Summary
Kombinatoriske 5 fluorescerende proteiner mærkning af hæmatopoietiske stamceller og stamceller muliggør in vivo klonal sporing via konfokal og to-foton mikroskopi, der giver indsigt i knoglemarv hæmatopoietisk arkitektur under regenerering. Denne metode giver non-invasiv skæbne kortlægning af spektralt-kodede HSPCs-afledte celler i intakte væv til meget lang tid efter transplantation.
Abstract
Vi udviklet og valideret en fluorescerende mærkning metode til klonal sporing af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) med høj rumlig og tidslig opløsning til at studere in vivo hæmatopoiese ved hjælp af den murine knoglemarvstransplantation eksperimentel model. Genetisk kombinatorisk mærkning hjælp lentivirusvektorer koder for fluorescerende proteiner (fps) aktiveret celle skæbne kortlægning via avanceret mikroskopi billeddannelse. Vektorer, der koder fem forskellige FPS: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato og mCherry blev anvendt til samtidig at transducere HSPCs, at skabe en mangfoldig palet af farver markerede celler. Imaging hjælp konfokal / to-foton hybrid mikroskopi giver samtidig høj opløsning vurdering af entydigt mærket celler og deres afkom i forbindelse med strukturelle komponenter i vævene. Volumetrisk analyser over store områder viser, at spektralt kodede HSPC-afledte celler kan påvises non-invasivt i forskellige intakte væv, herunder knoglemarv (BM), For meget lang tid efter transplantation. Levende studier kombinerer video-rate multiphoton og konfokal time-lapse billeddannelse i 4D demonstrere muligheden for dynamiske cellulære og klonal sporing på en kvantitativ måde.
Introduction
Produktionen af blodlegemer, kaldet hematopoiese, vedligeholdes af en lille population af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs). Disse celler opholde sig knoglemarv (BM) i en kompleks microenvironmental niche, der består af osteoblaster, stromale celler, fedtvæv og vaskulære strukturer, alle impliceret i kontrollen af selvfornyelse og differentiering 1,2. Som intakt BM har traditionelt været utilgængelige for direkte observationer, samspillet mellem HSPC og deres mikromiljø stort set karakteriseret in vivo. Tidligere har vi etableret en metode til at visualisere 3D arkitektur intakt BM hjælp konfokal fluorescens og refleksion mikroskopi 3. Vi kendetegnet udvidelse af EGFP-mærket HSPCs i BM, men anvendelse af kun en enkelt FP udelukket analyse af regenerering på en klonal plan. For ganske nylig tog vi fordel af Lentiviral Gene ontologi (Lego) vektorer konstitutivt udtrykker fluorescent proteiner (fps) til effektivt at markere celler 4,5. Co-transduktion af HSPC med 3 eller 5 vektorer genererer en mangfoldig palet af kombinatoriske farver, tillader sporing af flere individuelle HSPC kloner.
Mærket HSPC kombineret med ny billedteknologi lov til at spore individuelle HSPC målsøgende og transplantation i BM af bestrålede mus. Lego vektorer blev brugt til at markere HSPC med 3 eller 5 forskellige bps (fra Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato og mCherry), og følg deres transplantation gennem tiden i BM af konfokal og 2-foton mikroskopi, så klar visualisering af knogler og andre matrix strukturer, og forholdet mellem HSPC kloner til komponenter i deres mikromiljø. HSPC blev renset som afstamning negative celler fra C57BL / 6 mus BM, transduceret med LEGO-vektorer, og reinfunderet af haleveneinjektion i myelo-ablated kongene mus. Ved at overvåge store mængder af brystbenet BM væv visualiserede vi endosteale transplantation forekommer tidligt iBM regenerering. Celleklynger med forskellige farve spektre optrådte først i tæt nærhed til knoglen og skred centralt over tid. Interessant, efter mere end 3 uger marven bestod af makroskopiske klonale klynger, hvilket tyder på spredning af hæmatopoiese stammer fra individuelle HSPCs contiguously i marven, snarere end omfattende udbredelse af HSPCs via blodbanen. Der var mindre farve mangfoldighed på sene tidspunkter, hvilket tyder på vanskeligheder ved transduktion langsigtet genbefolkning celler med flere vektorer.
