Summary
De modo a compreender os mecanismos celulares e moleculares subjacentes neotissue formação e desenvolvimento de estenose em válvulas cardíacas de engenharia de tecidos, foi desenvolvido um modelo murino de transplante heterotópico de válvula cardíaca. A válvula cardíaca pulmonar foi transplantado para destinatário usando o coração técnica de transplante heterotópico.
Abstract
Engenharia de tecidos de válvulas cardíacas, válvulas especialmente descelularizados, estão começando a ganhar impulso no uso clínico de cirurgia reconstrutiva com resultados mistos. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose não são pesquisadas extensivamente. Para responder às perguntas acima, foi desenvolvido um modelo de transplante heterotópico murino coração válvula. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um camundongo doador válvula e transplantadas para um doador de rato coração. O coração com uma nova válvula foi transplantado heterotopicamente a um rato destinatário. O coração transplantado mostrou o seu próprio batimento cardíaco, independente de batimentos cardíacos do destinatário. O fluxo de sangue foi quantificado usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com Doppler pulsátil. O fluxo através da válvula pulmonar implantado mostrou a frente de fluxo com refluxo mínimo e pico de fluxo foi próximo a 100 mm / seg. Este modelo murino de transplante de válvula cardíaca é highly versátil, de modo que pode ser modificada e adaptada para fornecer diferentes ambientes hemodinâmicas e / ou pode ser usado com vários ratinhos transgénicos para estudar o desenvolvimento neotissue em uma válvula cardíaca de engenharia de tecidos.
Introduction
Defeitos cardiovasculares congênitos são uma das principais causas de mortalidade infantil no mundo 1,2 ocidental. Entre eles, a estenose da válvula pulmonar e os defeitos da válvula aórtica bicúspide são uma forma que ocorre com freqüência 3. Cirurgia de substituição da válvula cardíaca é uma escolha rotina de cirurgias reconstrutivas; no entanto, complicações, incluindo estenose e calcificação da válvula cardíaca, ea dependência ao longo da vida em anticoagulantes são uma fonte significativa de problemas de saúde crônica e morte 4-7. Além disso, a falta de potencial crescimento requer cirurgias de revisão, que aumenta ainda mais a mortalidade dos pacientes jovens 4,8,9.
Numa tentativa para desenvolver uma válvula cardíaca de substituição funcional com um potencial de crescimento, Shinoka et al. Células autólogas semeadas em uma válvula cardíaca sintética biodegradável 8. A válvula sintético transformado em uma válvula cardíaca nativa como a estrutura com potenciômetro crescimentoai. Preliminares grandes estudos com animais demonstraram a viabilidade da utilização desta metodologia para criar uma válvula cardíaca funcional 10. No entanto, estudos de implantação de longo prazo demonstraram pouca durabilidade devido ao espessamento progressivo da válvula neotissue resultando em estreitamento da válvula cardíaca. Trabalhe a partir de Sodian et al. Utilizada a metodologia Shinoka, mas finalmente substituiu a matriz PGA com um elastômero biodegradável, que deu as propriedades biomecânicas da válvula de engenharia de tecidos construir um perfil mais fisiológico 9,11,12. No estudo in vivo, apesar do sucesso da implantação, um revestimento de células endoteliais confluentes não foi formado, o que poderia limitar o sucesso a longo prazo deste andaime 12.
A fim de projetar racionalmente uma válvula cardíaca sintético de segunda geração melhorada, um modelo murino de transplante de válvula cardíaca foi criado para investigar os mecanismos celulares e moleculares underlyinformação g neotissue, espessamento da válvula, e o desenvolvimento de estenose. Modelos murinos oferecem uma vasta gama de reagentes moleculares, incluindo transgénicos, que não estão facilmente disponíveis em outras espécies 7. Neste modelo de transplante de coração válvula, um vivo substituição da válvula cardíaca pulmonar ex singênico foi realizada pela primeira vez; e, em seguida, o coração, com a válvula de coração implantado foi implantado heterotopicamente no hospedeiro singeneico usando uma técnica de microcirurgia. Este modelo permite a substituição da válvula do coração sem a necessidade de circulação extracorpórea.
