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Biology

Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की विवो Clonal ट्रैकिंग में

Published: August 6, 2014 doi: 10.3791/51669
Automatic Translation
1, 2, 2
1Light Microscopy Core Facility, NHLBI/NIH, 2Hematology Branch, NHLBI/NIH

Summary

Hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का अंकन मिश्रित 5 फ्लोरोसेंट प्रोटीन उत्थान के दौरान अस्थि मज्जा hematopoietic वास्तुकला में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, confocal और दो ​​photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से विवो प्रतिरूप ट्रैकिंग में अनुमति देता है. इस विधि प्रत्यारोपण निम्नलिखित समय की व्यापक अवधि के लिए बरकरार ऊतकों में प्रेतसंबंधी कोडित HSPCs व्युत्पन्न कोशिकाओं के गैर इनवेसिव भाग्य मैपिंग की अनुमति देता है.

Abstract

हम विकसित और murine अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग vivo hematopoiesis में अध्ययन करने के लिए उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) का प्रतिरूप ट्रैकिंग के लिए कार्यप्रणाली अंकन एक फ्लोरोसेंट पुष्टि. फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) एन्कोडिंग lentiviral वैक्टर का उपयोग कर अंकन जेनेटिक मिश्रित उन्नत माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के माध्यम से सेल भाग्य मानचित्रण सक्षम होना चाहिए. पांच अलग एफपीएस एन्कोडिंग वैक्टर: आसमानी, EGFP, वीनस, tdTomato, और mCherry रंग चिह्नित कोशिकाओं की एक विविध पैलेट बनाने, समवर्ती HSPCs transduce के लिए इस्तेमाल किया गया. Confocal / दो फोटॉन संकर माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग एक साथ उच्च संकल्प विशिष्ट चिह्नित कोशिकाओं के आकलन और ऊतकों के संरचनात्मक घटकों के साथ संयोजन के रूप में उनकी संतान में सक्षम बनाता है. बड़ा प्रेतसंबंधी कोडित HSPC व्युत्पन्न कोशिकाओं गैर invasively अस्थि मज्जा सहित विभिन्न बरकरार ऊतकों में पता लगाया जा सकता है कि पता चलता है (बड़े क्षेत्रों पर बी.एम. विश्लेषण करती है), प्रत्यारोपण निम्नलिखित समय की व्यापक अवधि के लिए. 4D में वीडियो दर multiphoton और confocal समय चूक इमेजिंग के संयोजन लाइव पढ़ाई एक मात्रात्मक तरीके से गतिशील सेलुलर और प्रतिरूप ट्रैकिंग की संभावना प्रदर्शित करता है.

Introduction

रक्त कोशिकाओं, करार दिया hematopoiesis के उत्पादन, hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (HSPCs) की एक छोटी सी आबादी द्वारा बनाए रखा है. इन कोशिकाओं को सभी आत्म नवीकरण और भेदभाव 1,2 के नियंत्रण में फंसा, अस्थिकोरक, stromal कोशिकाओं, वसा ऊतकों, और संवहनी संरचनाओं से मिलकर एक जटिल microenvironmental आला में अस्थि मज्जा (बीएम) के भीतर रहते हैं. बरकरार बी.एम. प्रत्यक्ष टिप्पणियों के लिए पारंपरिक रूप से दुर्गम किया गया है, HSPC और उनके microenvironment के बीच बातचीत vivo में काफी हद तक uncharacterized बनी हुई है. इससे पहले, हम confocal प्रतिदीप्ति और प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी 3 का उपयोग बरकरार बी.एम. के 3 डी वास्तुकला कल्पना करने के लिए एक पद्धति की स्थापना की. हम बी.एम. में EGFP चिह्नित HSPCs के विस्तार की विशेषता है, लेकिन केवल एक ही एफपी का उपयोग एक प्रतिरूप स्तर पर उत्थान का विश्लेषण रोका. हाल ही में हम रचनात्मक रूप FL व्यक्त Lentiviral जीन सत्तामीमांसा (लेगो) का लाभ वैक्टर ले लियाuorescent प्रोटीन (एफपीएस) कुशलतापूर्वक कोशिकाओं 4,5 चिह्नित करने के लिए. 3 या 5 वैक्टर साथ HSPC सह पारगमन कई व्यक्ति HSPC क्लोन की ट्रैकिंग की अनुमति, मिश्रित रंग की एक विविध पैलेट उत्पन्न करता है.

चिह्नित HSPC विकिरणित चूहों के बीएम में व्यक्तिगत HSPC घर वापस आना और engraftment का पता लगाने की अनुमति दी नई इमेजिंग तकनीक के साथ संयुक्त. लेगो वैक्टर हड्डी और अन्य के स्पष्ट दृश्य की अनुमति, (आसमानी, EGFP, वीनस, tdTomato, और mCherry से) 3 या 5 विभिन्न एफपीएस के साथ HSPC निशान और confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा बी.एम. में समय के साथ उनके engraftment पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया मैट्रिक्स संरचनाओं, और उनके microenvironment के घटकों को HSPC क्लोन के संबंध. HSPC लेगो वैक्टर साथ transduced C57BL / 6 चूहों बी.एम. से वंश नकारात्मक कोशिकाओं, के रूप में शुद्ध, और myelo-ablated congenic चूहों में पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा reinfused गया. उरोस्थि बी.एम. ऊतक की बड़ी मात्रा की निगरानी करके हम जल्दी में होने वाली endosteal engraftment कल्पनाबी.एम. उत्थान. विविध रंग स्पेक्ट्रा के साथ सेल समूहों की हड्डी के पास शुरू में छपी है और समय के साथ केन्द्र में आगे बढ़े. दिलचस्प है, अधिक से अधिक 3 हफ्तों के बाद मज्जा बल्कि खून के माध्यम से HSPCs के व्यापक प्रसार से, समीप मज्जा में व्यक्तिगत HSPCs से व्युत्पन्न hematopoiesis के प्रसार, सुझाव स्थूल प्रतिरूप समूहों के शामिल. कम रंग विविधता कई वैक्टर के साथ कोशिकाओं repopulating लंबी अवधि transducing में कठिनाई, सुझाव देर समय बिंदुओं पर हुई थी.

