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Bioengineering

De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data

Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/51673
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3, 1, 1, 1,2
1Life Sciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 2Joint Bioenergy Institute, Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, 3National Energy Research Scientific Computing Center, Lawrence Berkeley National Laboratory

Summary

O gargalo para microscopia eletrônica 3D celular é a extração de características (segmentação) em alta complexidade mapas de densidade 3D. Temos desenvolvido um conjunto de critérios, que fornece orientação sobre qual abordagem de segmentação (manual, semi-automática ou automática) é o mais adequado para os diferentes tipos de dados, proporcionando, assim, um ponto de partida para a segmentação eficaz.

Abstract

Abordagens de microscopia eletrônica 3D modernos têm permitido recentemente visão sem precedentes sobre a organização 3D ultraestrutural de células e tecidos, permitindo a visualização de grandes máquinas macromoleculares, tais como complexos de adesão, bem como estruturas de ordem superior, como o citoesqueleto e organelas celulares em sua respectivo contexto celular e tecidual. Dada a complexidade inerente de volumes de células, é essencial para o primeiro extrair as características de interesse, a fim de permitir a visualização, a quantificação, e, por conseguinte, a compreensão da sua organização em 3D. Cada conjunto de dados é definida pelas características distintas, por exemplo, na relação de sinal-para-ruído, friabilidade (nitidez) dos dados, a heterogeneidade das suas características, lotação de características, a presença ou ausência de formas características que permitem a identificação fácil e a percentagem de todo o volume de que uma determinada região de interesse ocupa. Todas estas características devem ser consideradosno momento de decidir qual abordagem a tomar para a segmentação.

Os seis conjuntos de dados ultra 3D diferentes, apresentados foram obtidos por três imagens diferentes abordagens: resina incorporado tomografia elétron manchado, focada íon de feixe por intermédio e bloco de série microscopia eletrônica de varredura rosto- (FIB-SEM, SBF-SEM) das amostras levemente coradas e fortemente coradas , respectivamente. Para esses conjuntos de dados, quatro abordagens de segmentação diferentes foram aplicados: (1) construção de modelos totalmente manual seguido apenas por visualização do modelo, (2) segmentação traçado manual dos dados, seguido por prestação de superfície, (3) abordagens semi-automáticas seguido por prestação de superfície, ou algoritmos de segmentação de design personalizado (4) automatizados seguidos de renderização de superfície e análise quantitativa. Dependendo da combinação das características do conjunto de dados, verificou-se que tipicamente, um destes quatro métodos categóricos supera os outros, mas, dependendo da sequência exacta de critérios, more de uma abordagem pode ser bem sucedido. Com base nesses dados, propomos um esquema de triagem que classifica as duas características do conjunto de dados e critérios objetivos pessoais subjetivos para a análise dos diferentes conjuntos de dados.

Introduction

Tradicionalmente, a microscopia eletrônica de campo (EM) foi dividido em 1) o ramo da biologia estrutural usando TEM alta e super-alta resolução, geralmente combinados com dados implícitos ou explícitos média para investigar a) estrutura tridimensional (3D de complexos macromoleculares com uma composição definida e normalmente um tamanho relativamente pequeno 1-4, e 2) o ramo imagem celular em cenários celulares inteiras que são visualizados 1,5,6. Enquanto o ramo da biologia estrutural sofreu um desenvolvimento espetacular nos últimos quatro décadas, o ramo da biologia celular foi praticamente restrito a duas dimensões, muitas vezes, em amostras de menos-que-otimamente preservada. Somente com o advento da tomografia de elétrons na última década tem célula de imagem ultra-biológica expandiu-se para a terceira dimensão 5,7, onde normalmente a média não pode ser realizada como os cenários celulares e, assim, as características de interesse, são tipicamente único.

Embora as cenas visualizadas celulares são muitas vezes deslumbrante para os olhos, a extração eficiente dos recursos de interesse e análise quantitativa posterior de tais volumes celulares altamente complexos ficam atrás, em parte porque a composição de proteína precisa é geralmente desconhecida, portanto, tornando-se um desafio para interpretar estes celular volumes 3D. Para esta data, uma vasta experiência biológica é muitas vezes necessária para interpretar tomograms complexas, ou mesmo para identificar as regiões importantes e componentes essenciais no volume 3D. Como uma complicação adicional, visualização de volumes 3D é notavelmente não-trivial. Volumes 3D pode ser pensado e assim exibir como pilhas de imagens 2D. Inspecção fatia-a-fatia de imagens 2D sequenciais reduz a complexidade, mas também possuem limites de extracção e análise quantitativa, assim, para as duas dimensões. No entanto, para a maioria dos objetos 3D, a representação de volumes 3D apenas como uma pilha de planos consecutivos leva a uma incompleta umad perspectiva enviesada em 3D a natureza de um sistema particular. Modos alternativos de inspeção visual, necessitem de renderização de volume ou prestação superfície, o que, dada a natureza muitas vezes densa de um celular volume-pode facilmente levar a uma visão obstruída de objetos aninhados ou sobrecarregar um usuário por completo, tornando assim segmentação manual interativo difícil.

Para suprir estas barreiras, uma grande variedade de extração de características automatizado (segmentação) abordagens têm sido desenvolvidos que são tipicamente quer Densidad ou 8-10 baseado em gradiente. No entanto, estes métodos tendem a segmentar todo o volume independentemente de quais áreas ou recursos são de interesse para o especialista, apesar de alguns métodos recentes pode direcionar uma característica específica de interesse, como os filamentos de actina 11. Além disso, os programas de execução segmentação automatizada pode, por vezes, resultar na produção de um grande número de sub-volumes (por exemplo, quando se aplica immersio bacias hidrográficasn segmentação), que muitas vezes precisam ser fundidas manualmente de volta para compreendendo toda a característica de interesse ou ser submetido a uma nova segmentação. Isso vale particularmente para conjuntos de dados complexos e cheios de gente, assim algoritmos de computador mais de renderização são incapazes de extrair apenas as características de interesse com fidelidade, e esforços substanciais de curadoria por um especialista muitas vezes são necessários para produzir um volume segmentado desejado.

Além disso, soluções personalizadas para um problema muito específico muitas vezes são publicados como um documento de reunião científica, com pouca ou nenhuma ênfase em fazer-lhes ampla e ferramentas abrangentes acessível a pesquisadores que não têm conhecimento íntimo dos campos da matemática, ciência da computação e / ou computação gráfica. Um ambiente de software de programação personalizada, contendo uma série de bibliotecas de análise de imagem, pode ser um poderoso conjunto de ferramentas que permite aos usuários escrever de forma eficiente os seus próprios módulos de segmentação precisa. No entanto, esta abordagem requer extformação ensive e um fundo em ciência da computação, a fim de tirar proveito de suas muitas características ou capacidades para análise de imagem. Pode-se trabalhar dentro de um ambiente tão versátil software para determinados conjuntos de dados, onde os recursos são mais escassos, por exemplo, através da utilização de poderosas abordagens baseadas na forma que se baseiam na geometria original de "modelos" para separar os objetos de interesse de seus arredores 12,13 .

Uma variedade razoável de pacotes de visualização de gráficos de computador existem para segmentação manual interativo e modelo de construção. Alguns pacotes estão disponíveis comercialmente, enquanto outros são de origem acadêmica e distribuídos gratuitamente, tais como: University of California San Francisco Chimera 14, University of Colorado Imod 15, e da Universidade do Texas, Austin VolumeRover 16. No entanto, a grande variedade e complexidade de recursos e capacidades desses programas possuem steepens a curva de aprendizado each. Certos programas de visualização fornecem modelos geométricas simples, tais como esferas e varas de vários tamanhos, os quais podem ser colocados em mapas de densidade, a fim de criar um modelo simplificado do volume 3D complexo. Estes modelos, em seguida, permitir que as medições geométricas e volumétricas simples e, portanto, ir além de apenas a "imagem bonita". Tal método manual de objectos funciona bem para os volumes, onde apenas um pequeno número dos objectos necessitam de ser identificados e extraída. No entanto, o recente desenvolvimento de grandes volumes de imagens ultra 3D usando microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) 17-20 ou microscopia eletrônica de varredura face do bloco de série (SBF-SEM) 21 apresenta a complicação adicional de que o tamanho dos dados 3D conjuntos podem variar de gigabytes a dezenas e centenas de gigabytes e até mesmo os terabytes. Portanto, tais grandes volumes 3D são praticamente inacessíveis para extração de características manual e, portanto, eficiente façanha semi-automatizado guiado pelo usuárioextração ure será um dos gargalos para a análise eficiente dos volumes 3D em um futuro previsível.