Desuden HSPCs dannede klynger i milten, et organ, også ansvarlig for hæmatopoiese i mus. HPSC-afledte individuelle celler kan løses i thymus, lymfeknuder, milt, lever, lunge, hjerte, hud, skeletmuskulatur, fedtvæv og nyrer så godt. 3D-billeder kan vurderes kvalitativt og kvantitativt at værdsætte fordelingen af celler med minimale forstyrrelser af vævene. Endelig vil vi illustrered muligheden for levende dynamiske studier i 4D ved at kombinere resonans scanning multiphoton og konfokal time-lapse billeddannelse. Denne metode gør det muligt for ikke-invasiv høj opløsning, multidimensionel celle-skæbne sporing af spektralt markerede celler populationer i deres intakte 3D arkitektur, der giver et stærkt værktøj i studiet af væv regenerering og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev opstaldet og håndteres i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health, og indskrevet i en NHLBI Animal Care og brug Udvalg-godkendt protokol. Kvinde B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (B) / BoyJ (B6.SJL) og C57BL / 6 mus, 6-12 uger gamle, blev anvendt som donor og modtager, hhv.
En liste over materialer, reagenser og udstyr findes i tabel 1.
1. Lego transduktion af Mouse HSPCs og knoglemarvstransplantation
Udfør procedurerne beskrevet nedenfor i en certificeret biosikkerhed niveau 2 (BSL-2) kabinet (vævskultur hætte).
- Produktionen af LEGO vektorer, der koder 5fps
- Brug lentivirale "Gene ontologi" (Lego) vektorplasmider, hver koder for en anden FP fra en stærk konstitutiv SFFV promotor, herunder Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), og Lego-C2 (mCherry) venligst stillet til rådighed af Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland); nu også tilgængelig fra Addgene 5-7.
- Til fremstilling af LEGO vektorer, frø 5 x 10 6 293T celler i 10 cm skåle (anvend 12 retter for hver vektor) 24 timer før transfektion i 8 ml I10 medie (IMDM suppleret med 10% FCS og glutamin / penicillin / streptomycin).
- Transficere cellerne med Calcium Fosfat hjælp af let ændrede anbefalinger CAPHOS kit:
- For hver plade mix 15 ug lego vektor, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug forrige-TAT, og 1 ug pMD2.G-VSV-G-plasmider i nærvær af 50 pi 2,5 M CaCl2, og tilsæt vand til opnåelse af en 500 ul totalvolumen.
- Bundfald DNA-plasmider med 500 ul 2x HeBS (HEPES saltvand) og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur før tilsætning til hver plade af 293T-celler.
- Cellerne inkuberes for6 timer i et 37 ° C 5% CO2-inkubator; fjerne mediet, og tilsæt frisk dyrkningsmedium 6 timer efter transfektion.
- Saml kultursupernatanter indeholdende lentivirale partikler fra hver plade, dagligt i 3 dage. Hver dag efter supernatant samling tilføje frisk I10 medier til hver plade.
- Filtreres gennem 0,22 um porer, pool og koncentrerer supernatanter ved ultracentrifugering på en SW28 rotor i 2 timer ved 71.900 xg og 4 ° C.
- Resuspender supernatanterne i 1 ml StemSpan medier. Alikvot lentivirale bestande i 200 pi og opbevares ved -80 ° C.
- Titrering af Lentiviral Partikler
Bestem titeren af LEGO vektor partikler i indsamlede supernatanter via kvantificering af transducerende enheder / ml under anvendelse af NIH3T3-celler. Titere tillader beregning af mængden af hver vektor supernatant nødvendig for at resultere i den ønskede relative mangfoldighed af infektion (MOI) for eksperimentel målceller.- Plade 5 x 10 4 NIH3T3-celler per brønd (plade med 12 brønde) i 2 ml I10 medier En dag før titrering.
- Forbered 5-fold seriefortyndinger af vektor supernatanter i I10 medier suppleret med protaminsulfat (4 mg / ml er 1.000 x).