इसके अलावा, HSPCs, तिल्ली में चूहों में hematopoiesis के लिए जिम्मेदार भी एक अंग समूहों का गठन. HPSC व्युत्पन्न व्यक्ति की कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से, थाइमस में लिम्फ नोड्स, तिल्ली, जिगर, फेफड़ों, हृदय, त्वचा, कंकाल की मांसपेशी, वसा ऊतकों, और गुर्दे हल किया जा सकता है. 3 डी छवियों ऊतकों की न्यूनतम perturbations के साथ कोशिकाओं के वितरण की सराहना करने के गुणात्मक और मात्रात्मक आकलन किया जा सकता है. अंत में, हम को वर्णनगुंजयमान स्कैनिंग multiphoton और confocal समय चूक इमेजिंग के संयोजन से 4D में रहते गतिशील पढ़ाई के डी व्यवहार्यता. इस पद्धति ऊतक उत्थान और पैथोलॉजी के अध्ययन में एक शक्तिशाली उपकरण उपलब्ध कराने, उनके बरकरार 3D वास्तुकला में प्रेतसंबंधी चिह्नित कोशिकाओं आबादी के गैर इनवेसिव उच्च संकल्प, बहुआयामी सेल भाग्य अनुरेखण सक्षम बनाता है.

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Protocol

सभी चूहों रखे और देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान की प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार संभाला, और एक NHLBI पशु की देखभाल और उपयोग समिति को मंजूरी दी प्रोटोकॉल में दाखिला लिया गया. महिला B6.SJL-Ptprc (घ) Pep3 (बी) / 6-12 सप्ताह पुरानी BoyJ (B6.SJL) और C57BL / 6 चूहों,, क्रमशः, दाता और प्राप्तकर्ता के रूप में इस्तेमाल किया गया.

सामग्री, अभिकर्मकों, और उपकरणों की एक सूची तालिका 1 में प्रदान की जाती है.

माउस HSPCs की 1 लेगो पारगमन और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण

एक प्रमाणित जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) कैबिनेट (टिशू कल्चर हुड) में नीचे वर्णित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन.