Apresentamos aqui quatro abordagens de segmentação diferentes que são rotineiramente usados ​​em uma grande variedade de tipos de imagem biológicos. Estes métodos são então comparados para a sua eficácia para diferentes tipos de conjuntos de dados, permitindo uma compilação em um guia para ajudar os biólogos decidir o que pode ser a melhor abordagem de segmentação para extração de características eficaz de seus próprios dados. Como manuais do usuário detalhados estão disponíveis para a maioria dos programas descritos, o objetivo não é fazer os usuários potenciais familiarizado com qualquer um destes pacotes particulares. Em vez disso, o objetivo é demonstrar os pontos fortes e limitações dessas estratégias de segmentação diferentes, aplicando-os a seis exemplo conjuntos de dados com características diversas. Através desta comparação, um conjunto de critérios que têm sido desenvolvidos baseiam-se em qualquer das características da imagem objectivas doConjuntos de dados em 3D, como o contraste de dados, crocância, lotação, e complexidade, ou tronco a partir de considerações subjetivas, como o objetivo desejado para segmentação, morfologias dos recursos a serem segmentados, a densidade populacional das características de interesse, ou seja, a fração de o volume ocupado pela característica de interesse, e como se procede de forma ideal com recursos finitos, como tempo e disponibilidade de pessoal. Estes exemplos de diferentes conjuntos de dados de ilustrar a forma como estes critérios objectivos e subjectivos podem ser aplicados sequencialmente em uma variedade de combinações, para se obter um emparelhamento de certas abordagens de extracção de característica com certos tipos de conjuntos de dados. As recomendações dadas, esperamos ajudar os novatos diante de uma grande variedade de opções de segmentação de escolher a abordagem de segmentação mais eficaz para o seu próprio volume 3D.

Embora o foco deste trabalho é a extração de características, a atenção para a coleta de dados e os dados de pré-processamento é crucial para s eficientesegmentation. Muitas vezes, a coloração das amostras pode ser irregular, e portanto, potenciais artefactos de coloração deve ser considerado no processo de segmentação. No entanto, a mancha geralmente dá maior relação sinal-ruído e, portanto, requer menos de filtragem e outros tratamentos matemático de volumes celulares, o que poderia também resultar em artefatos. Os respectivos conjuntos de dados de imagem em bruto precisa ser adquirida com as configurações de contraste e pixel câmera correta, alinhado e reconstruído em um volume 3D. Para tomografias, imagens alinhadas são reconstruídos normalmente utilizando ponderada volta-projecção, e, em seguida, o conjunto de dados é geralmente submetida a algoritmos denoising tais como a difusão não-linear 22 anisotrópica, filtragem bilateral 23, ou mediano recursiva filtragem 24. Dados de imagem FIB-SEM-SBF e SEM são alinhados por cortes transversais consecutivos correlacionando-em programas que utilizam XY como ImageJ 25. Aumento de contraste e de filtragem pode ser aplicado para aumentar as características deinteresse e, portanto, a de-ruído a pilha de imagens. A filtragem pode ser realizada quer em todo o volume antes de subvolume selecção ou nas subvolumes seleccionados, como abordagens de filtragem pode ser dispendiosa. A sub-amostragem dos dados (criação de faixas), que às vezes é usado para redução de ruído e / ou redução de tamanho de arquivo, só é recomendado se os dados tiverem sido oversampled significativamente em comparação com a resolução antecipada.

Após redução de ruído, as imagens processadas podem ser segmentados por vários métodos, eo foco neste estudo é sobre os quatro seguintes: (1) geração do modelo abstraído o manual através da criação de um modelo de bola-e-vara, (2) traçado manual de características de interesse, (3) densidade à base de limiar automático, e (4) segmentação automatizada sob medida por meio de um roteiro para a segmentação de projeto específico. Segmentação limite de 8 e segmentação watershed imersiva 10 são melhores alternativas para limite simples, mas they pertencem à mesma categoria e não foram incluídas explicitamente nesta discussão.

Rastreamento manual de densidades requer delineando as características de interesse, corte-a-slice, que permite a manutenção da densidade original das respectivas áreas sub-celular. Esta abordagem permite o máximo controle do processo de segmentação, mas é um processo demorado e trabalhoso.

Abordagens de segmentação densidade (e afins) com base em limiares automáticos são semi-automática, onde um algoritmo escolhe pixels com base em um conjunto de parâmetros definidos pelo usuário. Vários acadêmicos (grátis) pacotes de visualização, tais como UCSF Chimera, Imod, Fiji 26, e VolumeRover estão disponíveis, bem como comercial (exigindo licenças pagas) pacotes, e ambos os tipos normalmente incluem um ou mais dessas abordagens de segmentação. Os pacotes de software utilizados neste trabalho para ilustrar esses diferentes métodos incluem ambos os programas comerciais e acadêmicas s abertasource programas para gerar manualmente um modelo abstrato, bem como a segmentação densidade manuais e automatizados. No entanto, o software de fonte aberta pode, por vezes, oferecer opções mais avançadas, através da possibilidade de personalização.

Uma comparação destas técnicas que utilizam diferentes tipos de conjuntos de dados levou à seguinte apresentação de regras e orientações sobre como abordar a segmentação de diversos volumes de dados biológicos 3D, que a nosso conhecimento ainda não foi publicada. Assim, esta é a primeira comparação sistemática das diferentes abordagens e sua utilidade em conjuntos de dados com diferentes características para usuários com diferentes objetivos.

Protocol

1. Manual Abstracted Modelo de Geração

Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Chimera, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar. Use essa abordagem quando o único objetivo é criar um modelo geométrico (por exemplo, um modelo de bola e stick), a fim de fazer medições geométricas, em vez de exibir a forma de volume dos objetos.

  1. Importe o volume de dados em um programa adequado para a geração do modelo abstraído manual.
    1. Selecione Arquivo> Abrir Mapa de puxar para cima a caixa de diálogo Abrir Arquivo. Navegue até o local do mapa desejado arquivo.
    2. Puxe o Visualizador de Volume (Ferramentas> volume de dados> Volume Viewer) e selecione Recursos> Estilo de exibição para exibir dados com diferentes estilos de renderização.
    3. Ajuste o limite para a apresentação, arrastando a barra vertical no histograma no Visualizador de Volumejanela.
  2. Navegue pelo volume 3D (por exemplo, fatia por fatia) para selecionar uma área de interesse para a segmentação e recortar um sub-volume menor, se necessário.
    1. Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, clique em Eixo, em seguida, selecione X, Y, ou Z.
    2. Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, selecione Recursos> Planes. Clique One para definir Profundidade para apresentar o plano correspondente ao número na caixa à esquerda, e clique em Todos para exibir todos os planos.
    3. Na caixa de diálogo Visualizador de Volume, selecione Recursos> seleção sub-região.
      1. Clique e arraste para criar uma caixa retangular em torno da região de interesse.
  3. Coloque marcadores ao longo da característica de interesse e conectá-los com ligantes se for o caso (muitas vezes feito automaticamente pelo programa) até que o modelo esteja completo.
    1. Na barra de menu Visualizador de Volume, selecione Ferramentas>Diálogo Tracer Volume para abrir o diálogo Volume Tracer. Na caixa de diálogo Tracer Volume, selecione File> New marcador Set.
    2. Na caixa de diálogo Tracer Volume, verifique Mouse> Coloque marcadores em alta qualidade, marcadores de lugar em planos de dados, Mover e redimensionar marcadores, Link novo marcador para marcador selecionado, e Link consecutivamente marcadores selecionados.
    3. Clique na amostra de cores marcador, e selecione uma cor. Repita este passo para a cor Link.
    4. Digite raios para o marcador e link elementos de construção de modelos.
    5. Na Janela Tracer Volume, selecione marcadores de lugar com o botão [direita] do mouse, e inserir raios de marcadores e links.
    6. Clique com o botão direito sobre os dados de volume para começar, que estabelece marcadores. Marcadores serão conectados automaticamente.
    7. Na caixa de diálogo Tracer Volume, selecione Arquivo> Salvar conjunto marcador atual, depois em File> Fechar marcador set.
    Abra um novo conjunto marcador (Passo 1.3.1) para iniciar a construção de um modelo em uma segunda característica desejada de interesse. Utilize cores contrastantes entre as séries de marcadores para enfatizar as diferenças de características.

2. traçado manual de características de interesse

Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Amira, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar. Use essa abordagem quando a densidade populacional é relativamente pequena e quando a precisão da extração de características é fundamental, já que o traçado manual é uma abordagem demorado.