- Fjern mediet fra cellerne, og erstatte med 500 pi supernatant fortyndinger indeholdende tilsvarende på 2, 0,8, 0,32 og 0,128 ul koncentreret virus.
- Bestem antallet (Nej) af tilstedeværende celler per brønd ved transduktion, tælle en kontrol godt.
- 6 timer efter transduktion, tilsættes 2 ml I10 medier og inkuberes i 3 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
- Cellerne høstes fra hver brønd med trypsin-EDTA og bestemme procentdelen af fluorescerende celler (% FP) via flowcytometri.
- Beregn titeren som følger gennemsnit titerne opnået for hver brønd (fortynding) resulterer i en% FP mellem 1 og 50%: Titer (vektor partikler / ml) = Ingenx% FP / Volumen af vektor supernatant (ml). Gennemsnittet af titre opnået for hver fortynding, hvis% FP er mellem 1 og 50%.
- Mus Cell Collection, Purification, transduktion og transplantation (vist skematisk i figur 1A tilpasset fra Malide et al. 4).
- Sacrifice donormus af en godkendt procedure. Harvest knoglemarv fra forreste og bageste lemmer: dissekere humeri, lårben og skinneben, grundigt at fjerne alle muskler, ledbånd og overskydende væv fra knoglerne, skæres på tværs i slutningen af hver knogle så tæt som muligt til det fælles, og skyl knoglemarven ud af knoglen ved hjælp af en 27-0 G kanyle på en sprøjte indeholdende I10 medier.
- Pelletere hele knoglemarvsceller i 10 minutter ved 500 xg, 4 ° C og lysere røde blodlegemer to gange med 50 ml ACK-buffer. Resuspender cellerne i 10 ml I10 medier.
- Renses afstamning negative (Lin-) progenitorceller med MACS afstamning udtømning kit ifølge en modificeret sæt protocol:
- Brug 30 pi Anti-biotin-mikroperler stedet for 10 ul / 10 7 celler; fuldføre vasketrinene med I2 medier (IMDM suppleret med 2% FCS) i stedet for buffer.
- Indsæt et vasketrin mellem inkubation med biotin-antistof-cocktail og inkubation med anti-Biotin mikroperler; og ækvilibrering af søjlen med I10 i stedet for buffer.
- Kultur Lin- celler i 48 timer ved et udgangspunkt densitet på 5 x 10 5 celler / ml i StemSpan medier suppleret med 10 ng / ml murin IL-3, 100 ng / ml murin IL-11, 100 ng / ml humant Flt-3 ligand og 50 ng / ml murin stamcelle faktor.
- Overfør 1 til 4 x 10 5 celler til 12-brønds plader coatet med RetroNectin og transducerer med LEGO supernatanter, hver ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 6-7 for at opnå 50% ekspressionseffektivitet for hver FP, i nærvær af StemSpan medier og cytokiner er beskrevet ovenfor, og 4 ug / ml protaminsulfat.
- Transducere cellermed hver Lego vektor individuelt som beskrevet i trin 1.3.5 og bland celler efter transduktion (betegnet Mix) eller co-transducere celler med alle 5 Lego vektor supernatanter samtidigt (betegnet Co). Fjern celler 24 timer senere, vaskes én gang med StemSpan medier uden cytokiner, og resuspender dem i StemSpan medier uden cytokiner til transplantation, eller overføre dem til frisk medie med cytokiner og kultur for yderligere 96 timer før konfokal mikroskopi og flowcytometri.
- Udfør knoglemarvstransplantation ved infusion af transducerede Lin- HSPCs via haleveneinjektion i 11 Gy endosis bestrålede modtagere (6-18 timer forud for transplantation) modtagere, i et volumen på 100 ul i en dosis celle pr mus svarende til 1 -4 x 10 5 Lin- celler oprindeligt udpladet til transduktion. I hvert forsøg transplantation en hel gruppe af dyr med samme population af transducerede donor BM-celler.
- Til in vitro karakterisering af transducerede HProduktresuméer, kultur cellerne i yderligere 4-5 dage i StemSpan suppleret med cytokiner og analysere ved flowcytometri for transduktion effektivitet og ved mikroskopi for farve mangfoldighed.