  1. लेगो वैक्टर तय 5fps का उत्पादन
    1. Lentiviral "जीन सत्तामीमांसा" (लेगो) वेक्टर प्लास्मिड, प्रयोग लेगो-Cer2 (आसमानी), लेगो-G2 (EGFP), लेगो-V2 (वीनस), लेगो-T2 सहित एक मजबूत विधान SFFV प्रमोटर, से एक अलग एफपी एन्कोडिंग प्रत्येक (TdTomato), और कृपया डा बोरिस Fehse (यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर हैम्बर्ग Eppendorf, हैम्बर्ग, जर्मनी) द्वारा प्रदान लेगो-C2 (mCherry); Addgene 5-7 से भी उपलब्ध अब.
    2. लेगो वैक्टर, बीज 10 सेमी व्यंजन (प्रत्येक वेक्टर के लिए 12 व्यंजनों का उपयोग करें) 24 घंटा पूर्व I10 मीडिया (10% FCS और glutamine / पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक IMDM) के 8 एमएल में अभिकर्मक में 5 एक्स 10 6 293T कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए.
    3. थोड़ा संशोधित CAPHOS किट सिफारिशों का उपयोग कैल्शियम फास्फेट के साथ कोशिकाओं Transfect:
      1. प्रत्येक थाली मिश्रण 15 ग्राम लेगो वेक्टर, 12 माइक्रोग्राम pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ग्राम पिछला-बुनना, और 50 की उपस्थिति μl 2.5 एम 2 CaCl में 1 ग्राम pMD2.G-VSV जी plasmids के लिए, और करने के लिए पानी जोड़ने एक 500 μl कुल मात्रा उपज.
      2. 2x HeBS (HEPES buffered खारा) के 500 μl के साथ वेग डीएनए plasmids और पूर्व 293T कोशिकाओं में से प्रत्येक थाली को जोड़ने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
      3. के लिए कोशिकाओं को सेतेएक 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 6 घंटा; मीडिया को हटाने और ताजा संस्कृति मीडिया 6 घंटे बाद अभिकर्मक जोड़ें.
    4. 3 दिन के लिए, दैनिक, प्रत्येक थाली से lentiviral कणों से युक्त संस्कृति supernatants लीजिए. प्रत्येक दिन के बाद सतह पर तैरनेवाला संग्रह प्रत्येक थाली को ताजा I10 मीडिया जोड़ें.
      1. 0.22 माइक्रोन pores, पूल के माध्यम से फिल्टर और 71,900 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक SW28 रोटर पर ultracentrifugation द्वारा supernatants ध्यान देना.
      2. StemSpan मीडिया के 1 मिलीलीटर में supernatants Resuspend. -80 डिग्री सेल्सियस पर 200 μl और दुकान में lentiviral शेयरों विभाज्य.
  2. Lentiviral कणों का अनुमापन
    NIH3T3 कोशिकाओं का उपयोग इकाइयों / मिलीलीटर transducing के quantitation के माध्यम से एकत्र supernatants में लेगो वेक्टर कणों की अनुमापांक निर्धारित करते हैं. Titers प्रयोगात्मक लक्ष्य के लिए संक्रमण (MOI) के वांछित रिश्तेदार बहुलता में परिणाम की जरूरत प्रत्येक वेक्टर सतह पर तैरनेवाला की मात्रा की गणना की अनुमतिकोशिकाओं.
    1. प्लेट एक दिन अनुमापन पहले I10 मीडिया के 2 मिलीलीटर में अच्छी तरह से (12 अच्छी तरह से थाली) प्रति 5 एक्स 10 4 NIH3T3 कोशिकाओं.
    2. (4 मिलीग्राम / एमएल 1,000x है) protamine सल्फेट के साथ पूरक I10 मीडिया में वेक्टर supernatants का 5 गुना धारावाहिक dilutions तैयार करें.
    3. कोशिकाओं से मीडिया निकालें, और केंद्रित वायरस के 2, 0.8, 0.32, और 0.128 μl के बराबर युक्त सतह पर तैरनेवाला dilutions की 500 μl के साथ बदलें.
    4. अच्छी तरह से एक नियंत्रण गिनती पारगमन के समय में अच्छी तरह से प्रति मौजूद कोशिकाओं की संख्या (नहीं), निर्धारित करते हैं.
    5. 6 घंटा पारगमन के बाद, आई 10 मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 3 दिन के लिए सेते हैं.
    6. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्सिन-EDTA का उपयोग करने से कोशिकाओं फसल, और प्रवाह cytometry के माध्यम से फ्लोरोसेंट कोशिकाओं का प्रतिशत (% एफ पी) का निर्धारण.
    7. कोई टिटर (वेक्टर कणों / एमएल) = 1 और 50% के बीच एक% एफपी में जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक अच्छी तरह से (कमजोर पड़ने) के लिए प्राप्त titers औसतन पालन के रूप में अनुमापांक गणनावेक्टर सतह पर तैरनेवाला (माले) की एक्स% एफ पी / वॉल्यूम. % एफ पी 1 और 50% के बीच है यदि प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए प्राप्त titers औसत.
  3. माउस सेल संग्रह, शोधन, पारगमन, और ट्रांसप्लांटेशन (रेखाचित्र चित्रा 1 ए में दिखाया Malide एट अल. 4 से अनुकूलित).
    1. एक अनुमोदित प्रक्रिया से दाता चूहों बलिदान. पूर्वकाल और कूल्हों अंगों से फसल अस्थि मज्जा: अच्छी तरह से संयुक्त करने के लिए संभव के रूप में बंद के प्रत्येक हड्डी के अंत में कटौती हड्डियों से सभी मांसपेशियों, स्नायुबंधन और अतिरिक्त ऊतक, हटाने, और के बाहर अस्थि मज्जा फ्लश, humeri, femurs और tibias काटना I10 मीडिया वाले एक सिरिंज पर एक 27-0 जी सुई का उपयोग हड्डी.