  1. Dados de volume de importação para um programa com opções de traçado manual. Software com esta capacidade geralmente oferecem, pelo menos, uma ferramenta básica pincel.
    1. Para grandes volumes ou tomografias (por exemplo, 16-bit 2048 x 2048 ou maior .rec ou .mrc tomogramas gerada em Imod): Selecionar Dados Abertos> Botão direito do mouse sobre filename.rec> Formatar ...> Selecione Raw como LargeDiskData Ok> Load. Selecione Raw apropriado parâmetros de dados a partir de informações de cabeçalho> OK. Alterne e Salvar como um novo filename.am arquivo para uso nas etapas seguintes.
    2. Para arquivos menores 3D imagem Pilha (por exemplo, .tif 3D ou .mrc ou .rec): Open Data> Select filename.tif ou filename.mrc. Alternar e clique direito> Salvar como filename.am . Se um erro é gerado ou o programa não está respondendo, o arquivo pode ser muito grande e pode ser aberto seguindo a Etapa 2.1.1.
  2. Navegue através das fatias para selecionar um sub-volume 3D para a segmentação, e em seguida, cortar a esta área de interesse.
    1. Na janela 3D Viewer, selecione Orthoslice para abrir arquivo de imagem. Use controle deslizante na parte inferior para navegar por fatias.
    2. Para cortar dados maiores abertos como LargeDiskData, alternar nome do arquivo na janela Piscina> clique com o botão direito> LatticeAccess. Enter tamanho da caixa desejada> Aplicar. Salve novo arquivo.
  3. Criar arquivo de segmentação.
    1. Alterne o arquivo na janela do Exterior> Clique direito> Etiquetagem> LabelField. Um novo arquivo será criado e carregado automaticamente no separador Segmentação Editor.
  4. Traçar a fronteira da primeira característica de interesse, em seguida, preencher o traço à mão ou usando um comando específico para o software utilizado. Siga o recurso de interesse através de todas as fatias e repita a segmentação rastreamento manual. Utilize os seguintes comandos ao usar Amira:
    1. Para usar a ferramenta Pincel, alterar o tamanho do pincel, como desejado, em seguida, usar o mouse para traçar a fronteira da característica de interesse.
    2. Preencha a área traçada com atalho "f". Adicione a seleção clicando no botão com o símbolo de mais, ou o atalho "a". Se necessário, pressione "u" para desfazer, e "s" para subtrair ou apagar.
    3. Gerar uma renderização de superfície para visualização e qualitativa básica ou análise quantitativa por software de instruções do guia do usuário.
      1. Na guia Objeto Pool, alternar o nome do arquivo-labels.am na janela de Piscina> clique com o botão direito> SurfaceGen.
      2. Selecione Propriedades superfície desejada> Aplicar. Um novo filename.surf arquivo será criado no exterior.
      3. Para visualizar o volume segmentado, alternar filename.surf na janela Piscina> clique com o botão direito> SurfaceView.
      4. Use as ferramentas na janela de 3DViewer para mover, girar e ampliar o volume 3D.
    4. Extraia as densidades exatas e determinar medidas como volume ou a superfície. Exportação para outros programas para visualização mais avançada, análise e simulação.
      1. Na janela 3DViewer, clique em ferramenta de Medida> Selecione a opção apropriada (comprimento e ângulo 2D 2D para medições em um único plano 2D, 3D e comprimento Ângulo 3Dpara a medição em um volume 3D).
      2. Clique na superfície de malha para medir o comprimento desejado, distância e ângulos. Os valores serão listados na janela Propriedades.

    3. automatizada segmentação baseada na densidade

    Nota: Os detalhes da metodologia descrita a seguir são específicos para Amira, mas outros pacotes de software pode ser usado em seu lugar.

    1. Use essa abordagem em conjuntos de dados com toda a variedade de contraste, nitidez, ou lotação para retirar as densidades de interesse.
    2. Dados de volume de importação para um programa equipado com thresholding, varinha mágica, ou outras ferramentas baseadas em densidade para segmentação automática. Siga os passos descritos no 2.1-2.1.2 Nas instruções de rastreamento manual.
    3. Navegue através fatias e selecione a área de segmentação. Se necessário, cortar um menor sub-volume 3D para a segmentação. Siga os passos descritos no 2.2-2.2.2 Nas instruções de rastreamento manual.
    4. Seleccione a densidade deuma característica de interesse, normalmente, clicando ou a colocação de um marca ou âncora ponto sobre o recurso. Se for permitido no software, insira um intervalo de números abrangendo intensidade de pixel do recurso e ajustar a tolerância como desejado. Densidades pertencentes ao recurso será escolhido de acordo com a intensidade do pixel ou tolerância do valor da âncora. Utilize os seguintes comandos ao usar Amira.
      1. Use a ferramenta Magic Wand para recursos com margens distintas.
        1. Clique na área de interesse, em seguida, ajustar controles deslizantes na exibição e Masking para capturar correto intervalo de valores para que o recurso é totalmente destacado. Adicionar seleção com atalho "a".
      2. Use a ferramenta de Threshold para recursos sem margens claramente distinguíveis.
      3. Selecione o ícone do Threshold. Ajuste deslizante para ajustar a densidade dentro da faixa desejável para que apenas as características de interesse são mascarados. Clique no botão Selecionar, em seguida, adicione seleção com atalho220; uma ".
      4. Para o volume de todo segmento, selecione todas as fatias antes de acrescentar seleção.
      5. Para eliminar o ruído, selecione Segmentação> Remover Islands e / ou segmentação> rótulos suaves.
    5. Gerar uma superfície para visualização e análise qualitativa, conforme descrito na seção traçado manual 2.6-2.6.2. Se desejar, a exportação para outros programas para exibição em 3D adequada, análise quantitativa e simulações.

    4.-customizado Automated Segmentação

    Nota: Use essa abordagem para criar scripts personalizados para segmentação automática, que requer experiência anterior em ciência da computação, mas permite que a capacidade de criar um modelo de densidade precisa de um grande volume.

    1. Ferramentas (exemplo específico de Segmentação Supervisionada-Shape em MATLAB 27)
      1. Imagem de pré-processamento:, remoção de fundo e realce de imagem Execute de-noisingusando o seguinte gasoduto:
        1. Carregar a imagem usando o comando imread.
          1. Na linha de comando, digite: >> im = imread ($ image_path), onde $ image_path é a localização da imagem a ser analisada.
        2. A partir da caixa de ferramentas de processamento de imagem, chamada de filtro Wiener usando uma proporção estimada ou conhecida Noise-poder-para-sinal (NSR).
        3. Na imagem processada anteriormente, chame a função de abertura imagem imopen para estimar a camada de fundo, em seguida, atribuir o resultado como uma máscara diferente.
          1. Na linha de comando, digite:. >> Background = imopen (im, Strel ($ shape_string, $ size)), neste método, $ shape_string é igual a 'disco' a variável $ tamanho é dado pelo analisador ie >> background = imopen (im, Strel ('disco', 15)).
        4. Subtrair a imagem filtrada com o fundo.
          1. Na linha de comando, digite: >> im2 = im -fundo
        5. Consoante a qualidade dos resultados, realizar a normalização da imagem, com ou sem processo adaptativo do Otsu 28, que pode ser chamada usando o imadjust função do Processamento de Imagem de ferramentas.
          1. Na linha de comando, digite: >> IM3 = imadjust (im2)
        6. Prepare as características de interesse para a segmentação, o que limita as regiões de interesse cortando a imagem normalizada.
          1. Usando o comando imtool, explorar a região de interesse que está a ser cortada e fornecer as coordenadas para o comando: >> im3_crop = imcrop (IM3, [x1 y1 x2 y2]), onde o vetor [x1 y1 x2 y2] corresponde a região quadrado a ser cortada.
      2. Forma reconhecimento / classificação forma Supervisionado: treinar o algoritmo, fornecendo exemplos específicos para cada tipo diferente de objetos (traços lineares em uma imagem 2D através das características de interesse).
        1. Verifique se VLFEAT 29 API foi instalado com sucesso e visite o site da VLFEAT para documentação mais aprofundada.
        2. Na linha de comando, digite: >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, $ K, $ NLEAVES) onde $ K é o número de cluster para ser usado ou o número de classes o observador quer organizar os dados em, e US $ NLEAVES é o número desejado de conjuntos da folha, ou seja, >> [TREE, ASGN] = VL_HIKMEANS (im3_crop, 4100)
        3. Use os recursos segmentados manualmente como entrada para VLFeat.
          NOTA: Esta biblioteca de código aberto baseado em C irá executar patch pixel remendo clustering, e posicionamento do centro do cluster, dependendo do tipo de método escolhido para funcionar melhor para os conjuntos de dados. As opções disponíveis variam a partir de k-agrupamento significativo a base texton aproxima-30, e a saída é uma matriz numérica que descreve as características desejadas de acordo com os exemplos apresentados.
    2. Segmentação: Utilize este fully automatizado, embora dispendiosa, abordagem ao segmento de múltiplas classes de objetos simultaneamente, que serão escritos como mapas separados para posterior visualização e análise.
      1. Coloque a matriz numeral gerado anteriormente (modelo).
      2. Chame a função de máquina de vetor de suporte (SVM) em VLFeat, utilizando o modelo ea imagem a ser segmentado como uma entrada.
        1. Na linha de comando, entre: >> [w, b] vl_svmtrain = (x, y, 0.1), em que x é o original imagem recortada im2_crop e y é o objectivo da imagem, a imagem que foi segmentado manualmente. Use >> ISEG = VL_IMSEG (I, etiquetas) para colorir os resultados de acordo com os rótulos gerados pelo clustering.
          NOTA: Com base nas características do modelo, VLFeat classificará a imagem do número de classes (características de interesse) atribuídos desde o início. Dependendo do grau de precisão desejado, é possível combinar este método com outras abordagens ou estimativa clustparâmetros er, tais como centros de casco e de fragmentação. A saída do algoritmo SVM é um modelo probabilístico e várias máscaras binárias das classes pretendidas nos novos conjuntos de dados.
      3. Salve resultados, digitando o comando: >> imwrite (im, $ formato, $ filename) onde $ formato é 'tiff' e $ filename é o caminho para o arquivo de saída.
      4. Para visualizar as imagens, digite o comando: >> imshow (im).