- Sacrifice individuelle mus og hente væv og organer til billeddannelse, på forskellige tidspunkter op til 120 dage efter transplantationen.
- Spray med ethanol pelsen af musen og incise huden på den ventrale side undgå hår formidling.
- Dissekere og punktafgifter ifølge standardprocedurer milten, knæhaselymfeknuder, lunge, hjerte, hud, fedtvæv, skeletmuskulatur, nyre, lever, samt hovedet til adgangen til calvaria.
- Alternativt kan du bruge calvaria eller oprette en knogle vindue for levende billeddannelse gentagne gange over tid 2,8,9 eller billedfiler overfladiske organer såsom hud og lymfeknuder i det levende dyr.
- Placer enkelte organer i 35 mm Antal 0 dækglas dyrkningsskåle i 50-10056, l PBS til afbildning af dem intakte uden sektionering, fiksering eller videreforarbejdning, som beskrevet i trin 2.5.
- For volumetrisk billedbehandling, holder organerne på i kold PBS indtil brug. For time-lapse imaging øjeblikkeligt går til billeddannelse organer i DMEM, 10% FBS indeholdende 20 mM HEPES ved 37 ° C
- Sacrifice individuelle mus og hente væv og organer til billeddannelse, på forskellige tidspunkter op til 120 dage efter transplantationen.
2. Konfokal og to-foton mikroskopi og billedanalyse
- Udfør mikroskopi billeddannelse ved hjælp af et Leica SP5 fem kanaler konfokal og multiphoton-system er udstyret med multi-line Argon, diode 561 nm, HeNe 594 nm, og HeNe 633 nm synlige lasere. Anvendelse i 2-foton tilstand, en pulserende femtosekund Ti: Sapphire (Ti-Sa) laser, justerbar til excitation fra 680 til 1.080 nm med spredning korrektion. Anvendelse i forsøg med rød-forskudt bps (tdTomato og mCherry), en optisk parametrisk oscillator (OPO) laser til at udvide produktionen bølgelængdeområdet så vidt 1,030-1,300 nm, sekventielt eller samtidigt med than Ti-Sa-laser.
- Billede forskellige væv ved hjælp af en HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA vand dypning mål (WD = 2,5 mm), en HC-PLAPO-CS 20X / 0,70 NA tør mål (WD = 0,6 mm), eller HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA nedsænkning i vand mål (WD = 0,6 mm).
- Opnå konfokal fluorescens spektre indsamler lambda stakke (xyλ) af udsendt lys i 5 NM-båndbredder på det synlige spektrum fra BM-celler transduceret med en enkelt FP Lego vektor samt af kontrol, ikke-transplanterede BM.
- Proces billeder med Leica LAS-AF v2.4.1 software til at skabe referencespektrer af alle 5 billeder samt autofluorescens (figur 2A). Anvendelse af enkelte FP spektre og forskellen i fluorescens lysstyrke (udtrykt som% af EGFP) i Shibuya (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) og mCherry (47%), der 5 sekventielle billeddannende kanaler som følger: Cerulean (458/468 til 482 nm), EGFP (488/496 til 514 nm), Venus (514/523 til 558 nm), tdTomato (561/579 til 597 nm), og mCherry (594/618 til 670 nm) (
- Validere præcis rammeprogrammer adskillelse, som celler transduceret med hver enkelt FP er kun synlige i den tilsvarende kanal og fraværende fra resten (figur 2C). Desuden er denne defineret multikanalstrategi skaber en enestående 5-kanaler "colorprint", der muliggør efterfølgende farve analyse og klonal sporing og har den fordel, at erhvervelse gange i forhold til spektral billeddannelse.
