）10,11。
- 3Dボリュームレンダリングのために、骨髄およびその他の組織全体の深さの範囲（150〜300ミクロン）上に5μmの間隔で、z軸に沿ってのxyz一連の画像（典型的には1×1×4μmの3ボクセルサイズ）を収集し、大規模な、全体を自動的胸骨窩を備えたステッチのボリュームを生成するために、約2.5×1.2ミリメートル2（XY）と300μmの（z）が（ 図2D-2E）のソフトウエアのタイル機能を利用して地域やムービー1オーバー。
- 画像は2,8を区画することなく頭蓋骨を介して直接、骨髄頭蓋冠。
- 矢状面（二分）に沿ってセクション胸骨、その後横方向に切断面3,4,12を通じて2胸骨堀と画像の間の共同で（ 図1（b）の概要高久ら 3から採用）。
- 4Dタイムラプスイメージングのために、50〜100μlのDMEM、37℃で20mMのHEPESを含有する10％FBS中、35ミリメートル番号0カバーガラス培養皿上に新たに切除した膝窩リンパ節、脾臓、肺、または頭蓋冠骨サンプルノーカットを配置と〜（Z-スタックを取って、共焦点励起（458 nmの488 nmの514 nmの561 nmの594 nm）であり、ライカレゾナントスキャナ（8000ヘルツ/秒）と組み合わせた2光子のTi-Saの励起（860 nm）を使用し最大で1時間20秒間隔で80程度）。
- （ 動画2）同時3色2Pイメージング用のTi-Saが860 OPOの（または1140 nmのmCherryをtdTomatoのための1,130 nmのチューニング）レーザーと同時にnmでチューニングしてください。
- 3Dボリュームと4Dの時間シーケンスの再構築と分析
- Imaris x64のSOFTWを使用して、バージョン7.6、または代替ソフトウェアパッケージ骨髄および異なる組織内部の蛍光細胞のボリュームレンダリング（3D）データへの生画像のタイル張り·スタックを変換すると、以前に3,4に記載されているように、3D回転ムービーとして書き出すべきである（ 動画1）ステップバイステップの例：
- Imarisでは、zスタック画像を開きます。選択3Dボリューム視覚化を表示するために「サーパス」。
- 360°の周りにボリュームを回すために、「ナビゲート」を使用します。
- アニメーションを作成する「アニメーション」を選択します。選択したビュー、ズーム、ボリュームの回転を追加するために、キーフレームを使用します。ムービーをプレビュー、必要に応じて編集し、目的のムービー形式でファイルを保存します（例：AVI、MOV）。
- 3D細胞とクローン周波数、位置、大きさや分布の定量的評価、さらにプロセスの場合、距離MEASを実行するMATLABアプリケーションを統合Imaris XTモジュールを使用してのzスタック以前3,4に記載のように（距離変換アルゴリズムを使用して）urementsおよびクラスター分析。 Imaris x64のソフトウェアとボリュームレンダリング四次元（4D）ムービーに時間をかけて画像スタックのシーケンスを変換し、自己回帰移動アルゴリズムを用いて3次元的に細胞運動の半自動トラッキングスポットと表面解析を使用しています。
- 次のように細胞のマルチスペクトル分析を実行します。新しいチャネルにImaris XTのチャンネル演算を介してすべての5つのチャネルを追加することによって、マルチカラーラベルスポットを抽出する。全てのスポット（セル）5成分のチャネルのそれぞれの平均輝度蛍光を決定する。個別のセル内の各FP（図2Eグラフ）の相対％ すなわちユニークな「colorprint」を表示するグラフをプロットするためにExcelソフトウェア内の値をエクスポートします。組織ドリフトを設定されたデータを修正して、セル速度と変位時間をかけて、トラックの長さ、パス、および距離を計算。 ExcelのSOFにおける輸出額グラフをプロットするtware。 Adobe PhotoshopのCSS 5ソフトウェアを使用して複合図形を組み立てます。
- Imaris x64のSOFTWを使用して、バージョン7.6、または代替ソフトウェアパッケージ骨髄および異なる組織内部の蛍光細胞のボリュームレンダリング（3D）データへの生画像のタイル張り·スタックを変換すると、以前に3,4に記載されているように、3D回転ムービーとして書き出すべきである（ 動画1）ステップバイステップの例：
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
胸骨骨髄時間経過の全体マウント3D共焦点/ 2光子顕微鏡再構成が顕著な特性を有するパターンにおける移植共同5FPSの生着·拡大を明らかにした：クローンは、均一に広い、最初は色のパレットと進歩が付いて、線引きを明確に現われ時間をかけて優先的に主に一つの色のセルが含まれています。共焦点顕微鏡のセットアップ及び胸骨の骨髄における撮像5FPSマーキングHSPCの代表例を図2及びビデオが1及び2に示されている。