Representative Results

A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho típica em microscopia electrónica de imagem 3D celular, incluindo a tomografia de electrões, FIB-SEM, e SBF-SEM. O fluxo de trabalho inclui a coleta de dados em bruto, alinhamento de dados e reconstrução em um volume 3D, redução de ruído através da filtração, e quando necessário, recorte para a região de interesse, a fim de maximizar a eficácia do software de segmentação escolhida. Esses dados pré-processados ​​está pronta para a extração de características / segmentação.

A Figura 2 ilustra o fluxo de trabalho dispostas na Figura 1 com quatro conjuntos diferentes de dados (que serão introduzidas mais abaixo), duas das quais são amostras embebidas em resina gravados por tomografia de electrões (Figuras 2A, 2B), com as outras duas, decorrentes da FIB -SEM e SBF-SEM, respectivamente (Figuras 2C e 2D). Imagens em Figura 2 coluna 1 são: a projeçãovisualizações (Figuras 2A1, 2B1) e imagens da superfície do bloco (Figuras 2C1, 2D1), respectivamente, que após o alinhamento e reconstrução são montados em um volume 3D. A coluna 2 mostra fatias através de tais volumes 3D, o qual após a filtragem (coluna 3) mostram uma significativa redução do ruído e, assim, muitas vezes aparecem mais nítido. Depois de selecionar e cortar o grande volume 3D para a região de interesse (coluna 4), renderings 3D de características segmentadas de interesse (coluna 5) podem ser obtidos e ainda inspecionado, codificados por cores e analisados ​​quantitativamente.

Um total de seis conjuntos de dados 3D, cada um contendo uma pilha de imagens obtidas através de tomografia ou de elétrons (3 conjuntos de dados), FIB-SEM (2 conjuntos de dados), ou SBF-SEM (1 conjunto de dados) são utilizadas para comparar a forma como cada um quatro métodos de segmentação executar (Figura 3). Os conjuntos de dados provêm de uma variedade de diferentes projetos de pesquisa em laboratório e, assim, fornecer arconjunto easonably diversificado de conjuntos típicos de dados experimentais. Todos os conjuntos de dados foram examinados por quatro pesquisadores independentes, cada um dos quais está mais familiarizado com uma abordagem particular, e eles foram acusados ​​de fornecer o melhor resultado possível para cada um dos seis conjuntos de dados.

Os conjuntos de dados são a partir de amostras da seguinte forma: 1 Números 3A1-3A5: alta pressão congelado, congelar-substituído e incorporado por resina pinto o cabelo da orelha interna estereocílios das células 31, 2. Figuras 3B1-3B5: maior congelado pressão, Freeze- substituído e parede celular vegetal embebido em resina (não publicado), 3. Figuras 3C1-3C5: alto congelado pressão, congelam-substituído e incorporado por resina cinocílio células ciliadas do ouvido interno (não publicado), 4. Figuras 3D1-3D5: alta pressão- congelado, e substituído por congelação de blocos embebidos em resina de mitocôndrias localizados em células das glândulas mamárias humanas epiteliais HMT-3522 S1 ácinos, que foram cultivadas em laminina extracelular ricomatriz ular 32,33, 5. Figuras 3E1-3E5: limite de membrana de células vizinhas do HMT: processado-bancada, blocos embebidos em resina de um sulfato redutor de biofilme bacteriano (manuscrito em preparação), e 6 Figuras 3F1-3F5 unstained -3522 S1 ácinos.

Como pode ser visto a partir da Figura 3, as diferentes abordagens de segmentação pode levar a resultados semelhantes na maior parte para alguns tipos de conjuntos de dados, mas os resultados completamente diferentes para outros tipos de dados. Por exemplo, o conjunto de dados estereocílios das células ciliadas (Figura 3A) produz volumes de segmentação razoáveis ​​com as quatro abordagens, com o modelo abstraído Manual gerada por um usuário experiente de ser o mais claro de interpretar e medir. Neste caso, tal modelo permite medições rápidas de distâncias filamento de filamento, a contagem do número de links encontrados entre os filamentos alongados, bem como a determinação das partes em falta do mapa de densidade correspondentepara locais onde o espécime foi danificado durante a preparação da amostra 34. Essa informação é muito mais difícil de adquirir, usando as outras três abordagens de segmentação, embora a segmentação automatizada sob medida proporciona melhores resultados do limiar puramente baseado em densidade.

Para a parede da célula da planta (Figura 3B), a geração modelo manual pareceu ser o mais eficaz na transmissão de uma sensação de ordem na parede da célula, que nenhuma das outras abordagens obter. No entanto, o modelo abstraído não captura a lotação dos objetos do conjunto de dados. Manualmente recursos de rastreamento de interesse parece dar um resultado melhor do que as abordagens baseadas em densidade ou forma-supervisionados. Por outro lado, o traçado manual é muito trabalhoso e identificando fronteiras dos recursos é um pouco subjetivo. Portanto, abordagens automatizadas podem ser preferidos para segmentar grandes volumes com um potencial trade-off entre precisão erecursos gastos na segmentação manual.

Para o conjunto de dados cinocílio (Figura 3C), a geração do modelo abstracto Manual produz o resultado mais limpo e revela uma arquitectura inesperada de três microtúbulos no centro da cinocílio, um pormenor que é facilmente visível nas dados cortadas, mas perdido em todas as outras abordagens , presumivelmente devido à heterogeneidade manchar. No entanto, outras características potencialmente cruciais do mapa de densidade são perdidas na geração manual de um modelo abstrato. Isto é devido ao facto de a natureza subjectiva da formação modelo manual conduz a uma idealização de abstracção e a densidade real observada, e, por conseguinte, para uma interpretação subjectiva durante a formação do modelo. Assim, este exemplo demonstra muito bem como o manual de geração do modelo abstraído permite se concentrar em um aspecto específico do volume 3D. No entanto, a percepção seletiva e simplificação deixa de dar um relato completo de tudo o co proteínamplexes presentes no conjunto de dados. Portanto, se o objectivo é o de mostrar a complexidade dos dados, em seguida, uma for melhor servida com qualquer um dos outros três abordagens.

No caso de a matriz-cultivadas glândula mamária ácinos 3D (Figura 3D), as mitocôndrias são segmentados de alto contraste de todos os quatro abordagens com facilidade, com o método manual de características não é muito surpreendente produzindo os melhores resultados com a menor quantidade de contaminação ( Figura 3D3). No entanto, o rastreamento manual é muito trabalhoso e, portanto, de uso limitado para grandes volumes. Ambos limiar baseado na densidade e segmentação automática supervisionada em forma de extrair as mitocôndrias muito bem, e resultaria em uma segmentação quase perfeito, se mais truques para limpeza são empregados (por exemplo, eliminando todos os objetos abaixo de um determinado limiar de densidade voxel) como disponível em diferentes pacotes. Neste caso, manual de construção modelo captada não deuresultados promissores, em parte porque a mitocôndria não pode facilmente ser aproximado com modelos de esfera e de vara.

No que diz respeito ao solo comunidade bacteriana / biofilme (Figura 3E), três dos quatro abordagens deu resultados satisfatórios, com a geração modelo manual não realizando assim devido ao desafio de representar objectos biológicos, tais como as bactérias, por formas geométricas. Apêndices extracelular provenientes das bactérias podem ser detectadas nas abordagens de segmentação automatizados, mas não tão bem no traçado característica manual. Segmentação sob medida Forma-supervisionado automatizada pode separar ainda mais as características das bactérias extracelulares, apesar das suas densidades semelhantes (dados não mostrados), o que permite fácil quantificação do mesmo extremamente grandes conjuntos de dados. Porque este é originalmente um conjunto muito grande de dados, a segmentação automática sob medida claramente suplantado todas as outras abordagens, mas pode ter beneficiado da baixa complexidadeea distribuição relativamente escassa dos objetos de interesse (baixa lotação).