Neste trabalho, uma explicação detalhada de uma colheita de válvula cardíaca, preparações de coração doador, o transplante de válvula cardíaca e transplante cardíaco heterotópico é descrito. Os resultados mostraram uma pulsação contínua a partir do coração do doador, que era independente do batimento cardíaco destinatário. O fluxo de sangue através da válvula pulmonar implantado foi medida usando um sistema de ultra-som de alta freqüência com uma onda pulsada Fazerppler.
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Protocol
Nota: Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional Hospital Animal Care e Use do Nationwide Children.
1. Pulmonar Válvula Cardíaca Colheita de um doador de válvula do coração mouse
- Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia: 1x tesoura fina, micro fórceps 3x, pinças vasculares micro 2x, braçadeira 1x fórceps de aplicação, suporte da agulha micro 1x, tesoura primavera 1x, 1x afastador.
- Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de válvula cardíaca pulmonar. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem.
- Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Expor o coração, fazer um pequeno corte no átrio direito, e aspergir o ventrículo esquerdo com gelo salina fria.
- Sem rodeios dissecção da artéria pulmonar (AP) a partir da ascensão de umorta. Cortar a válvula pulmonar (PV), juntamente com dois milímetros punho da artéria pulmonar. Elimine o resto do coração.
- Armazenar o PV em heparina frio e solução salina (100 unidades / ml). Nota: O PV pode ser mantido na solução durante duas horas antes do transplante para o coração de dador.
2. Preparação coração doador
- Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de rato é usado como um doador de coração. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, em seguida, a eutanásia com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 200 mg / kg e xilazina, 20 mg / kg, IP) sobredosagem. Este é um procedimento terminal.
- Clipe da área do peito e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Em seguida, fazer a toracotomia. Sem rodeios separar o coração, veia cava inferior (VCI), veia cava superior (VCS), aorta ascendente, PA, e veia pulmonar. Perfundir da VCI com gelo frio salina estéril.
- Ligadura da VCI, SVC, e veia pulmonar com seda 6-0 sutura em seguida, corte superior aoligaduras.
- Corte a aorta e PA com 2 milímetros punho.
- Recorte o PV e descartá-la.
3. Válvula de Transplante de Coração em um coração do doador
- Imediatamente após o passo 2.5, coloque a válvula cardíaca a partir do passo 1.5 para o coração do doador e orientar a válvula cardíaca.
- Fixe o PV com um ponto no lado direito da válvula usando 10-0 suturas monofilamento em agulhas cônicos e começar a sutura contínua com 5-6 stiches do outro lado do PV.
- Depois de terminar o lado da frente, girar o coração na horizontal e começa a suturar o lado de trás do PV para o coração de dador.
- Armazenar o coração em solução de heparina / solução salina estéril fria. Nota: O coração do dador podem ser mantidas na solução durante duas horas antes da implantação até o rato destinatário.
4. Heterotópico Transplante de Coração para um destinatário Rato
- Um 6-8 semanas de idade fêmea C57BL / 6 de ratinho foi utilizado como um recipient. Remover o rato da sua gaiola e pesá-lo, depois anestesiados com um cocktail de cetamina / xilazina (cetamina 100 mg / kg de xilazina e 10 mg / kg). O cetoprofeno (5 mg / kg) é utilizado como pré-anestésica analgésico.
- Depois de verificar o nível de sedação pela cauda beliscar, prenda o cabelo abdominal e torácica. Lubrifique os olhos com pomada oftálmica estéril, e coloque o mouse em uma posição de decúbito dorsal sobre uma almofada. Desinfetar o abdômen com Betadine e álcool pads. Em seguida, cubra o mouse com um campo estéril e expor apenas a área da incisão.
- Faça uma laparotomia mediana incisão abaixo do xifóide até a região suprapúbica, e inserir um afastador auto de retenção. Enrole os intestinos em salina umedecido gaze. Sem rodeios definir a aorta infra-renal e veia cava.
- Coloque duas suturas de seda 6-0 proximal e distal ao redor da aorta e veia cava inferior para conter a circulação sanguínea.
- Coloque o coração do doador, no lado direito da aorta abdominal e cobri-lo com gau estérilze. Hidrate-lo com soro fisiológico.