- Proces billeder med Leica LAS-AF v2.4.1 software til at skabe referencespektrer af alle 5 billeder samt autofluorescens (figur 2A). Anvendelse af enkelte FP spektre og forskellen i fluorescens lysstyrke (udtrykt som% af EGFP) i Shibuya (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) og mCherry (47%), der 5 sekventielle billeddannende kanaler som følger: Cerulean (458/468 til 482 nm), EGFP (488/496 til 514 nm), Venus (514/523 til 558 nm), tdTomato (561/579 til 597 nm), og mCherry (594/618 til 670 nm) (
- Separat fluorescensemission, i 2-foton tilstand af højeffektiv skik dichroic spejle og samle med en fire kanaler ikke descanned detektor (NDD) som følger: en dichroisk spejl på 568 nm efterfulgt af et dikroisk spejl på 465 nm, efterfulgt af et 452/45 nm filter emissionen for SHG eller autofluorescens og Cerulean, et 525/40 nm emission filter til EGFP eller Venus, og en 648 nm dikroisk spejl og 620/60 nm emission filter til tdTomato eller mCherry.
- Reveal strukturel information ved to-foton mikroskopi Intrinsic kontrast imaging (som beskrevet ovenfor) af væv autofluorescens fra elastin, NADH (spændt på 780 nm), og anden harmoniske genererede signal (SHG) fra knogler og fibrillært kollagen (ophidset på 920 nm eller 860 nm opsamles i en back-spredt retning) 10,11.
- For 3D volumen rendering, indsamle serie af xyz billeder (typisk 1 x 1 x 4 um 3 voxelstørrelsen) langs z-aksen ved 5 um intervaller over et interval på dybder (150-300 um) i hele knoglemarv og andre væv, over store områder med den flise funktion af software til automatisk at generere syet volumener, der omfatter en hel brystbenet grube, cirka 2,5 x 1,2 mm 2 (XY) og 300 m (z) (figur 2D-2E) og Movie 1.
- Billede calvarie marv direkte gennem kraniet uden sektionering 2, 8.
- Afsnit brystbenet langs sagittalplanet (gennemskæring) og dereftertværs ved samlingen mellem 2 brystbenet Fosse og billede gennem snittet ansigt 3,4,12 (Oversigt i figur 1B tilpasset fra Takaku m.fl. 3).
- Til 4D time-lapse billeddannelse anbringe frisk udskåret popliteale lymfeknude, milt, lunge eller calvariale knogleprøver uslebne på 35 mm nummer 0 dækglas dyrkningsskåle i 50-100 pi DMEM, 10% FBS indeholdende 20 mM HEPES ved 37 ° C og bruge 2-foton Ti-Sa excitation (860 nm) kombineret med konfokal excitation (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) og Leica resonans scanner (8000 Hz / sek), idet z-stakke (~ 80 um) 20 sek intervaller i op til 1 time.
- Til samtidig trefarvet 2P billeddannelse brug Ti-Sa tunet til 860 nm samtidig med OPO laser (tunet på 1.130 nm for tdTomato eller 1.140 nm mCherry) (Film 2).
- Genopbygning og analyse af 3D Mængder og 4D tidssekvenser
- Brug Imaris x64 softwer-version 7.6, eller alternative softwarepakker at omdanne den flisebelagte-stakke af rå billeder i volumen-renderet (3D) data fra fluorescerende celler inde knoglemarv og forskellige væv og eksportere dem som 3D-rotation film, som tidligere beskrevet 3,4 (Movie 1) trin-for-trin eksempel:
- I Imaris, Åbn z-stak billede; Vælg "Surpass" for at vise 3D-volumen visualisering.
- Brug "navigere" for at skrue omkring 360 °.
- Vælg "Animation" for at oprette en animation; bruge keyframes for at tilføje udvalgte synspunkter, zoom rotationer af volumen; Vist filmen, redigere efter behov og gemme filen i en ønsket film format (ex: avi, mov).
- Ved kvantitativ vurdering af de 3D-celle og klon frekvens, positioner, størrelser og distribution, videre proces z-stakke ved hjælp af Imaris XT moduler, som integrerer MATLAB programmer udfører distance measurements (ved hjælp af en afstand transformation algoritme) og klynger analyse, som tidligere beskrevet 3,4. Omdan sekvenserne af billedstakke over tid i volumen-afsmeltede fire-dimensionelle (4D) film med Imaris x64 software, og bruge stedet og overflade analyse for halvautomatiseret sporing af cellemotilitet i tre dimensioner ved hjælp autoregressive motion algoritmer.