Ao examinar a interface entre duas células eucarióticas num contexto de tecido semelhante (Figura 3F), apenas o método manual de características de interesse produzido bons resultados. Abordagens de segmentação baseada na densidade automatizados falhar na detecção do limite da membrana entre as células adjacentes no total, e até mesmo as abordagens sob medida falhar, em parte, porque a forma de uma célula não é facilmente aproximadamente equacionada ou com formas, apesar do sucesso evidente para as bactérias no biofilme (Figura 3E5).

A observação da Figura 3 que as abordagens de segmentação fazem bem em alguns conjuntos de dados, mas não em outros levou à pergunta sobre o que caracteriza cada um destes conjuntos de dados, e se era possível categorizar os tipos de características de dados ou objectivos pessoais que pareciam combinar bem com seu respective abordagem. O estudo sistemático do tema não tenha sido previamente realizada, e, portanto, como um primeiro passo de um estabelecimento de uma lista empírica de características da imagem e os objetivos pessoais podem orientar um novato em sua tentativa de encontrar a melhor abordagem para extração de características de seus respectivos conjuntos de dados.

Foram identificadas oito critérios como significativa são mostrados na Figura 4, e estes podem ser divididos em duas categorias principais: (1) as características que são inerentes ao conjunto de dados, e (2) os objectivos pessoais do investigador e outras considerações que são um pouco mais subjetiva, embora igualmente importante. Os exemplos apresentados são predominantemente extraídas dos seis conjuntos de dados na Figura 3, com três conjuntos adicionais de dados a ser introduzidos: um (Figura 4A1) é um crio-tomografia de uma crio-secção de parede celular de plantas de Arabidopsis thaliana, a segunda (Figuras 4A2 , 4B1, 4D1 Figuras 3F1-3F5 mas é ainda mais complexo substancialmente, e o terceiro (Figuras 4b2 , 4D2) é uma secção de resina tomografia de estereocílios células ciliadas do ouvido interno, em vista em corte transversal, semelhante à da amostra mostrada na vista longitudinal em Figuress 2A1-2A5 e 3A1-3A5.

Para a categoria dos critérios objectivos, como as características da imagem, quatro traços inerentes aos conjuntos de dados são propostos como sendo de importância:

  1. O contraste dos dados pode ser (1) baixa (Figura 4A1) como é típico para tomogramas crio-EM, (2) intermédio (Figura 4A2), tais como em cenários celulares sem organelo clara ou outra característica proeminente permanente, ou (3) de alta (Figura 4A3), como é o caso da kinocitomograma liary ou estereocílios na seção transversal, devido ao alinhamento de elementos filamentosos claramente separadas dentro da direção z.
  2. Os dados podem ser difusa (Figura 4B1), sem limites visivelmente claras entre dois objetos de perto posicionados, tais como as células em um tecido, ou batata frita (Figura 4B2), com fronteiras bem definidas. Isto é, em parte, uma função do conjunto de dados de resolução, que é inerentemente mais elevado por um factor de cerca de 2-4 por tomografias de electrões em relação ao FIB-SEM. Naturalmente, as fronteiras nítidas são desejáveis ​​tanto para manual, bem como abordagens de segmentação automática, mas essencial para a última abordagem.
  3. Os mapas de densidade pode ser lotado (Figura 4C1) como refletido pelos componentes da parede celular vegetal bem espaçadas, ou de baixa densidade populacional (Figura 4C2), assim como as bactérias em uma colônia, que exemplifica a separação que torna a segmentação automatizada imagem substancialmente mais fácil.
  4. Mapas de densidade pode ser altamente complexa, com características muito diferentes, muitas vezes, com formas irregulares, tais como tecido da estria vascular em torno de um vaso sanguíneo (Figura 4D1) ou organelos semelhantes a objectos bem definidos, com uma organização semelhante, tais como a secção transversal de estereocílios ( Figura 4D2).

Observe também os muito diferentes escalas em todos os diferentes exemplos, tornando a comparação um pouco difícil.

Para além dos critérios mais objetivos, como as características da imagem, quatro critérios altamente subjetivos que irão orientar a seleção do caminho adequado também são propostas:

  1. Objetivo pretendido: O objetivo pode ser o de visualizar o cabelo pacote stereocilium em sua complexidade e para determinar e examinar a forma do objeto (Figura 4E1), ou para criar um modelo de bola e vara simplificada e abstraída que está embutido no mapa de densidade e permite uma rápida uma contagemª medição dos objetos geométricos (comprimento de filamento, a distância eo número de conexões) (Figura 4E2).
  2. A morfologia característica pode ser altamente irregular e complexo, como as células, tais como as zonas de interacção célula-célula (figura 4F1), tanto em forma semelhante, com algumas variações, tais como as mitocôndrias (figura 4F2), ou na sua maioria em forma idêntica, tal como os filamentos de actina e transversal elos de uma madeixa de cabelo na orientação longitudinal (Figura 4F3).
  3. A proporção da característica de interesse (densidade populacional) é importante, pois pode-se querer segmento todos os recursos em um conjunto de dados 3D, como é o caso de paredes celulares das plantas (Figura 4G1), ou apenas uma pequena fração do volume celular como é o caso das mitocôndrias em uma cena celular heterogénea (Figura 4G2). Dependendo do tamanho do conjunto de dados e a percentagem de volume que requer uma segmentação, isto pode ser mais eficiente ao utilizarabordagens manuais. Em outros casos, tais como quando se está interessado em uma variedade de recursos, simplesmente não há alternativa ao uso de abordagens semi-automatizado de segmentação.
  4. Outro critério subjetivo fundamental é a quantidade de recursos se está disposto a investir no processo de segmentação e qual o nível de fidelidade é necessária para responder a uma questão biológica. Um pode querer e precisar para quantificar parâmetros volumétricos de um recurso (como tamanho, volume, área de superfície, comprimento, distância de outros recursos, etc), caso em que pode ser necessário mais cuidado para obter informações quantitativas precisas (Figura 4H1), ou o efeito pode ser o de simplesmente tirar uma foto de sua forma 3D (Figura 4H2). Em um mundo ideal, onde os recursos são ilimitados, uma claramente não gostaria de assumir nenhum compromisso, mas sim optar pelo caminho mais preciso de extração de características manual assistida por usuário. Embora isso possa funcionar para muitos conjuntos de dados, em um futuro próximo volumes 3D wil l ser da ordem de 10k por 10k por 10k ou superior e segmentação manual não será mais capaz de desempenhar um papel de destaque na segmentação de um enorme espaço. Dependendo da complexidade de dados e outras características dos dados, a segmentação de semi-automatizada pode tornar-se uma necessidade.

Na Figura 5, os pontos fortes e as limitações são brevemente coletados para as quatro abordagens de segmentação. Os objetivos pessoais e características da imagem identificados na Figura 4, que pode emparelhar com cada abordagem são descritos também. Na Figura 6, os objetivos pessoais e características da imagem dos seis conjuntos de dados exemplificam como a triagem de dados e decidir sobre a melhor abordagem. Ambas as figuras 5 e 6 são expandidas na discussão.