- Realizar uma Aortotomia na aorta abdominal com uma agulha G 30, e estender a abertura com uma tesoura para o tamanho da aorta do doador.
- Realizar um fim-de lado anastomose usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar a aorta do dador com um ponto na extremidade proximal da abertura na aorta abdominal e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
- Virar o coração para o lado esquerdo, cobri-lo com uma solução salina infundida gaze, e iniciar a sutura contínua com 4-5 stiches a partir da extremidade distal da aorta abdominal.
- Fazer uma venotomia na VCI usando uma agulha G 30 e estender a abertura para o tamanho da artéria pulmonar do dador.
- Realizar um fim a anastomose lado usando estéreis suturas 10-0 monofilamento as agulhas cônicos. Fixar o doador PA com um ponto na extremidade proximal da abertura na VCI e iniciar a sutura contínua com 4-5 de stichesa extremidade distal da veia cava inferior. Desta vez, por causa da aorta é na forma, certifique-se de sutura da parede esquerda da PA do dador está no interior da veia cava inferior.
- Lave o lúmen da VCI com heparina e solução salina (100 unidades / ml). Fechar a parede direita do doador e do receptor PA IVC suturando-os continuamente para a extremidade distal.
- Remover a ligadura distal e controlar a hemorragia através da aplicação de um agente hemostático estéril absorvível tópica. Quando a hemorragia parar completamente, retirar a sutura proximal e controlar a hemorragia da mesma maneira.
- Retorne os intestinos e fechar a musculatura abdominal e pele em duas camadas usando uma sutura de monofilamento 6-0 poliamida preto.
- Injetar 0,5 ml por via subcutânea de solução salina e coloque o rato em uma gaiola de recuperação em um bloco de aquecimento até que o mouse é totalmente móvel. Após a recuperação, o retorno do mouse para uma nova gaiola com roupa de cama de papel. Dar medicação para dor (Ibuprofeno, 30 mg / kg, a água potável) para 48 horas. Fazernão devolver um animal que passou por uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
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Representative Results
A figura 1 ilustra o esquema do modelo de transplante de válvula cardíaca utilizando transplante cardíaco heterotópico. A válvula cardíaca foi colhida a partir de um doador e implantado em um coração de um segundo rato doador. Em seguida, o coração com a nova válvula cardíaca foi implantado no abdómen de um rato receptor. Figura 2 mostra uma ilustração do coração implantado no espaço abdominal (A), logo após o transplante de coração (B), e 5 minutos após o transplante. Após a remoção de suturas em ambos os lados da aorta e veia cava inferior, o coração começa a bater 1-2 min mais tarde, e torna-se rosada com mais circulação sanguínea. Note-se que o átrio direito é mais dilatadas em (C) de (B). O coração bate progressivamente mais forte e é estável depois de 24 horas.
O fluxo de sangue através da válvula pulmonar implantado foi medida por via percutânea de 10 dias após a implantação usandoum sistema de ultra-som de alta frequência com o modo de Doppler pulsátil (Figura 3). Os locais da aorta, do ventrículo direito (RV), implantado válvula pulmonar (VP), e da artéria pulmonar (PA) no modo B foi mostrado na Figura 3 (A). O amarelo amostra de sobreposição de volume situa-se na PV implantado. Figura 3 (B) mostra um diagrama da anatomia e a localização da sobreposição do volume de amostra. Como mostrado na Figura 3 (C), a onda QRS coração dador foi detectado ritmicamente e independente da onda coração destinatário. A medida sistólica e diastólica volume de sangue no PV implantado combinava com a onda coração do doador. A velocidade de pico foi de cerca de 100 mm / seg.
Figura 1.60; esquemático de transplante de válvula cardíaca Uma válvula cardíaca pulmonar foi colhida a partir de um primeiro rato doador e implantado em um coração de um segundo rato doador.. Em seguida, o coração com a nova válvula foi implantada heterotopicamente em um rato destinatário.
Figura 2. Do coração transplantado. A) Um diagrama de um coração com uma nova válvula cardíaca implantado ao espaço abdominal (B), logo após a implantação, e (C), 5 minutos após o implante.