- Udfør multispektrale analyse af celler på følgende måde: udpakke flerfarvede mærkede pletter ved at tilføje alle 5 kanaler gennem kanal aritmetik Imaris XT ind i en ny kanal; bestemme for alle pletter (celler) var den gennemsnitlige intensitet af fluorescens i hver af de fem komponenter kanaler. Eksporter værdierne i Excel-software til at plotte grafer viser den unikke "colorprint", dvs den relative% af hver FP i enkelte celle (Figur 2E graf). Ret datasættet for vævs afdrift, og beregne celle hastighed og forskydning over tid, spor længder, stier, og afstande; eksport værdier i Excel software at plotte grafer. Saml sammensatte figurer med Adobe Photoshop CSS 5-softwaren.
- Brug Imaris x64 softwer-version 7.6, eller alternative softwarepakker at omdanne den flisebelagte-stakke af rå billeder i volumen-renderet (3D) data fra fluorescerende celler inde knoglemarv og forskellige væv og eksportere dem som 3D-rotation film, som tidligere beskrevet 3,4 (Movie 1) trin-for-trin eksempel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hele-mount 3D konfokal / 2-foton mikroskopi rekonstruktioner af brystbenet knoglemarv tidsforløb afslørede transplantation og udvidelse af transplanterede co-5fps i et mønster med bemærkelsesværdige egenskaber: kloner optrådte klart afgrænset, homogent markeret med bred palet af farver i første omgang og fremskridt over tid til fortrinsvis at indeholde celler af hovedsagelig én farve. Konfokalmikroskopi opsætning og repræsentative eksempler på imaging 5fps-mærket HSPC i brystbenet knoglemarv er illustreret i figur 2 og Film 1 og 2.
Hele-mount 3D konfokal / 2-foton mikroskopi rekonstruktioner af intakte væv demonstrere muligheden for at spore skæbne farve mærket BM-afledte celler i længere tidsperioder i levende væv. Repræsentative eksempler på knoglemarv-afledte celler i hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske organer efter transplantation er vist i Fi gur 3.
Figur 1. Oversigt over de eksperimentelle procedurer. A) De skematiske trin illustrerer isolering af Lin- BM-celler, transduktion med LEGO vektorer, der koder en række FPS farvevarianter og reinfusion af transducerede celler ind-myelo-ablateret mus (knoglemarvstransplantation). B) knoglemarven (brystben, calvaria ), samt forskellige organer / væv blev undersøgt ved konfokal og to-foton mikroskopi på forskellige tidspunkter efter transplantation. Panel A er tilpasset fra figur 1 i Malide et al. 4 og panel B tilpasset fra figur 1 i Takaku et al 3.
2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Konfokalmikroskopi opsætning og repræsentativt eksempel for billeddannende 5fps-mærket HSPC i knoglemarven. A) Spectral (xyλ) billeddannelse bruges til at optage referenceemissionen spektre for hver FP, illustreret i normaliserede histogrammer pseudocolored med cyan (Cerulean), grøn (EGFP), gul (Venus), magenta (tdTomato) og rød (mCherry): ophidset ved 594 NM- (solid rød linje) i forhold til 561 NM- (stiplet rød linje) bølgelængde B) Fem kanaler, der er billede sekventielt emission af:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venus ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm), og mCherry (618-670 nm). Panelerne A og B er tilpasset fra figur 1 i Malide et al. 4 C) Billeddannelse af brystbenet BM fra mus transplanteret med transduceret med individuelle FP vektorer. Hver FP kun synlige i cellerne transduceret med den tilsvarende vektor afbildes i passende lmannel og fraværende fra de andre (ingen cross-talk). D, E) Anslag af transplantatet og udvidelse af transplanteret co-5FP markerede celler i knoglemarven in vivo. På dag 4 efter transplantationen (D) klynger af celler, der er markeret i bred vifte af farver var synlige tæt til benet kant (SHG, hvid), fortrinsvis placeret ved siden af samlingen mellem to grube. Ved dag 30 (E) en stor klon af unikke farve (grøn - gul) er blevet udvidet til at besætte hele grube som illustreret i den fusionerede samt enkelte kanaler billeder. Rammeprogrammer indhold analyse viser homogen censur ved 2 fps ved varianter EGFP og Venus.