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Figura 1 Fluxo de trabalho para a reconstrução de imagem biológica e análise. Este quadro dá uma visão geral dos vários passos dados para coletar e processar imagens recolhidas por tomografia, focada Ion Beam SEM, e serial bloco rosto SEM. Raw resultados de coleta de dados em série tilt 2D ou cortes seriados. Estes conjuntos de imagens 2D devem ser alinhadas e reconstruídos em 3D, em seguida, filtrada de modo a reduzir o ruído e para melhorar o contraste de características de interesse. Finalmente, os dados podem ser segmentados e analisados, resultando em um modelo 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2.. Exemplos de fluxo de trabalho para diferentes tipos de dados de tomografia e FIB-SEM Cada etapa do fluxo de trabalho após a coleta de dados é mostrado através de quatro conjuntos de dados (linhas AD): resina embutidos tomografia manchado de estereocílios seccionados longitudinalmente, resina incorporado tomografia manchado da parede celular vegetal celulose, FIB-SEM de mitocôndrias de células epiteliais da mama, e a SBF-SEM de E. coli bactérias. Uma fatia 2D através dos dados em bruto está indicado na coluna 1, e uma imagem a partir dos dados, após alinhamento e reconstrução 3D compreende coluna 2 As técnicas de filtragem aplicada na coluna 3, são os seguintes: filtro de mediana (A3), filtro de difusão não-anisotrópica (B3), Gaussian Blur (C3), e filtro imadjust do MATLAB (D3). Um exemplo do melhor segmentação para cada conjunto da área cultivada de juros (coluna 4) os dados são exibidos como renderizar um 3D na coluna 5. Barras de escala: A1-A3 = 200 nm, 150 nm = A4, A5 = 50 nm, B1-B3 = 200 nm, B4-B5 = 100 nm, C1-C3 = 1 mm, C4-C5 = 500 nm,D1-D3 = 2 mm, D4-D5 = 200 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3 Aplicação de quatro abordagens para a segmentação exemplo conjuntos de dados Seis exemplo conjuntos de dados foram segmentados por todas as quatro abordagens:. Geração manual de abstraída modelo, traçado manual automatizado de segmentação baseada em densidade e segmentação automatizada sob medida. A geração manual modelo abstraído foi eficaz para a resina incorporado tomografia manchado de estereocílios (A), como o objetivo era criar um modelo para fins quantitativos, em vez de extrair densidades. Para a resina incorporado tomografia manchado de parede celular vegetal (B), segmentadas automatizada baseada em densidadeção foi o método mais eficaz para extrair rapidamente a celulose através de muitas fatias, onde, como os métodos manuais levou muito mais esforço em apenas algumas fatias de dados. A geração manual modelo abstraído gerado o trio de microtúbulos na tomografia manchado de cinocílio (C), enquanto que outros métodos de segmentação não fez, no entanto, as duas abordagens automatizadas extraído das densidades mais rapidamente e, portanto, eram preferidos. Devido à forma de mitocôndrias de FIB-SEM de células epiteliais da mama (D), marcação manual, desde que o resultado mais limpo, e a baixa densidade populacional com o uso de métodos de interpolação são autorizadas para segmentação rápido. Dado o grande volume que precisa ser segmentada, a segmentação automática sob medida provou ser mais eficiente para segmentar os dados bactérias SBF-SEM (E), mas ambas as abordagens automáticas eram comparáveis. Apesar de demorado, o único método para extrair o FIB-SEM da membrana das células epiteliais da mama (F) foi traçado manual barras de escala.:A1-A5 = 100 nm, B1-B5 = 100 nm, C1-C5 = 50 nm, D1-D5 = 500 nm, E1-E5 = 200 nm, F1-F5, bares = 500 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. características da imagem objetiva e objetivos pessoais subjetivas para triagem de conjuntos de dados. Usando exemplos do conjunto de dados características, os critérios são propostos para informar a decisão de qual abordagem de segmentação de usar. Com relação às características objectivas, os dados podem inerentemente têm contraste que é baixa, média ou alta (A1-A3), estar fora de foco ou batata frita (B1-B2), espaçadas ou lotado (C1-C2), e tem complexo ou simplesmente recursos organizados (D1-D2). Objetivos pessoais subjetivas incluem o desejado bjective destinada a um modelo simplificado ou extrair as densidades exactas (E1-E2), para identificar uma folha enrolada, o volume convoluta, ou morfologia linear como a característica de interesse (F1-F3), a escolha de uma alta ou baixa densidade populacional da característica de interesse (G1-G2), e decidir sobre o trade-off entre a alta fidelidade e alta de alocação de recursos para um retorno cada vez menor em investimentos, tais como o tempo (H1-H2) barras de escala.: A1 = 50 nm, A2 = 1500 nm , A3 = 100 nm, B1 = 1500 nm, B2 = 200 nm, 100 nm = C1, C2 = 200 nm, D1 = 10 mm, D2 = 200 nm, 100 nm = E1, E2 = 50 nm, F1-F2 = 500 nm, F3 = 50 nm, 100 nm = G1, G2 = 1 mm, H1-H2 = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5 Tabela de comparação de características de dados e visa subjetiva apropriado para diferentes abordagens de segmentação. Esta tabela resume os pontos fortes e limitações de cada abordagem de segmentação. Os critérios de Figura 4 pode ajudar a identificar quais os conjuntos de dados são adequados para o método de segmentação. Estas características da imagem objetivos e metas pessoais subjetivas foram escolhidos para uso otimizado de cada abordagem, mas diferentes combinações podem impedir ou melhorar a eficácia da segmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6 Decisão fluxograma para eficiente tcasa- de segmentação se aproxima para conjuntos de dados com características variadas. Baseado nas características em destaque na Figura 4, este diagrama mostra que quatro critérios a que mais contribuiu para a decisão final sobre a melhor abordagem de segmentação para cada conjunto de dados Figura 3. Cada conjunto de dados é codificados por cores para acompanhar rapidamente as linhas grossas representam o processo de tomada de decisão primária, bem como as linhas pontilhadas, que reflectem um caminho alternativo que pode ou não levar à mesma abordagem. Os cinocílio, bactérias e conjuntos de dados da parede celular vegetal foram mais segmentado, com as duas abordagens automatizadas. Em contraste, os caminhos da membrana celular e mitocôndrias sempre levar a cópia manual devido às suas características difíceis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Estratégias eficazes para a extração de características relevantes de volumes EM 3D são urgentemente necessárias, a fim de manter-se com o tsunami de dados que atingiu recentemente imagem biológica. Embora os dados possam ser gerados em horas ou dias, são necessários muitos meses para analisar os volumes 3D em profundidade. Portanto, é evidente que a análise de imagem tornou-se o gargalo para descobertas científicas; sem soluções adequadas para estes problemas, os cientistas de imagem se tornam vítimas de seu próprio sucesso. Isto é em parte devido à grande complexidade dos dados e também a aglomeração de macromoléculas tipicamente encontrado em células biológicas, que as proteínas e complexos proteicos uma borda outra, e, essencialmente, aparecem como um gradiente contínuo de densidade em escala de cinzentos. O problema é complicado pela preparação de amostras e de imagem imperfeições e, em alguns artefatos de reconstrução da imagem dos casos, levando a menos do que perfeito dados volumétricos que podem representar desafios para abordagem totalmente automatizadaes. O mais significativo, porém, é o fato de que os especialistas em preparação de amostras, tratamento de imagens, ea interpretação biológica raramente são bem versados ​​em ciência da computação, e, portanto, necessitam de orientação sobre como abordar de forma eficaz a extração de características e análise. Por conseguinte, através do uso de vários exemplos, o protocolo explica como preparar dados para segmentação, bem como os passos para a geração Manual abstraída modelo, segmentação automatizada baseada em densidade, marcação manual de características de interesse, e a segmentação automatizado sob medida. As abordagens manuais e automáticos descritos no procedimento pode ser encontrada numa grande variedade de software de segmentação, alguns dos quais são aqui mencionadas, mas outros executam funções semelhantes e são igualmente adequadas.

Os resultados demonstram que a eficácia de cada um dos métodos de segmentação 3D varia para cada tipo diferente de conjuntos de dados. Embora as diferentes abordagens s produzidos qualitativamenterenderings 3D imilar como o produto final, a quantidade de tempo e esforço gasto em cada um durante o processo de segmentação variou significativamente. As recomendações para as características da imagem apropriados e objetivos pessoais por abordagem de segmentação são resumidos na Figura 5, o que é explicado nas quatro subseções seguintes. Estes critérios foram aplicados para os seis conjuntos de dados, como mostrado no diagrama de fluxo de decisão da Figura 6. Embora Figuras 5 e 6 são meramente para fornecer uma justificativa para cada conjunto de dados e como cada um dos critérios foram ponderados no processo de tomada de decisão, eles não fornecem uma orientação infalível, mas sim um ponto de partida. Há simplesmente demasiados critérios que influenciam o processo de tomada de decisões: algumas são critérios objectivos, tais como as características do conjunto de dados, enquanto outros são critérios mais subjetivos, como o objetivo desejado. É seguro dizer que os conjuntos de dados que exibem um alto level de contraste com fronteiras nítidas, têm características que são bem separados e relativamente homogênea (não muito diversificada), e são processados ​​com o objetivo de apresentar um modelo de densidade para um grande número de objetos, abordagens automatizadas será superior, se não para o fato de que as abordagens manuais seria simplesmente de recursos (tempo) -prohibitive. Por outro lado, se o contraste é baixo, os dados é confuso e, portanto, requer o conhecimento de um especialista, os objetos estão lotados, e as características mostram uma alta diversidade e são, portanto, heterogêneo, não pode ter qualquer outra escolha a não extração de características manual / segmentação.

Manual de Abstracted Modelo de Geração

Manual de abstraída traçado modelo é particularmente eficaz na segmentação de elementos lineares, proporcionando pontos sementes (bolas) que podem ser conectados automaticamente (sticks). Essas bolas e paus-modelos pode ser muito poderosa para medir o comprimento de umnd orientação de tal modelo e fornecer um modelo adequadamente captada tanto para inspeção qualitativa e análise quantitativa. Geração do modelo abstraído manual é comumente usado quando minimizando recursos gastos na análise é mais importante do que a fidelidade absoluta para as formas dos dados originais. É o mais bem sucedido com características lineares e homogêneas de interesse (por exemplo, filamentos, tubos). Os dados de contraste, nitidez, e aglomeração não desempenham um papel importante na determinação do sucesso do método, enquanto que o olho humano é capaz de reconhecer o objecto de interesse. Por vezes, tais modelos pode também ser utilizado como um esqueleto para o segmento de mapa em 3D, em uma zona em torno do esqueleto. Embora o modelo é abstrato e não um reflexo de densidades exatas, ele representa uma versão esqueletizada da densidade 3D e, portanto, permite a visualização livre de desordem e análise qualitativa. As medições quantitativas, tais como o comprimento pode também ser determinada a partir do modelo aproximada. Para umaexemplo de software com o manual de geração do modelo abstraído, visite o guia do usuário detalhado do Chimera on-line em http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html .