無傷の組織の3次元共焦点/ 2光子顕微鏡の再構成を全載色の運命を追跡する可能性が生組織における長期間のための骨髄由来の細胞をマークし実証する。移植後の造血および非造血器官における骨髄由来細胞の代表的な例は、Fiが示されているグレ3。
実験手順の1。概要図。 A）は回路図の手順では、へ-骨髄アブレーションマウス（骨髄移植）リニアBM細胞の単離、fpsの色変異体の多様なエンコードLEGOベクターを用いた形質導入し、形質導入された細胞の再注入を説明する。B）骨髄（胸骨、頭蓋冠を）、並びにさまざまな臓器/組織移植後の異なる時点での共焦点及び二光子顕微鏡で観察した。パネルAは、Malide ら 4の図1から適合され、パネルBは、高久ら 3に、図1から適応。
2highres.jpg "幅=" 600 "/>
イメージングのために、図2の共焦点顕微鏡のセットアップおよび代表的な例は、骨髄にHSPCを5FPSは、マークされた。 A）スペクトル（xyλ）イメージングは、それぞれ黄色、緑色、シアン（セルリアンで疑似カラー正規化されたヒストグラムに示さFP）、（EGFP）、（金星）、マゼンタ（tdTomato）、赤色（mCherryを）するための基準発光スペクトルを記録するために使用される：興奮と比較して、594 NM-（赤い実線）による561 NM-（赤い点線）の波長B）の画像を順次発光に設定し、5チャンネル：セルリアン（468から482 nm）を、EGFP（496から514 nm）を、金星（ 523から558 nm）で、tdTomato（579から597 nm）をmCherryを（618から670ナノメートル）。パネルAおよびBはMalide らの図1から適合されている。個別FPベクターで形質導入を移植したマウスからのBM胸骨の4 C）イメージング。各FPは、適切なchの時に結像される対応するベクターで形質導入した細胞で見られたannel、その他（無クロストーク）を欠席。D、E）の生着移植共同5FPの拡大は、 生体内で骨髄中の細胞をマーク。一日では多種多様な色でマークされたセルの4移植後（D）クラスタは、優先的に2窩の間のジョイントに隣接して位置する骨端（SHG、白）、に見えるすぐ近くだった。 30日目では、（E）固有の色（緑-黄）の一つの大きなクローンはマージさだけでなく、シングルチャンネル画像に示すように、全体窩を占めるように拡大してきました。 FPのコンテンツ分析は、2のFP EGFPおよび金星変異によるマーキング均質を示しています。
移植後の造血および非造血器官における骨髄由来細胞の図3の例。各種TIS提訴や臓器が150-200程度と大きな表面積の深さを通してインタクト画像化し、計算的にステッチおよび120日後に移植のほとんどが黄色（金星でマーク散在細胞を実証する）とで影の再構成。A）膝窩リンパ節などの3Dでレンダリングされた末梢コラーゲン線維（白、SHG）。B）に囲まれた赤（mCherryを）は、同様に、同時に脾臓は、小さなクラスターおよび肝臓蛍光細胞とでは、コラーゲン線維網。C）によって絡み合って各色の大部分は散乱細胞を表示するさまざまな色の星状細胞、またはマクロファージ（クッパー細胞）を示唆する形態は、見られた多様な色および形態の真皮側蛍光細胞から撮像皮膚弁では、肝小葉の構造。D）を描く（SHG白）コラーゲン繊維網に沿って整列し、ランゲルハンスまたは樹状のアイデンティティを示唆して大きなサイズと形態のほとんど、LYIエラスチン繊維（780 nmでの自家蛍光、白）の下で、筋肉の繊維と毛包（920ナノメートル、白でSHG）コラーゲンに沿ってngの。E）心外膜側から見た心臓由来のマクロファージ様の形態を有する多数の個別の大型蛍光細胞は、見て多様な色に基づいて複数のクローンからの可視表面的にも散在して、より深い（780 nmで）彼らの本質的な二光子自己蛍光により可視化した心筋細胞（白）の間である。いいえFP蛍光心筋細胞は観察されなかった。同じ色の近隣の細胞（CE）はその場での増殖と近距離移動に示唆している。F）は 、肺内の色の多様なパレットを有する多数の蛍光細胞は、すべての深さでのコラーゲン線維（SHG）のレース状の構造全体に散在していた樹状細胞、マクロファージ、および2型肺細胞のアイデンティティを示唆可変形態を有するレベル。
ムービー1。3Dの再胸骨BMの建設4日目の移植後のCo 5FPS。多種多様な色でマークされたセルのクラスタが優先的に2窩の間のジョイントに隣接して位置する骨端（SHG、白）、に近接して見えた。 こちらをクリックしてくださいこのムービーを表示します。
ムービー2。4Dタイムラプス胸骨BM二光子と39日、移植後のCo 3FPs（セルリアン-白、金星-黄、tdTomato -マゼンタ） でOPO顕微鏡骨（白SHG）。黄色や運動性の高い個別の骨髄性前駆細胞とは対照的に、骨に隣接する黄マゼンタの組み合わせでマークされたいくつかの静的なクローンを注意してください。 このムービーを見るにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