Figur 3. Eksempler på knoglemarv-afledte celler i hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske organer efter transplantation. Forskellige tisSues og organer blev afbildet intakt gennem dybder af 150-200 um og store flader, beregningsmæssigt syet og gengives i 3D som skygge rekonstruktioner. A) popliteal lymfeknude 120 dage efter transplantationen demonstrerer spredte celler oftest markeret med gult (Venus) og rød (mCherry) perifert omgivet af kollagen fibre (hvide, SHG). B) Tilsvarende milt på samme tid, viser små klynger og for det meste spredte celler i forskellige farver sammenflettede af kollagen fibre netværk. C) i leveren fluorescerende celler med morfologi tyder på stjerneformige celler eller makrofager (Kupffers) af forskellige farver blev rettet ind langs kollagenfibrene netværk (SHG hvid) afgrænser hepatiske luftrør strukturer. D) I en hudlap afbildet fra dermale side fluorescerende celler i forskellige farver og morfologier blev set, de fleste med stor størrelse og morfologi tyder Langerhanske eller dendritiske-lignende identitet, LYIng under elastin fibre (autofluorescens på 780 nm, hvid) og langs kollagen (SHG på 920 nm, hvid) muskelfibre og hårsækkene. E) i hjertet set fra epikardial side talrige enkeltstående store fluorescerende celler med makrofag-lignende morfologi oprindelse fra flere kloner baseret på de forskellige farver ses er synlige overfladisk og også afbrudt dybere mellem kardiomyocytter (hvid) visualiseret ved deres indre to-foton autofluorescens (ved 780 nm). Ingen FP fluorescerende kardiomyocytter blev observeret. Nærliggende celler (CE) af samme farve tyder in situ proliferation og korte afstande migration. F) I lungen talrige fluorescerende celler med en mangfoldig palet af farver blev spredt over hele blonde-lignende struktur af kollagen fibre (SHG) på alle dybde niveauer, med variabel morfologier tyder dendritiske celle, makrofag, og type 2 pneumocytproliferation identiteter.
Film 1. 3D reopførelse af brystbenet BM ved 4 dage efter transplantationen Co 5fps. klynger af celler, der er markeret i bred vifte af farver var synlige i umiddelbar nærhed til benet kant (SHG, hvid), fortrinsvis placeret ved siden af samlingen mellem to grube. Klik her for at se denne film.
Movie 2. 4D tid bortfalder brystbenet BM to-foton og OPO mikroskopi på dag 39 efter transplantation Co 3 fps (Cerulean - hvid, Venus - gul, tdTomato - magenta) knogle (SHG i hvid). Bemærk flere statiske kloner markeret med gult eller i gul-magenta kombination støder op til knogle i modsætning til meget bevægelige individuelle myeloide stamceller. Klik her for at se denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her detaljerne i en kraftfuld metode nylig udarbejdet til klonal celle sporing, der kombinerer den store mangfoldighed genereres af kombinatorisk mærkning med 5FP-koder for Lego vektorer og billeddannelse med tandem konfokal og 2-foton mikroskopi for at opnå volumetrisk og dynamisk billeddannelse i levende væv. Dette udvidede brug af FP-baserede farvemarkering ved at optage konfokal spektral identitet i 5 "særskilte" 8-bit-kanaler. Således det relative forhold mellem Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, mCherry inden for hver celle skaber et unikt "colorprint" til identifikation af klonal afkom. Den flerfarvet mærkning af 5fps øger etiket palet med mere mangfoldighed, der blev vist især nyttig, når studere fordelingen, kontakter, flisebelagte arrangementer og konkurrencemæssige samspil mellem celler eller gruppe af celler af samme type i tætte vævsprøver. Kombineret med 2-foton excitation af iboende strukturelle træk ved forskellige væv ogorganer, kan vi spore farve markeret klonede celler i deres naturlige miljø uden behov for fiksering og fysisk sektionering. Demonstrationen at datterceller celler afledt fra individuelle stamceller bevarer en karakteristisk "farve-print" på trods af differentiering og proliferation blev demonstreret i vores offentliggjort undersøgelse, med hundredvis af differentierede celler, der findes i de enkelte in vitro kolonier (CFU), der viser den samme "colorprint."