    2. 500 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूरे अस्थि मज्जा कोशिकाओं गोली और 50 मिलीलीटर एसीके बफर के साथ दो बार लाल कोशिकाओं lyse. 10 मिलीलीटर I10 मीडिया में कोशिकाओं Resuspend.
    3. एक संशोधित किट protoco के अनुसार एमएसीएस वंश कमी किट के साथ वंश नकारात्मक (Lin-) पूर्वज कोशिकाओं को शुद्धएल:
      1. विरोधी बायोटिन microbeads की 30 μl के बजाय 10 μl / 10 7 कोशिकाओं का उपयोग करें; I2 मीडिया (2% FCS साथ पूरक IMDM) के बजाय बफर के साथ धोने चरणों को पूरा.
      2. बायोटिन एंटीबॉडी कॉकटेल के साथ ऊष्मायन और विरोधी बायोटिन microbeads साथ ऊष्मायन के बीच एक धोने कदम डालें; और आई 10 के बजाय बफर के साथ स्तंभ संतुलित करना.
    4. 10 एनजी / एमएल murine आईएल -3, 100 एनजी / एमएल murine आईएल -11, 100 एनजी / एमएल मानव फ्लाइट -3 के साथ पूरक StemSpan मीडिया में 5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक प्रारंभिक घनत्व में 48 घंटे के लिए संस्कृति Lin- कोशिकाओं ligand, और 50 एनजी / एमएल murine स्टेम सेल कारक.
    5. StemSpan की उपस्थिति में 4 x 10 5 कोशिकाओं 12 अच्छी तरह प्लेटें प्रत्येक एफ पी के लिए 50% अभिव्यक्ति दक्षता प्राप्त करने के लिए RetroNectin साथ लेपित और संक्रमण की बहुलता 6-7 की (MOI) में, लेगो supernatants साथ प्रत्येक transduce, पर स्थानांतरण 1 मीडिया और साइटोकिन्स ऊपर विस्तृत और 4 माइक्रोग्राम / एमएल protamine सल्फेट.
    6. कोशिकाओं transduceप्रत्येक लेगो वेक्टर व्यक्तिगत रूप में कदम 1.3.5 में वर्णित और पारगमन निम्नलिखित कोशिकाओं मिश्रण के साथ (मिक्स कहा जाता है) या एक साथ सभी 5 लेगो वेक्टर supernatants के साथ कोशिकाओं सह transduce (सह करार दिया). , 24 घंटा बाद में कोशिकाओं को हटाने साइटोकिन्स बिना StemSpan मीडिया के साथ एक बार धोने, और प्रत्यारोपण के लिए साइटोकिन्स बिना StemSpan मीडिया में उन्हें resuspend, या confocal माइक्रोस्कोपी से पहले अतिरिक्त 96 घंटे के लिए ताजा साइटोकिन्स के साथ मीडिया, और संस्कृति को हस्तांतरण और प्रवाह cytometry.
      1. 1 के लिए इसी माउस प्रति एक सेल खुराक पर, 100 μl की एक मात्रा में, 11 Gy खुराक पूर्व विकिरणित प्राप्तकर्ताओं (6-18 घंटा पूर्व प्रत्यारोपण के लिए) प्राप्तकर्ताओं में पूंछ नस में इंजेक्शन के माध्यम से Lin- HSPCs transduced infusing द्वारा अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्रदर्शन करना -4 x 10 5 Lin- कोशिकाओं मूल रूप से पारगमन के लिए चढ़ाया. प्रत्येक प्रयोग में, transduced दाता बी.एम. कोशिकाओं का एक ही आबादी के साथ जानवरों की एक पूरी पलटन प्रत्यारोपण.
      2. Transduced एच के इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिएSPCS, संस्कृति StemSpan में एक अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए कोशिकाओं साइटोकिन्स के साथ पूरक और पारगमन दक्षता के लिए फ्लो द्वारा विश्लेषण, और रंग विविधता के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा.
        1. व्यक्तिगत चूहों बलिदान और विभिन्न समय बाद प्रत्यारोपण 120 दिनों के लिए अंक पर, इमेजिंग के लिए ऊतकों और अंगों को पुनः प्राप्त.
          1. इथेनॉल के साथ माउस के फर स्प्रे और बाल प्रसार से बचने के उदर पक्ष पर त्वचा काटकर अलग कर देना.
          2. मानक प्रक्रियाओं तिल्ली, घुटने की चक्की लिम्फ नोड्स, फेफड़ों, हृदय, त्वचा, वसा ऊतकों, कंकाल की मांसपेशी, गुर्दे, जिगर, साथ ही calvaria के लिए उपयोग करने के लिए सिर के अनुसार काटना और आबकारी.
          3. वैकल्पिक रूप से, calvaria का उपयोग करें या इस तरह के लाइव पशु में त्वचा और लिम्फ नोड्स के रूप में समय 2,8,9 या छवि सतही अंगों के ऊपर बार बार लाइव इमेजिंग के लिए एक हड्डी खिड़की की स्थापना की.
        2. 50-100 में 35 मिमी संख्या 0 कवर कांच संस्कृति बर्तन में व्यक्तिगत अंगों रखें56, 2.5 कदम के रूप में वर्णित, सेक्शनिंग निर्धारण या आगे की प्रक्रिया के बिना बरकरार उन्हें इमेजिंग के लिए एल पीबीएस.
        3. बड़ा इमेजिंग के लिए, ठंड पीबीएस में उपयोग करें जब तक अंगों में रहते हैं. समय चूक इमेजिंग के लिए, 20 मिमी HEPES युक्त 10% FBS के 37 डिग्री सेल्सियस DMEM में अंगों इमेजिंग के लिए तुरंत आगे बढ़ना