私たちは、生きた組織で、体積とダイナミックイメージングを実現するために、タンデム共焦点および2光子顕微鏡で5FPコードLEGOベクトルおよびイメージングマーキング組合せにより発生する大きな多様性を組み合わせて、ここ最近、クローン細胞の追跡のために考案強力な方法論の詳細を説明します。これは5 "個別の" 8ビットのチャネルでの共焦点分光身元を記録することにより、マーキング、FPベースのカラーの使用を拡張した。従って、各セル内のセルリアン、EGFP、金星、tdTomato、mCherryをの相対比は、クローンの子孫を識別するためのユニークな "colorprint」を作成します。 5FPSによる多色標識は、細胞又は高密度組織サンプル内の同じタイプの細胞群のうち流通、連絡先、タイル張りの手配と競争力の相互作用を研究する場合に特に有用であることが示されたより多くの多様性を、ラベルパレットを向上させます。さまざまな組織の固有の構造的特徴の2光子励起と組み合わせて、臓器は、私たちは、固定および物理的切片を必要とせずに、そのネイティブな環境での色とマーククローン細胞を追跡することができます。個別の前駆細胞に由来した娘細胞が分化·増殖にもかかわらず、独特の「カラー印刷」を保持してデモでは、同じ表示個別のin vitroでのコロニー（CFU）で見つかった分化した細胞の何百も、私たちの発表された研究で実証された「colorprintを。 "
このアプローチは、共焦点顕微鏡を介した光学切片と一緒に高解像度イメージングを解決し、単一セルの利点を兼ね備えています。非常に大きなX - Y（mm 2）と無傷の密な組織容積の領域はタイル張り、画像を生成することによって調べることができる。光学切片からこれらの高解像度画像を計算するために使用することができる（自動的に「オンザフライ」）細胞の〜20〜30層を含む〜30μmの深さに大きな複雑さの完全な3次元ボリュームを再構成する、血管、骨やコラーゲンの構造。 3D再構成は、生物学的関心の形態計測の非侵襲的定量分析のために使用することができる。組織（胸骨の1窩）の〜1ミリメートル3は 、したがって、私たちは、実験ごとにイメージングせいぜい1匹あたりをお勧めにつき指摘する一つの重要な注意点は、大容量/高分解能イメージングは、例えば1時間、時間がかかるということです骨髄ならびに異なる組織が詳細に検討される必要がある日。
それは、繰り返し時間をかけて同じマウスにおける胸骨骨髄画像に、現在技術的に不可能ですが、貴重な情報は、もともとレゴで形質導入Lin-で細胞の同じ集団を移植したコホートからの異なる時点で個別のマウスを研究することによって得ることができる。胸骨は、その早期かつ完全な造血再、安定性、容易な切片、再現性、大容量に、骨髄の再生を研究するための優れた場所です。これは、実験が有益作るために十分な色の多様性及びFP-発現細胞を得るために、移植およびイメージング実験を進める前に、各個別のFPベクトルのリニア細胞の近くから50％の形質導入効率に到達することが重要である。常に複数のクローンが偶然伝達が非効率的で、多くの細胞が1つまたは2つの挿入を持っている場合は特に、類似または同一colorprintsで終わる可能性があることを注意すべき点があるでしょう。これは、各個別の尾静脈注射は、細胞用量の100％に近い送達ことを確信することも重要である。
これは、共振スキャン多光子共焦点タイムラプスイメージングを組み合わせることにより、動的スタディを生きる4D高解像度の実現可能性を証明している。これは、静的な、さまざまなクローンの特性評価だけでなく、同じ色でマークされたセル間の動力学的差異の分析だけでなく、することができます。またsuコマンドを利用し3のFP標識サンプルのビデオレートの4Dイメージングを実証ccessfully生きている組織の効率化のためのタンデムTISAとOPOレーザにおいて、害の少ない、より深い浸透、2光子生体イメージングのための道を開く。さらに、現在の染料ベースの限界を克服長期間（ヶ月）にわたり細胞を追跡する価値のあるオプションを確立する。このアプローチは、商業的に入手可能な共焦点及び二光子レーザー顕微鏡、通常の顕微鏡検査施設で容易な実装を可能にする市販のソフトウェアパッケージに基づいて自動化されたユーザ対話型の画像解析法を使用する。
最後に、この方法論はHSPCsの分析に限定されるものではない。多くの生物学的システムは、多色標識および共焦点および2光子イメージングを経由してクローン的に複雑な細胞と構造要素の時空間配置を分解する能力から利益を得ることができる。臓器再生、免疫応答、および腫瘍転移性パターンは、わずか数の潜在的な用途を提案するために、尋問することができた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金融利益を宣言しません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