Rastreamento manual de características de interesse

Pincel traçado manual funciona bem com quase todas as características de dados, mas também é o mais método consome tempo. Às vezes, é a única técnica para extrair uma característica de interesse a partir de um conjunto de imagens complexo contendo uma grande variedade de recursos, como a membrana celular fina e complicada. Uma ferramenta útil disponível em alguns programas permite a interpolação entre fatias intermitentemente segmentados quando o recurso de interesse muda suavemente. Manual de rastreio pode ser aplicado de forma mais eficiente se os dados é nítido e tem a forma de alto contraste, mas também pode ser utilizadapara conjuntos de dados mais desafiadoras, desde que o usuário está familiarizado com o objeto de interesse. A complexidade de dados pode variar de objetos discretos para conjuntos de dados complexos e lotados, onde os objetos estão intimamente embalados. Neste último caso, a segmentação manual pode ser a única opção, como abordagens automáticas muitas vezes lutam para segmentar o volume desejado e extrair muito ou pouco. Morfologias apresentam difíceis, tais como folhas ou volumes complicadas, também pode ser extraído por meio deste método. No entanto, o usuário deve ter em mente que um conjunto de dados com várias características difíceis só podem ser segmentados se a densidade populacional das características de interesse é baixo, como segmentação de altas densidades populacionais das características de interesse torna-se tempo proibitivo. Para um exemplo de software com traçado manual, visite o guia de usuário detalhado do Amira online em http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

Segmentação automática à base de Densidade

Em contraste com as técnicas manuais, os métodos automatizados são geralmente menos demorado, o que é um fator importante a considerar quando se segmentar uma grande pilha de imagens. No entanto, limite simples pode não ser tão preciso, e muito mais tempo pode ser gasto em requinte e curadoria do volume automaticamente segmentado. Segmentação baseada em densidade automatizado funciona melhor em conjuntos de dados que exibem um grande número de características semelhantes de interesse que todos necessitam de segmentação. Se os dados é mais complexa, essas técnicas automatizadas ainda pode servir como um passo inicial, mas provavelmente vai exigir alguma intervenção manual para baixo da linha, a fim de especificar um subvolume contendo a característica de interesse. Esta estratégia geralmente funciona bem em morfologias lineares ou volumes complicadas, mas raramente é bem sucedida com folhas convolutas finas, comomembranas celulares. Mínima intervenção do usuário com abordagens automatizadas permite a segmentação através de volumes grandes ou pequenos, enquanto gastando poucos recursos do usuário, tais como tempo, em troca de alta fidelidade. Para um exemplo de software com a segmentação baseada em densidade automatizado, visite o guia do usuário detalhado do Amira online em http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf .

Sob medida Automated Segmentação

Segmentação automatizada sob medida permite a personalização do poder de algoritmos para um conjunto de dados específico, mas muitas vezes é específica para o conjunto de dados ou tipo de dados, adequados para um número limitado de características de recurso, e não pode ser generalizada facilmente. O procedimento apresentado aqui difere das abordagens de segmentação automatizados gerais, tais como a imersão de bacias hidrográficas e outro nível métodos set, que dependem de uma determinação programada de pontos críticos de sementes, seguido de expansão cubo-marchando rapidamente a partir desses pontos de sementes. Uma variação sobre este tema é a segmentação fronteira, onde a informação gradiente informa limites de recursos. Em contraste, o script de personalização utilizado aqui baseia-se na formação de uma fase em que o utilizador manualmente traça alguns exemplos. Através da aprendizagem de máquina, algoritmos específicos irá detectar e, em seguida, aprender a reconhecer de forma independente propriedades e características de dados consistentemente encontrados nos traços. Um usuário experiente pode treinar os algoritmos e melhorar a precisão da segmentação, incluindo mais exemplo rastreia para fornecer um conjunto maior de critérios metragens. No geral, limiarização e abordagens afins, ou mesmo sob medida abordagens podem não ser tão útil para extrair uma única característica de interesse de uma imagem com a diversidade complexa de organelas ou formas, como a curadoria pode ser tão trabalhoso como o rastreamento manual.

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Estratégias para Triagem de dados e escolher uma abordagem de segmentação

Tendo em conta os critérios subjetivos e objetivos apresentados na Figura 4 e resumo dos conjuntos de dados adequados na Figura 5, o sistema de tomada de decisão descrito na Figura 6 pode ajudar uma avaliação eficaz das estratégias de extração de características para uma grande variedade de conjuntos de dados. Os conjuntos de dados é feita uma triagem em quatro decisões consecutivas, cada uma das quais pode incluir qualquer um dos quatro respectivos objectivos, bem como as quatro critérios subjectivos introduzidas na Figura 4. Como um exemplo, a Figura 6 é o racional para a triagem de cada um dos seis dados conjuntos mostrado na Figura 3. Sem dúvida, para cada conjunto de dados, não há um único caminho único, mas sim caminhos diferentes através dessa matriz seguintes critérios diferentes para a tomada de decisão que pode levar to o mesmo ou diferente recomendação para segmentação de dados. Enquanto cada conjunto de dados terá seu próprio conjunto de propriedades que não podem ser previstos, seis exemplos são dados, cada par com uma explicação sobre a lógica por trás o recurso preferido abordagem de extração / segmentação. Mais ainda incluir uma proposta para uma rota alternativa decisão que tanto os resultados da utilização da mesma ou de uma diferente abordagem de segmentação (Figura 6).

O cinocílio é um conjunto com limites claramente definidos, o que torna as abordagens automatizadas mais probabilidade de êxito dados nítidos. Todas as características de interesse são bem separados, novamente favorecendo uma abordagem automatizada. Além disso, as características de interesse são semelhantes uns aos outros, tornando-se um conjunto de dados relativamente homogénea ideal para segmentação sob medida. Por fim, o objetivo era extrair todo o recurso, favorecendo uma abordagem semi-automática. Em consequência, concluiu-se que um limiar automatizado (linha verde sólido), bem como um (por exemplo, a forma de segmentação supervisionada) abordagem de design personalizado (linha verde pontilhada) são ambos propensos a fazer bem a este conjunto de dados.

Critérios similares, embora colocado em uma ordem diferente da rede tomada de decisão, são aplicáveis ​​para o caso de bactérias. Uma abordagem sob medida é recomendada, em parte, porque este conjunto de dados era muito grande; portanto, recursos limitados proibir um manual abordagem intervenção / segmentação de trabalho intensivo. Enquanto limiar teria rendido resultados aceitáveis, a abordagem de design personalizado foi capaz de executar principal objectivo do estudo para separar as formas bacterianas arredondadas dos depósitos de metais extracelulares, localizados quer no meio da bactéria ou ao lado das bactérias, e, portanto, o abordagem sob medida foi preferido.

Para conjuntos de dados estereocílios, a primeira consideração foi o objetivo desejado: o objetivo pode ser o de mostrar toda a densidadeou para criar modelos geométricos. O volume de juros era uma área movimentada, eo objetivo era segmento um grande número de objetos como objetos separados, a fim de executar posteriormente análise volumétrica quantitativa, incluindo comprimentos, números, distâncias, orientação, etc Era útil que os objetos de interesse foram principalmente lineares, e este feito geométrica modelo traçando o método de escolha. No entanto, se em vez disso o objetivo foi mostrar toda a densidade, a morfologia característica linear, bem como relativamente alto contraste com fronteiras bem definidas faria um protocolo de limiar automático viável.

As membranas celulares e casos de dados mitocôndrias são um desafio para abordagens automatizadas devido às suas categorias de morfologia característica: folhas complicado e volumes, respectivamente. O objetivo é traçar o contorno de célula ou mitocôndrias com precisão, mas há recursos finitos só para fazê-lo. Além disso, as características de, interest são complexos e não podem ser facilmente detectadas ou moldar-codificado automaticamente, embora para a mitocôndria dados define a abordagem de script personalizado feita para as bactérias podem, eventualmente, ser aplicada com uma personalização. Felizmente, a membrana e as mitocôndrias si só representam uma pequena fracção do volume total e, portanto, o rastreio manual é uma abordagem simples ainda que demorado. Rastreamento manual também é o método de escolha para esses conjuntos de dados quando o contraste é bastante baixo e as fronteiras são bastante confuso. Como resultado, mesmo que constituem uma parte significativa dos conjuntos de dados, tais folhas convolutas deve ser traçada manualmente, simplesmente devido à falta de uma alternativa melhor.

