Summary
Al fine di comprendere i meccanismi cellulari e molecolari alla base neotissue formazione e lo sviluppo di stenosi in ingegneria tessutale valvole cardiache, è stato sviluppato un modello murino di trapianto di valvole cardiache eterotopico. Una valvola cardiaca polmonare è stato trapiantato al destinatario utilizzando la tecnica di trapianto di cuore eterotopico.
Abstract
Valvole cardiache di ingegneria tessutale, valvole soprattutto decellularized, stanno iniziando a guadagnare slancio in uso clinico di chirurgia ricostruttiva con risultati alterni. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari dello sviluppo neotissue, ispessimento della valvola, e lo sviluppo stenosi non sono studiati estesamente. Per rispondere a queste domande, abbiamo sviluppato una valvola cardiaca modello murino di trapianto eterotopico. Una valvola cardiaca è stato raccolto da un topo donatore valvola e trapiantato in un topo donatore di cuore. Il cuore con una nuova valvola è stato trapiantato heterotopically ad un mouse destinatario. Il cuore trapiantato ha mostrato il proprio battito cardiaco, indipendente battito cardiaco del destinatario. Il flusso di sangue è stato quantificato usando un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza con un Doppler pulsato. Il flusso attraverso la valvola polmonare impiantata mostrato flusso in avanti con rigurgito minimo e il picco di flusso era vicino a 100 mm / sec. Questo modello murino di trapianto di valvola cardiaca è highly versatile, in modo che possa essere modificato e adattato per fornire diversi ambienti emodinamici e / o può essere usato con vari topi transgenici per studiare lo sviluppo neotissue in una valvola cardiaca ingegneria tessutale.
Introduction
Difetti cardiovascolari congenite sono una delle principali cause di mortalità infantile del 1,2 mondo occidentale. Tra questi, la stenosi valvolare polmonare e premolari difetti valvolari aortici sono una forma che si verificano di frequente 3. Intervento di sostituzione della valvola cardiaca è una scelta di routine di chirurgia ricostruttiva; Tuttavia, le complicanze, tra cui la stenosi e calcificazione della valvola cardiaca, e la dipendenza per tutta la vita su anticoagulanti sono una fonte significativa di malattie croniche e morte 4-7. Inoltre, la mancanza di potenziale di crescita richiede interventi di revisione, che aumenta ulteriormente la mortalità di questi pazienti giovani 4,8,9.
Nel tentativo di sviluppare una valvola cardiaca sostituzione funzionale con potenziale di crescita, le cellule autologhe seminati Shinoka et al. Su una valvola cardiaca sintetico biodegradabile 8. La valvola sintetico trasformato in una valvola cardiaca nativa come la struttura con la crescita potenziometroal. Preliminari studi su animali di grandi dimensioni hanno dimostrato la possibilità di utilizzare questa metodologia per creare una valvola cardiaca funzionale 10. Tuttavia, gli studi di impianto lungo termine hanno dimostrato scarsa durata a causa del progressivo ispessimento della neotissue valvola con conseguente restringimento della valvola cardiaca. Lavorare da Sodian et al. Utilizzata la metodologia Shinoka, ma alla fine sostituito matrice PGA con un elastomero biodegradabile, che ha le proprietà biomeccaniche della valvola di ingegneria tessutale costruire un profilo più fisiologico 9,11,12. Nello studio in vivo, nonostante il successo del l'impianto, un rivestimento delle cellule endoteliali confluenti non era formata che potrebbe limitare il successo a lungo termine di questo ponteggio 12.
Al fine di progettare razionalmente una migliore valvola cardiaca sintetico di seconda generazione, un modello murino di trapianto di valvole cardiache è stato creato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari underlyinformazione g neotissue, ispessimento della valvola, e lo sviluppo di stenosi. Modelli murini offrono una vasta gamma di reagenti molecolari, tra cui transgenici, che non sono facilmente disponibili in altre specie 7. In questo cuore modello di trapianto di valvole, un ex vivo singenico sostituzione della valvola cardiaca polmonare è stata eseguita prima; e poi il cuore con la valvola cardiaca impiantato è stato impiantato heterotopically in un ospite singenici utilizzando una tecnica microchirurgica. Questo modello permette la sostituzione della valvola cardiaca senza la necessità di bypass cardiopolmonare.
In questo lavoro, una spiegazione dettagliata di un raccolto valvola cardiaca, preparazioni cuore del donatore, il trapianto di valvole cardiache, e il trapianto di cuore eterotopico è descritto. I risultati hanno mostrato un battito cardiaco continuo dal cuore del donatore, che era indipendente dal battito cardiaco destinatario. Il flusso sanguigno attraverso la valvola polmonare impiantato è stata misurata usando un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza con onda pulsata Fareppler.
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Protocol
Nota: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla Hospital Institutional Animal Care ed uso Comitato dei Bambini di Nationwide.