Medição de fluxo de sangue Figura 3. Na implanted válvula pulmonar. A) imagem de modo B, indicando os locais de aorta, ventrículo direito (VD), válvula pulmonar implantado (PV) e artéria pulmonar (AP). B) Um diagrama da anatomia e da localização da sobreposição de volume da amostra. C) a medição de velocidade no PV implantado com a onda de ECG.
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Discussion
A taxa de mortalidade do presente processo é de cerca de 20%, que foi principalmente causada por hemorragia no local da transplante de PV e anastomose sobre a aorta do doador para a aorta abdominal do destinatário. Na maioria dos casos, a taxa de mortalidade diminui significativamente 48 horas pós cirurgia. Os ratos de sobrevivência mostraram fortes batimentos cardíacos e do fluxo de sangue através do PV implantado. Todo o processo leva quatro horas para um cirurgião experiente micro. Levará cerca de 250 ratos para dominar a técnica. O transplante de coração heterotópico é relativamente simples, em comparação com o implante de PV para o coração de dador. Um dos passos mais importantes para um transplante bem sucedido é HV colheita da estrutura PV de um rato doador. A estrutura PV deve ser seccionado cerca de 1-2 mm abaixo da válvula. Se o tecido restante é muito curto, anastomose será um desafio. Se o tecido abaixo do PV é demasiado longo (isto é. PA será muito longo em comparação com a ascenderção aorta após a implantação), o PA implantado pode torcer ou torção. Outro passo fundamental é a anastomose entre a PA implantado e destinatário IVC. Desde o IVC é muito fino, ele é extremamente fácil de rasgar durante a sutura.
Neste modelo, o sangue da aorta vem através da aorta, flui através das artérias coronárias, em seguida, sai através da cavidade coronária com o RA doador. Assim, o volume de sangue a passar através do PV implantado é 5% do volume total de sangue de estimativa, que é a limitação mais significativa deste modelo para estudar TEHV. Para aumentar o fluxo de sangue que o PV, foram criados três modelos adicionais. Em primeiro lugar, um terceiro anastomose foi criado a partir da RV dador até ao receptor IVC. O terceiro anastomose pode aumentar o fluxo de sangue em 10% a 50% do volume total de sangue. Em segundo lugar, para aumentar ainda mais o fluxo de sangue, após a colocação da terceira anastomose, o IVC proximal foi ligado ao terceiro anastomose. Este método segurado 50% do fluxo sangüíneo através doPV implantado. Em terceiro lugar, a fim de aumentar o fluxo através da PV implantado e manter a circulação mais fisiológico, o coração foi transplantado com os pulmões. Este método pode aumentar o fluxo de até 50% do fluxo de sangue total e, mais importante, o ventrículo esquerdo e átrio esquerdo mantêm a sua circulação. Estes diferentes modelos de fluxo fisiológicos nos permitem estudar como a diferença de condições de fluxo fisiológicos afetam o desenvolvimento de neotissue e estenose em uma válvula do coração transplantado.
Recentemente, foi realizado um estudo piloto para transplante descelularizados HV sem semeadura de células usando a técnica descrita neste artigo. O PV implantado mostrou características de fluxo de sangue semelhantes como o controle, PV transplantado predecellularized. No futuro, diferentes tipos de células serão semeadas para estudar a formação e desenvolvimento neotissue estenose do HV transplantado. Além disso, usando camundongos transgênicos, como a proteína verde fluorescente (GFP) ratos ou um moumodelo se da doença HV, o processo de formação neotissue pode ser estudado mecanicamente através do estudo da fonte de células que povoam a válvula cardíaca descelulada ou doente usando imuno-histoquímica, que irá auxiliar no desenvolvimento de mais racionalmente concebidos, da engenharia de tecidos de válvulas cardíacas de segunda geração. A possibilidade de utilização de diferentes condições de fluxo fisiológico, os ratos transgénicos, implantes PV descelularizados, e possíveis combinações de todos os três mostram a versatilidade e utilidade potencialmente pré-clínico importante deste modelo de transplante de HV.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado, em parte, por uma concessão do NIH (RO1 HL098228) para CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
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