2 confocal और दो photon माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण

  1. बहु लाइन आर्गन, डायोड 561 एनएम, HeNe 594 एनएम, और HeNe 633 एनएम दिखाई पराबैंगनीकिरण से लैस एक Leica SP5 पांच चैनलों confocal और multiphoton प्रणाली का उपयोग माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रदर्शन. 680 से फैलाव के सुधार के साथ 1,080 एनएम उत्तेजना के लिए नीलम (तिवारी एसए) लेजर, ट्यून करने योग्य: 2 फोटॉन मोड, एक स्पंदित femtosecond तिवारी में प्रयोग करें. टी के साथ क्रमिक रूप से या एक साथ, 1,030-1,300 एनएम जहाँ तक उत्पादन तरंगदैर्ध्य रेंज का विस्तार करने के लिए लाल स्थानांतरित एफपीएस (tdTomato और mCherry), एक ऑप्टिकल पैरामीट्रिक थरथरानवाला (OPO) लेजर से जुड़े प्रयोगों में प्रयोग करेंतिवारी सा लेजर वह.
  2. -IRAPO एल HCX 25x / 0.95 एनए पानी की सूई उद्देश्य (DD = 2.5 मिमी), एक कोर्ट PLAPO-CS 20X / 0.70 एनए ड्राई उद्देश्य (DD = 0.6 मिमी), या कोर्ट पी एल IRAPO 40X एक का उपयोग कर छवि विभिन्न ऊतकों /1.1 एनए पानी विसर्जन उद्देश्य (DD = 0.6 मिमी).
  3. नियंत्रण के रूप में भी एक भी एफपी लेगो वेक्टर के साथ transduced बी.एम. कोशिकाओं से दृश्य स्पेक्ट्रम के 5 एनएम बैंडविड्थ में उत्सर्जित प्रकाश की लैम्ब्डा ढेर (xyλ) एकत्रित confocal प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा प्राप्त, बी.एम. प्रतिरोपित नहीं.
    1. Leica लास वायुसेना v2.4.1 सॉफ्टवेयर के साथ प्रक्रिया छवियों सभी 5 एफपीएस के संदर्भ स्पेक्ट्रा के रूप में अच्छी तरह से autofluorescence के रूप में (2A चित्रा) बनाने के लिए. व्यक्तिगत एफपी स्पेक्ट्रा और प्रतिदीप्ति चमक में अंतर का उपयोग निम्नानुसार 5 अनुक्रमिक इमेजिंग चैनल सेट आसमानी (79%), वीनस (156%), tdTomato (283%) और mCherry (47%) की (EGFP के% के रूप में व्यक्त): आसमानी (458 / 468-482 एनएम), EGFP (488 / 496-514 एनएम), वीनस (514 / 523-558 एनएम), tdTomato (561 / 579-597 एनएम), और mCherry (594 / 618-670 एनएम) (
    2. प्रत्येक व्यक्ति एफपी साथ transduced कोशिकाओं बाकी (चित्रा -2) से केवल इसी चैनल में दिखाई और अनुपस्थित रहे हैं, के रूप में सही एफपीएस जुदाई मान्य. इसके अलावा, यह परिभाषित मल्टी चैनल दृष्टिकोण बाद रंग विश्लेषण और प्रतिरूप ट्रैकिंग सक्षम बनाता है और वर्णक्रमीय इमेजिंग की तुलना में अधिग्रहण समय को कम करने का लाभ दिया है कि एक अद्वितीय 5 चैनल "colorprint" बनाता है.
  4. , 2 फोटॉन मोड में, एक चार चैनलों गैर descanned डिटेक्टर (NDD) के रूप में साथ इकट्ठा कस्टम dichroic दर्पण उच्च दक्षता से और अलग प्रतिदीप्ति उत्सर्जन इस प्रकार है: 465 एनएम पर एक dichroic दर्पण द्वारा पीछा 568 एनएम पर एक dichroic दर्पण, द्वारा पीछा एसएचजी या autofluorescence और आसमानी, tdTomato या mCherry के लिए EGFP या वीनस के लिए एक 525/40 एनएम उत्सर्जन फिल्टर, और एक 648 एनएम dichroic दर्पण और 620/60 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के लिए एक 452/45 एनएम उत्सर्जन फिल्टर.
    1. दो photon माइक्रोस्कोपी मैं द्वारा संरचनात्मक जानकारी प्रकटntrinsic विपरीत (780 एनएम पर उत्साहित) इलास्टिन, NADH, से ऊतक autofluorescence के (ऊपर वर्णित) इमेजिंग, और दूसरा हार्मोनिक वापस बिखरे एक में एकत्र 920 एनएम या 860 एनएम (उत्साहित हड्डी और तंतुमय कोलेजन से संकेत (एसएचजी) उत्पन्न दिशा) 10,11.
  5. 3 डी की मात्रा प्रतिपादन के लिए, अस्थि मज्जा और अन्य ऊतकों भर में गहराई की एक रेंज (150-300 माइक्रोन) से अधिक 5 माइक्रोन अंतराल पर Z-अक्ष के साथ xyz छवियों की श्रृंखला (आमतौर पर 1 एक्स 1 एक्स 4 माइक्रोन 3 voxel आकार) जमा है, सॉफ्टवेयर की टाइल समारोह का उपयोग बड़े क्षेत्रों स्वचालित रूप से एक पूरे उरोस्थि fossae, लगभग 2.5 x 1.2 मिमी 2 (XY) और 300 माइक्रोन (जेड) (आंकड़े 2 डी 2 ई) और मूवी 1 शामिल सिले मात्रा में उत्पन्न करने के लिए खत्म हो.
    1. छवि 2, 8 सेक्शनिंग बिना खोपड़ी के माध्यम से सीधे मज्जा calvarial.
    2. तो बाण के समान विमान (द्विभाजन) और साथ में धारा उरोस्थिtransversally कटौती चेहरा 3,4,12 के माध्यम से 2 sternal परिखा और छवि के बीच संयुक्त पर (Takaku से अनुकूलित चित्रा 1 बी में अवलोकन एट अल 3).
  6. 4D समय चूक इमेजिंग के लिए, 50-100 μl में, 35 मिमी संख्या 0 coverglass संस्कृति व्यंजन पर काटा हुआ हौसले excised घुटने की चक्की लिम्फ नोड, तिल्ली, फेफड़े, या calvarial हड्डी नमूने जगह 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिमी HEPES युक्त DMEM, 10% FBS और ~ (Z-ढेर लेने, confocal उत्तेजना (458 एनएम, 488 एनएम, 514 एनएम, 561 एनएम, 594 एनएम) और Leica गुंजयमान स्कैनर (8000 हर्ट्ज / सेक) के साथ संयुक्त 2 फोटॉन तिवारी सा उत्तेजना (860 एनएम) का उपयोग अप करने के लिए 1 घंटे के लिए 20 सेकंड के अंतराल पर 80 माइक्रोन).
    1. एक साथ तीन रंग 2P इमेजिंग उपयोग तिवारी SA के लिए 860 पर देखते एनएम एक साथ OPO (tdTomato के लिए 1,130 एनएम पर देखते हैं, या 1,140 एनएम mCherry) लेजर के साथ (मूवी 2).
  7. 3 डी वॉल्यूम और 4D समय दृश्यों के पुनर्निर्माण और विश्लेषण
    1. Imaris x 64 softw का प्रयोग करेंपहले 3,4 वर्णित के रूप में, संस्करण 7.6, या मात्रा गाया (3 डी) में कच्चे छवियों की टाइलों ढेर को बदलने के लिए वैकल्पिक सॉफ्टवेयर संकुल अस्थि मज्जा और विभिन्न ऊतकों और 3 डी रोटेशन फिल्मों के रूप में उन्हें निर्यात करने के लिए अंदर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के डेटा हैं (मूवी 1) कदम दर कदम उदाहरण:
      1. Imaris में, Z-ढेर छवि खोलें; चयन करें 3 डी मात्रा दृश्य प्रदर्शित करने के लिए "पार".
      2. 360 डिग्री के आसपास मात्रा बारी करने के लिए "नेविगेट" का प्रयोग करें.
      3. एक एनीमेशन बनाने के लिए "एनिमेशन" का चयन करें; चयनित दृश्य, जूम, मात्रा का घुमाव जोड़ने के लिए मुख्य फ्रेम का उपयोग करें; , फिल्म का पूर्वावलोकन के रूप में आवश्यक संपादित करें और एक वांछित फिल्म प्रारूप में फाइल को बचाने (पूर्व: AVI, MOV).
    2. 3 डी सेल और क्लोन आवृत्ति, स्थिति, आकार और वितरण की मात्रात्मक आकलन, आगे की प्रक्रिया के लिए दूरी Meas प्रदर्शन MATLAB अनुप्रयोगों को एकीकृत जो Imaris XT मॉड्यूल का उपयोग Z-ढेर(एक दूरी परिवर्तन कलन विधि का उपयोग) urements और समूहों विश्लेषण, के रूप में पहले 3,4 वर्णित. Imaris x 64 सॉफ्टवेयर के साथ मात्रा गाया चार आयामी (4D) फिल्मों में समय के साथ छवि के ढेर के दृश्यों रूपांतरण, और autoregressive गति एल्गोरिदम का उपयोग तीन आयामों में सेल गतिशीलता का semiautomated नज़र रखने के लिए जगह और सतह विश्लेषण का उपयोग करें.
    3. निम्नानुसार कोशिकाओं की multispectral विश्लेषण प्रदर्शन: बहु रंग एक नए चैनल में Imaris XT के चैनल गणित के माध्यम से सभी 5 चैनल जोड़कर लेबल स्पॉट निकालने; सभी स्थानों (कोशिकाओं) 5 घटक चैनलों में से प्रत्येक में मतलब तीव्रता प्रतिदीप्ति के लिए निर्धारित करते हैं. व्यक्तिगत सेल में प्रत्येक एफपी (चित्रा 2 ई ग्राफ) के सापेक्ष% यानी अद्वितीय "colorprint" प्रदर्शित रेखांकन साजिश करने के लिए एक्सेल सॉफ्टवेयर में मूल्यों में निर्यात करें. ऊतक बहाव के लिए सेट डेटा सही है, और सेल वेग और विस्थापन समय के साथ, ट्रैक लंबाई, पथ, और दूरी की गणना; एक्सेल sof में निर्यात मूल्योंरेखांकन साजिश करने tware. Adobe Photoshop सीएसएस 5 सॉफ्टवेयर के साथ समग्र आंकड़े इकट्ठे.