O conjunto de dados de plantas posou seus próprios desafios, pois o objetivo era segmento todos os objetos, que são densamente espaçados e compõem um cenário lotado. Exibindo a densidade como está permitirá medições sobre a forma ea organização dos objetos, mas because segmentar manualmente cada objeto filamentosa é muito caro, limiarização automática foi utilizada em seu lugar.

Os vários passos e os resultados correspondentes a criação de um modelo 3D foram indicados aqui, mas mais importante ainda, as características dos dados pessoais e os critérios que se verificou ser importante na determinação do melhor caminho de segmentação também foram elucidados. As características importantes dos dados de imagem incluem-se o que é descrito aqui como o contraste, aglomeração, friabilidade, e o número de diferentes formas ou características (por exemplo, organelos, filamentos, membranas). Critérios subjetivos a serem considerados incluem o objetivo desejado de segmentação (medição / contagem, representação skeletonized dos dados / exibindo volumes em renderings 3D), as características morfológicas da característica de interesse (linear, alongado, em rede, complexa, complicada), a densidade de características de interesse em relação a todo o volume (a fração dos objetos que sãoimportante e precisa ser extraído), e equilibrar as vantagens e desvantagens de gastar recursos a fidelidade da segmentação dos dados originais eo retorno sobre o investimento a diminuir, resultando em melhorias incrementais para substancialmente maior alocação de recursos.

O campo de segmentação de imagem amadureceu significativamente ao longo dos últimos anos, ainda não há nenhuma bala de prata, nenhum algoritmo ou programa que pode fazer tudo. Tamanhos conjunto de dados tem crescido de centenas de megabytes para rotineiramente dezenas de gigabytes, e agora eles estão começando a exceder terabytes, tornando segmentação manual quase impossível. Assim, mais recursos precisam ser investidos nas abordagens de extração de características inteligentes e tempo efetivo que imitam o processo de tomada de decisão humana. Terá Tais esforços para ser combinado com (1) sistema de informação geográfica (SIG) à base de bases de dados hierárquicas semânticas (semelhante ao Google Earth), (2) técnicas de captação de dados (ou seja, a transiçãoa partir de um voxel a representação geométrica / volumétrica) compatível com desenho assistido por computador (CAD) software, a fim de reduzir significativamente a quantidade de dados e permitindo assim a visualização de volumes maiores de 35, (3) técnicas de simulação, como eles são usados ​​com freqüência na disciplinas de engenharia, bem como (4) animação avançado e criação de filmes capacidades, incluindo animações mosca-through (semelhante ao que é desenvolvido para a indústria de jogos).

Claramente, a extração de características eficiente e segmentação está no cerne desta vinda revolução em imagens de alta resolução celular, e ao mesmo tempo será sempre necessária melhores abordagens, os princípios aqui apresentados, bem como os exemplos do que abordagem foi feita para diferentes tipos de dados , irá fornecer algumas informações valiosas para a tomada de uma decisão sobre qual abordagem a adoptar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amira FEI Visualization Sciences Group http://www.vsg3d.com/amira/overview
Chimera UCSF http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Fiji/ImageJ National Institute of Health http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/
IMOD Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells http://bio3d.colorado.edu/imod/
Photoshop Adobe http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html
MATLAB MathWorks http://www.mathworks.com/
VLFeat VLFeat http://www.vlfeat.org/

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References

  1. Auer, M. Three-dimensional electron cryo-microscopy as a powerful structural tool in molecular medicine. J Mol Med (Berl). 78 (4), 191-202 (2000).
  2. Johnson, M. C., Rudolph, F., Dreaden, T. M., Zhao, G., Barry, B. A., Schmidt-Krey, I. Assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography. Journal of visualized experiments JoVE. (44), e1846 (2010).
  3. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Gibson, G. A., Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. Journal of visualized experiments JoVE. (76), e50386 (2013).
  4. Meng, X., Zhao, G., Zhang, P. Structure of HIV-1 capsid assemblies by cryo-electron microscopy and iterative helical real-space reconstruction. Journal of visualized experiments JoVE. (54), e3041 (2011).
  5. Chen, S., McDowall, A., et al. Electron Cryotomography of Bacterial Cells. Journal of visualized experiments JoVE. (39), e1943 (2010).
  6. Meyerson, J. R., White, T. A., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments JoVE. (58), e2770 (2011).
  7. Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
  8. Bajaj, C., Yu, Z., Auer, M. Volumetric feature extraction and visualization of tomographic molecular imaging. J Struct Biol. 144 (1-2), 132-143 (2003).
  9. Lin, G., Adiga, U., Olson, K., Guzowski, J. F., Barnes, C. A., Roysam, B. A hybrid 3D watershed algorithm incorporating gradient cues and object models for automatic segmentation of nuclei in confocal image stacks. Cytometry A. 56 (1), 23-36 (2003).
  10. Volkmann, N. A novel three-dimensional variant of the watershed transform for segmentation of electron density maps. Journal of Structural Biology. 138 (1), 123-129 (2002).
  11. Rigort, A., Günther, D., et al. Automated segmentation of electron tomograms for a quantitative description of actin filament networks. Journal of structural biology. 177 (1), 135-144 (2012).
  12. Cremers, D., Rousson, M., Deriche, R. A Review of Statistical Approaches to Level Set Segmentation. Integrating Color, Texture, Motion and Shape. International Journal of Computer Vision. 72 (2), 195-215 (2007).
  13. Lin, Z., Davis, L. S. Shape-based human detection and segmentation via hierarchical part-template matching. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 32 (4), 604-618 (2010).
  14. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Zhang, Q., Bettadapura, R., Bajaj, C. Macromolecular structure modeling from 3D EM using VolRover 2.0. Biopolymers. 97 (9), 709-731 (2012).
  17. Giannuzzi, L. A., Stevie, F. A. A review of focused ion beam milling techniques for TEM specimen preparation. Micron. 30 (3), 197-204 (1999).
  18. Heymann, J. A. W., Hayles, M., Gestmann, I., Giannuzzi, L. A., Lich, B., Subramaniam, S. Site-specific 3D imaging of cells and tissues with a dual beam microscope. Journal of structural biology. 155 (1), 63-73 (2006).
  19. Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of visualized experiments JoVE. (53), e2588 (2011).
  20. Wirth, R. Focused Ion Beam (FIB) combined with SEM and TEM: Advanced analytical tools for studies of chemical composition, microstructure and crystal structure in geomaterials on a nanometre scale. Chemical Geology. 261 (3-4), 217-229 (2009).
  21. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
  22. Frangakis, A. S., Hegerl, R. Noise reduction in electron tomographic reconstructions using nonlinear anisotropic diffusion. Journal of structural biology. 135 (3), 239-250 (2001).
  23. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. Journal of Structural Biology. 144 (1), 114-122 (2003).
  24. Van der Heide, P., Xu, X. P., Marsh, B. J., Hanein, D., Volkmann, N. Efficient automatic noise reduction of electron tomographic reconstructions based on iterative median filtering. Journal of structural biology. 158 (2), 196-204 (2007).
  25. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  26. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. MathWorks. MATLAB. , (2012).
  28. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. Systems, Man and Cybernetics, IEEE Transactions on. 9, 62-66 (1979).
  29. Vedaldi, A., Fulkerson, B. VLFeat: An Open and Portable Library of Computer Vision Algorithms. , (2008).
  30. Zhu, S. C., Guo, C., Wang, Y., Xu, Z. What are Textons? International Journal of Computer Vision. 62 (1-2), 121-143 (2005).
  31. Gagnon, L. H., Longo-Guess, C. M., et al. The chloride intracellular channel protein CLIC5 is expressed at high levels in hair cell stereocilia and is essential for normal inner ear function. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10188-10198 (2006).
  32. Briand, P., Petersen, O. W., Van Deurs, B. A new diploid nontumorigenic human breast epithelial cell line isolated and propagated in chemically defined medium. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 23 (3), 181-188 (1987).
  33. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  34. Shin, J. B., Krey, J. F., et al. Molecular architecture of the chick vestibular hair bundle. Nature neuroscience. 16 (3), 365-374 (2013).
  35. Yang, W., Zeng, Z., Max, N., Auer, M., Crivelli, S. Simplified Surface Models of Tubular Bacteria and Cytoskeleta. Journal of Information & Computational Science. 9 (6), 1589-1598 (2012).

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De Voxels ao Conhecimento: Um Guia Prático para a segmentação do Complexo Microscopia Eletrônica 3D-Data
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Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., … More

Tsai, W. T., Hassan, A., Sarkar, P., Correa, J., Metlagel, Z., Jorgens, D. M., Auer, M. From Voxels to Knowledge: A Practical Guide to the Segmentation of Complex Electron Microscopy 3D-Data. J. Vis. Exp. (90), e51673, doi:10.3791/51673 (2014).

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