Denne tilgang kombinerer fordelene ved encellede løst høj opløsning billeddannelse sammen med optisk sektionering via konfokal mikroskopi. Meget store X - Y (mm 2) regioner i den intakte tætte væv volumen kan undersøges ved at generere flisebelagte-billeder. Disse billeder i høj opløsning fra optiske dele kan bruges til beregningsmæssigt rekonstruere (automatisk og "on-the-fly") komplet 3D volumener af stor kompleksitet til dybder på ~ 30 um, der omfatter ~ 20-30 lag af celler,vaskulær, knogler og kollagen strukturer. 3D rekonstruktioner kan anvendes til morfometriske non-invasive kvantitative analyser af biologisk interesse. En vigtig advarsel at påpege, er, at stort volumen / høj opløsning billeddannelse er tidskrævende, for eksempel 1 time pr ~ 1 mm 3 af væv (en grube af brystbenet), derfor anbefaler vi billeddannelse ikke mere end 1 mus per eksperiment pr dag, når knoglemarven samt forskellige væv skal undersøges i detaljer.
Selv om det er i øjeblikket teknisk umuligt at afbilde brystbenet knoglemarv i samme mus gentagne gange over tid, kan værdifulde oplysninger fås ved at studere individuelle mus på forskellige tidspunkter fra en kohorte oprindeligt transplanteret med samme population af Lego-transducerede Lin- celler. Brystbenet er et fremragende sted at studere knoglemarv regenerering på grund af sin tidlige og komplet hæmatopoietisk rekonstruktion, stabilitet, nem sektionering, reproducerbarhed, og store volumen. Det er afgørende at nå tæt på 50% transduktion effektivitet Lin- celler for hver enkelt FP vektor, før man går videre med en transplantation og billedbehandling eksperiment med henblik på at have tilstrækkelig farve mangfoldighed og FP-udtrykkende celler til at gøre forsøget informativ. Der vil altid være et forbehold, at mere end en klon kan tilfældigt ender med tilsvarende eller identiske colorprints, især hvis transduktion er ineffektive og mange celler har kun en eller to insertioner. Det er også vigtigt at være sikker på, at hvert enkelt haleveneinjektion leveret tæt på 100% af dosis celle.
Dette beviser gennemførligheden af høj opløsning 4D leve dynamiske studier ved at kombinere resonans scanning multiphoton og konfokal time-lapse billeddannelse. Det giver ikke kun statisk karakterisering af forskellige kloner, men også analyse af kinetiske forskelle mellem cellerne markeret med samme farve. Desuden demonstrerer video-rate 4D billeddannelse af tre RP mærkede prøver beskæftiger successfully i tandem Tisa og OPO lasere til højere effektivitet, mindre skadelige, dybere penetration af levende væv, hvilket baner vejen for 2-foton intravital billeddannelse. Derudover etablerer en værdifuld mulighed for at spore celler i længere perioder (måneder) overvinde nuværende farvestofbaseret begrænsninger. Denne tilgang anvender kommercielt tilgængelige konfokal og to-foton laser mikroskop og automatiserede brugervenlige interaktive billede analysemetoder baseret på en kommercielt tilgængelig softwarepakke giver nem implementering i sædvanlige mikroskopi faciliteter.
Endelig er denne metode ikke begrænset til analyse af HSPCs. Mange biologiske systemer kunne drage fordel af muligheden for at løse spatiotemporale arrangementer af kloner komplekse cellulære og strukturelle elementer via flerfarvet mærkning og konfokal og 2-foton billedbehandling. Organregenerering, immunrespons, og tumor metastatiske mønstre kunne blive forhørt, at foreslå et par potentielle anvendelsesmuligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