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Representative Results

साबुत माउंट 3D confocal sternal अस्थि मज्जा समय निश्चित रूप से / 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी पुनर्निर्माण उल्लेखनीय विशेषताओं के साथ एक पैटर्न में engraftment और प्रतिरोपित सह 5fps के विस्तार का पता चला: क्लोन स्पष्ट रूप से चित्रित, homogenously विस्तृत शुरू में रंगों का पैलेट और प्रगति के साथ चिह्नित दिखाई समय के साथ preferentially ज्यादातर एक रंग की कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए. Confocal माइक्रोस्कोपी सेटअप और sternal अस्थि मज्जा में इमेजिंग 5fps चिह्नित HSPC के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 2 और सिनेमा 1 और 2 में सचित्र हैं.

बरकरार ऊतकों की साबुत माउंट 3D confocal / 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी पुनर्निर्माण रंग के भाग्य लाइव ऊतकों में विस्तारित समय अवधि के लिए बी.एम. व्युत्पन्न कोशिकाओं के रूप में चिह्नित ट्रेस करने की संभावना प्रदर्शित करता है. प्रत्यारोपण निम्नलिखित hematopoietic और गैर hematopoietic अंगों में बोन मैरो व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रतिनिधि उदाहरण फाई में दिखाया गया है gure 3.

चित्रा 1
प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की 1 अवलोकन चित्रा. ए) योजनाबद्ध कदम Lin- बी.एम. कोशिकाओं का अलगाव को वर्णन, लेगो एफपीएस रंग वेरिएंट की एक किस्म एन्कोडिंग वैक्टर, और में-myelo-ablated चूहों transduced कोशिकाओं के reinfusion (अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण). बी) अस्थि मज्जा के साथ पारगमन (उरोस्थि, calvaria ), के साथ ही विभिन्न अंगों / ऊतकों प्रत्यारोपण निम्नलिखित अलग समय बिंदुओं पर confocal और दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. पैनल Malide एट अल. 4 में चित्रा 1 से अनुकूलित है और पैनल बी Takaku एट अल 3 में चित्रा 1 से रूपांतरित किया.

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इमेजिंग के लिए चित्रा 2 Confocal माइक्रोस्कोपी सेटअप और प्रतिनिधि उदाहरण अस्थि मज्जा में HSPC 5fps चिह्नित. ए) स्पेक्ट्रल (xyλ) इमेजिंग प्रत्येक पीले हरे सियान (आसमानी साथ pseudocolored सामान्यीकृत histograms में सचित्र एफ पी), (EGFP), (वीनस), मैजंटा (tdTomato), और लाल (mCherry) के लिए संदर्भ उत्सर्जन स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड किया: उत्साहित की तुलना में 594 nm- (ठोस लाल रेखा) से 561 nm- (धराशायी लाल रेखा) तरंगदैर्ध्य बी) की छवि क्रमिक रूप से उत्सर्जन के लिए सेट पांच चैनल:. आसमानी (468-482 एनएम), EGFP (496-514 एनएम), वीनस ( 523-558 एनएम), tdTomato (579-597 एनएम) और mCherry (618-670 एनएम). पैनलों ए और बी Malide एट अल में चित्रा 1 से अनुकूलित कर रहे हैं. व्यक्तिगत एफपी वैक्टर साथ transduced साथ प्रत्यारोपित चूहों से sternal बी.एम. के 4 सी) इमेजिंग. प्रत्येक एफपी ही उचित चर्चा में imaged इसी वेक्टर के साथ transduced कोशिकाओं में दिखाई दे रहा थाannel, और दूसरों (कोई पार वार्ता). डी, ई) engraftment और प्रतिरोपित सह 5FP की विस्तार से अनुपस्थित विवो में अस्थि मज्जा में कोशिकाओं के रूप में चिह्नित. 4 दिन के बाद प्रत्यारोपण (डी) में रंगों की व्यापक विविधता में चिह्नित कोशिकाओं के समूहों को प्राथमिकता दो fossae बीच संयुक्त के निकट स्थित हड्डी बढ़त (सफेद एसएचजी) को दिखाई करीब निकटता थे. सुबह 30 (ई) अद्वितीय रंग (हरा - पीला) की एक बड़ी क्लोन विलय कर दिया और साथ ही एक चैनल छवियों में सचित्र के रूप में पूरे fossae पर कब्जा करने के लिए विस्तार किया गया है. एफपीएस सामग्री विश्लेषण एफपीएस EGFP और वीनस वेरिएंट 2 से अंकन सजातीय दर्शाता है.

चित्रा 3
चित्रा प्रत्यारोपण निम्नलिखित hematopoietic और गैर hematopoietic अंगों में बोन मैरो व्युत्पन्न कोशिकाओं के 3 उदाहरण हैं. विभिन्न आज़ादीमुकदमा और अंगों 150-200 माइक्रोन और बड़े सतह क्षेत्रों की गहराई के माध्यम से बरकरार imaged थे, computationally सिले और 120 दिनों के बाद प्रत्यारोपण ज्यादातर पीले (वीनस में चिह्नित बिखरे कोशिकाओं को दर्शाता है) और पर छाया पुनर्निर्माण. ए) घुटने की चक्की लिम्फ नोड के रूप में 3 डी में गाया peripherally कोलेजन फाइबर (सफेद, एसएचजी). बी) से घिरा हुआ लाल (mCherry) इसी तरह, एक ही समय में तिल्ली, छोटे समूहों और जिगर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के साथ में कोलेजन फाइबर नेटवर्क. सी) द्वारा intertwined विभिन्न रंगों के ज्यादातर बिखरे कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है विभिन्न रंगों के तारामय कोशिकाओं, या मैक्रोफेज (Kupffer कोशिकाओं) की विचारोत्तेजक आकृति विज्ञान, देखा गया विविध रंगों और morphologies के चमड़े का पक्ष फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से imaged एक त्वचा फ्लैप में यकृत lobular संरचनाओं. डी) की रूपरेखा (एसएचजी) सफेद कोलेजन फाइबर नेटवर्क के साथ गठबंधन किया गया Langerhan या वृक्ष के समान तरह पहचान सुझाव बड़े आकार और आकृति विज्ञान के साथ सबसे अधिक, lyielastin तंतुओं के तहत एनजी (780 एनएम पर autofluorescence, सफेद) और कोलेजन साथ (920 एनएम पर एसएचजी, सफेद) बृहतभक्षककोशिका की तरह आकृति विज्ञान उद्भव के साथ कई व्यक्ति बड़े फ्लोरोसेंट कोशिकाओं एपिकार्डियल ओर से देखा दिल में मांसपेशी फाइबर और बालों के रोम. ई) देखा विविध रंगों के आधार पर कई क्लोन से दिखाई अल्पज्ञता और भी interspersed गहरी (780 एनएम) उनके आंतरिक दो फोटॉन autofluorescence द्वारा कल्पना cardiomyocytes (सफेद) के बीच हैं. कोई एफपी फ्लोरोसेंट cardiomyocytes मनाया गया. एक ही रंग के पास कोशिकाओं (सीई) रंग की एक विविध पैलेट के साथ कई फ्लोरोसेंट कोशिकाओं सब गहराई में कोलेजन फाइबर (एसएचजी) का फीता जैसी संरचना में फैले हुए थे फेफड़ों में सीटू प्रसार और कम दूरी माइग्रेशन. एफ) में सुझाव वृक्ष के समान सेल, मैक्रोफेज, और टाइप 2 pneumocyte पहचान सुझाव चर morphologies साथ स्तर,.

1 मूवी 3 डी पुनःरंगों की व्यापक विविधता में चिह्नित कोशिकाओं के 4 दिनों के बाद प्रत्यारोपण सह 5fps. क्लस्टर पर sternal बी.एम. के निर्माण को प्राथमिकता दो fossae बीच संयुक्त के निकट स्थित, (सफेद एसएचजी) हड्डी बढ़त के पास में दिखाई दे रहे थे. यहां क्लिक करें इस फिल्म को देखने के लिए.

मूवी 2 4D समय व्यतीत sternal बी.एम. दो photon और सुबह 39 पद प्रत्यारोपण सह 3FPs (आसमानी - सफेद, वीनस - पीला, tdTomato - मैजंटा) पर OPO माइक्रोस्कोपी हड्डी (सफेद में एसएचजी). पीले रंग में या अत्यधिक गतिशील व्यक्ति माइलॉयड पूर्वज कोशिकाओं के विपरीत हड्डी से सटे पीले मैजंटा संयोजन में चिह्नित कई स्थिर क्लोन नोट. इस फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हम जीवित ऊतकों में बड़ा और गतिशील इमेजिंग प्राप्त करने के लिए मिलकर confocal और 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ 5FP एन्कोडिंग लेगो वैक्टर और इमेजिंग के साथ अंकन मिश्रित द्वारा उत्पन्न बड़ी विविधता के संयोजन, यहां हाल ही प्रतिरूप सेल ट्रैकिंग के लिए तैयार एक शक्तिशाली पद्धति का ब्यौरा वर्णन. यह 5 "विशिष्ट" 8 बिट चैनलों में confocal वर्णक्रमीय पहचान रिकॉर्डिंग से अंकन एफपी आधारित रंग का उपयोग बढ़ाया. इस प्रकार प्रत्येक कोशिका के भीतर आसमानी, EGFP, वीनस, tdTomato, mCherry के सापेक्ष अनुपात प्रतिरूप संतान की पहचान के लिए एक अनूठा "colorprint" बनाता है. 5fps से बहुरंगा लेबलिंग कोशिकाओं या घने ऊतकों के नमूनों में एक ही प्रकार की कोशिकाओं के समूह के बीच वितरण, संपर्क, टाइलों व्यवस्था और प्रतिस्पर्धी बातचीत का अध्ययन करते समय विशेष रूप से उपयोगी दिखाया गया था जो अधिक विविधता के साथ लेबल पैलेट बढ़ जाती है. विभिन्न ऊतकों के आंतरिक संरचनात्मक विशेषताओं में से 2 फोटॉन उत्तेजना के साथ संयुक्त औरअंगों, हम निर्धारण और शारीरिक सेक्शनिंग के लिए आवश्यकता के बिना उनके पैतृक वातावरण में रंग चिह्नित प्रतिरूप कोशिकाओं को ट्रैक कर सकते हैं. व्यक्तिगत progenitors से ली गई बेटी कोशिकाओं भेदभाव और प्रसार के बावजूद एक विशिष्ट "रंग प्रिंट" बनाए रखने कि प्रदर्शन में एक ही दिखा व्यक्ति में इन विट्रो कालोनियों (CFU) में पाया विभेदित कोशिकाओं के सैकड़ों के साथ, हमारे प्रकाशित अध्ययन में प्रदर्शन किया गया था "colorprint."

यह दृष्टिकोण confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ऑप्टिकल सेक्शनिंग के साथ एक साथ उच्च संकल्प इमेजिंग हल एकल कोशिका के लाभों को जोड़ती है. बहुत बड़ी एक्स - वाई (2 मिमी) बरकरार घने ऊतक मात्रा के क्षेत्रों टाइलों छवियों उत्पन्न करके जांच की जा सकती. ऑप्टिकल वर्गों से इन उच्च संकल्प छवियों, ~ जिसमें (स्वचालित रूप से और "मक्खी") महान जटिलता की पूर्ण 3 डी संस्करणों ~ 30 माइक्रोन की गहराई को computationally के पुनर्निर्माण के लिए कोशिकाओं की 20-30 परतें इस्तेमाल किया जा सकता हैनाड़ी, हड्डी और कोलेजन संरचनाओं. 3 डी पुनर्निर्माण जीवविज्ञान ब्याज की morphometric गैर इनवेसिव मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊतक (उरोस्थि से एक fossae) की ~ 1 मिमी 3, इसलिए हम प्रयोग प्रति इमेजिंग से अधिक नहीं 1 माउस प्रति की सिफारिश के अनुसार बाहर बात करने के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी बड़ी मात्रा / उच्च संकल्प इमेजिंग उदाहरण 1 घंटे के लिए, समय लेने वाली है दिन अस्थि मज्जा के साथ ही विभिन्न ऊतकों विस्तार से जांच करने की आवश्यकता है.

यह बार बार समय पर एक ही माउस में sternal अस्थि मज्जा छवि के लिए वर्तमान में तकनीकी रूप से असंभव है, बहुमूल्य जानकारी मूल लेगो-transduced Lin- कोशिकाओं का एक ही आबादी के साथ प्रत्यारोपित एक पलटन से अलग समय बिंदुओं पर व्यक्तिगत चूहों का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है. उरोस्थि इसकी वजह से जल्दी और पूरी hematopoietic पुनर्गठन, स्थिरता, आसान सेक्शनिंग, reproducibility, और बड़ी मात्रा में करने के लिए अस्थि मज्जा उत्थान अध्ययन करने के लिए एक शानदार स्थान है. यह प्रयोग जानकारीपूर्ण बनाने के लिए पर्याप्त रंग विविधता और एफपी व्यक्त कोशिकाओं के क्रम में, एक प्रत्यारोपण और इमेजिंग प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, प्रत्येक व्यक्ति एफपी वेक्टर के लिए Lin- कोशिकाओं का 50% पारगमन क्षमता के करीब पहुँचने के लिए महत्वपूर्ण है. हमेशा एक से अधिक क्लोन संयोग से पारगमन अक्षम और कई कोशिकाओं केवल एक या दो सम्मिलन है, खासकर यदि समान या समान colorprints के साथ अंत हो सकता है कि एक चेतावनी होगी. यह प्रत्येक व्यक्ति पूंछ नस इंजेक्शन सेल खुराक की 100% के करीब दिया है कि आश्वस्त होना भी जरूरी है.

इस गुंजयमान स्कैनिंग multiphoton और confocal समय चूक इमेजिंग के संयोजन से गतिशील पढ़ाई रहते 4D उच्च संकल्प की व्यवहार्यता साबित होता है. यह स्थिर विभिन्न क्लोन के लक्षण वर्णन, लेकिन यह भी एक ही रंग से चिह्नित कोशिकाओं के बीच गतिज मतभेद का विश्लेषण न केवल अनुमति देता है. इसके अलावा सु रोजगार तीन एफपीएस लेबल नमूनों की वीडियो दर 4D इमेजिंग दर्शाताccessfully 2 फोटॉन intravital इमेजिंग के लिए जिस तरह फ़र्श कम हानिकारक उच्च दक्षता, लाइव ऊतक की गहरी पैठ के लिए मिलकर Tisa और OPO पराबैंगनीकिरण में. इसके अलावा, मौजूदा डाई आधारित सीमाओं पर काबू पाने लंबी अवधि (महीनों) से अधिक कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक मूल्यवान विकल्प स्थापित करता है. यह दृष्टिकोण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध confocal और दो photon लेजर खुर्दबीन और सामान्य माइक्रोस्कोपी सुविधाओं में आसान कार्यान्वयन की अनुमति के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर पैकेज पर आधारित स्वचालित उपयोगकर्ता के इंटरैक्टिव छवि विश्लेषण के तरीकों का उपयोग करता है.

अंत में, इस पद्धति HSPCs का विश्लेषण करने के लिए ही सीमित नहीं है. कई जीवविज्ञान सिस्टम बहुरंगा लेबलिंग और confocal और 2 फोटॉन इमेजिंग के माध्यम से clonally जटिल सेलुलर और संरचनात्मक तत्वों के spatiotemporal व्यवस्था को हल करने की क्षमता से फायदा हो सकता है. अंग उत्थान, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, और ट्यूमर मेटास्टैटिक पैटर्न बस कुछ संभावित अनुप्रयोगों के लिए सुझाव है, पूछताछ की जा सकती है.

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Production of Viruses
LeGO-Cer2 Addgene 27338 Expression of Cerulean
LeGO-G2 Addgene 25917 Expression of eGFP
LeGO-V2 Addgene 27340 Expression of Venus
LeGO-T2 Addgene 27342 Expression of tdTomato
LeGO-C2 Addgene 27339 Expression of mCherry
Calciumm Phosphate Transfection Kit Sigma CAPHOS-1KT
Tissue culture dish BD Falcon 353003
IMDM Gibco, Life Technology 12440-053
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma F4135-500ML
Pen Strep Glutamine Gibco, Life Technology 10378-016
Centrifuge Tubes Beckman Coulter 326823
SW28 Ultracentrifuge Beckman Coulter L60
Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) Millipore SLGS033SS
Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation
ACK lysing buffer Quality Biologicals Inc. 118-156-101
Lineage Cell Depletion Kit (mouse) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-090-858
LS columns + tubes Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-306
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec Inc. USA 130-041-407
StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) StemCell Technologies Inc  9650
Murine IL-11 CF R & D Systems Inc 418-ML-025/CF 100 µg/ml is 1,000x
Recombinant murine SCF RDI Division of Fitzgerald Industries Intl  RDI-2503 100 µg/ml is 2,000x
Recombinant murine IL-3 R & D Systems Inc 403-ML-050 20 µg/ml is 2,000x
FLT-3 Ligand Miltenyi Biotec Inc. USA 130-096-480 100 µg/ml is 1,000x
12-well plates, Costar Corning Inc. 3527
Retronectin Takara Bio Inc T100A/B Resuspend at 50 µg/ml
Protamine Sulfate Sigma P-4020 4 µg/ml is 1,000x
Confocal and Two-photon Microscopy
DMEM Lonza 12-614F
1 M Hepes Cellgro, Mediatech Inc. 25-060-CI
Glass bottom culture dish P35G-0-20-C MatTek Corporation P35G-0-20-C
Glass bottom culture dish P35G-0-14-C MatTek Corporation P35G-0-14-C
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well Thermo Scientific 155383
Coverslips 22 mm No 2 Thomas Scientific 6662-Q55
Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope Leica Microsystems
Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm Coherent
Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm Coherent
HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) Leica Microsystems
HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) Leica Microsystems
Imaris software version 7.6 Bitplane

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References

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  5. Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
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सेल बायोलॉजी अंक 90 लेगो इमेजिंग प्रतिरूप ट्रैकिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन confocal माइक्रोस्कोपी multiphoton माइक्रोस्कोपी hematopoiesis lentiviral वैक्टर hematopoietic स्टेम सेल स्टेम
Confocal और Multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग पांच फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा चिह्नित hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की <em>विवो</em> Clonal ट्रैकिंग <em>में</em>
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Malide, D., Métais, J. Y., Dunbar, C. E. In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy. J. Vis. Exp. (90), e51669, doi:10.3791/51669 (2014).

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