1. Polmonare valvola cardiaca raccolta da un donatore Valvola cardiaca mouse
- Sterilizzare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici prima della chirurgia: 1x forbici sottili, 3x micro pinze, pinze vascolari micro 2x, 1x morsetto pinze applicano, porta-aghi micro 1x, forbici primavera 1x, 1x divaricatore.
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 mouse viene utilizzato come donatore valvola cardiaca polmonare. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi eutanasia con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg, IP) overdose.
- Agganciare la zona del torace e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Poi fare la toracotomia. Esporre il cuore, fare un piccolo taglio sul atrio destro e profumato il ventricolo sinistro con ghiaccio soluzione fisiologica fredda.
- Senza mezzi termini sezionare l'arteria polmonare (PA) dal crescente unorta. Tagliare la valvola polmonare (PV) insieme a due millimetri bracciale dell'arteria polmonare. Smaltire il resto del cuore.
- Conservare il fotovoltaico in soluzione salina (100 unità / ml) di eparina freddo e. Nota: Il PV può essere mantenuto in soluzione per due ore prima del trapianto verso il cuore del donatore.
2. Preparazione donatore di cuore
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 mouse viene utilizzato come un donatore di cuore. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi eutanasia con un cocktail di ketamina / xylazina (ketamina, 200 mg / kg e xylazina, 20 mg / kg, IP) overdose. Questa è una procedura terminale.
- Agganciare la zona del torace e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Poi fare la toracotomia. Senza mezzi termini separare il cuore, vena cava inferiore (IVC), vena cava superiore (SVC), dell'aorta ascendente, PA, e la vena polmonare. Profumato l'IVC con il freddo ghiaccio soluzione salina sterile.
- Legare l'IVC, SVC, e vena polmonare con 6-0 sutura di seta poi tagliare superiore allegature.
- Tagliare l'aorta e PA 2 mm bracciale.
- Tagliare il PV e smaltirlo.
3. Valvola cardiaca trapianto su un donatore di cuore
- Subito dopo la fase 2.5, posizionare la valvola cardiaca dal punto 1.5 nel cuore del donatore e orientare la valvola cardiaca.
- Fissare la PV con un punto sul lato destro della valvola attraverso 10-0 monofilamento sugli aghi conici e inizia a suturare continuamente con 5-6 stiches dall'altro lato del PV.
- Dopo aver terminato il lato anteriore, ruotare cuore orizzontalmente e iniziare a suturare il lato posteriore del PV sul cuore del donatore.
- Conservare il cuore in una soluzione fredda di eparina / soluzione salina sterile. Nota: Il cuore del donatore può essere mantenuto in soluzione per due ore prima dell'impianto per il mouse destinatario.
4. Eterotopico trapianto cardiaco a un destinatario mouse
- A 6-8 settimane di età femmina C57BL / 6 topo è stato usato come un recipient. Rimuovere il mouse dalla gabbia e si pesa, poi anestetizzati con cocktail di ketamina / xilazina (ketamina, 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg). Ketoprofene (5 mg / kg) è usato come preanesthesia analgesico.
- Dopo aver verificato il livello di sedazione per coda pizzicare, tagliare il addominale e peli del torace. Lubrificare gli occhi con pomata oftalmica sterile, e posizionare il mouse in una posizione prona dorsale su un taccuino. Disinfettare l'addome con Betadine e alcool pastiglie. Poi coprire il mouse con un telino sterile ed esporre solo la zona di incisione.
- Effettuare una laparotomia mediana incisione da sotto la xifoidea alla regione sovrapubica, e inserire un divaricatore auto ritegno. Avvolgere l'intestino in soluzione salina inumidito garza. Senza mezzi termini definire l'aorta sottorenale e la vena cava.
- Inserire due 6-0 punti di sutura in seta prossimale e distale attorno alla aorta e IVC per limitare la circolazione del sangue.
- Posizionare il cuore del donatore sul lato destro dell'aorta addominale e coprire con gau sterileze. Idratare con soluzione fisiologica.
- Effettuare una aortotomy nell'aorta addominale utilizzando un ago G 30 ed estendere l'apertura con le forbici alle dimensioni dell'aorta donatore.
- Eseguire un end-to side anastomosi con sterili suture monofilamento 10-0 sugli aghi conici. Fissare l'aorta donatore con un punto sull'estremità prossimale dell'apertura nell'aorta addominale e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'estremità distale dell'aorta addominale.
- Capovolgere il cuore a sinistra, coprire con garza salina infusa e iniziare a suturare continuamente con 4-5 stiches dall'estremità distale dell'aorta addominale.
- Effettuare una venotomia nella IVC usando un ago G 30 ed estendere l'apertura alla dimensione dell'arteria polmonare donatore.
- Eseguire la fine anastomosi lato utilizzando sterili suture monofilamento 10-0 sugli aghi conici. Fissare il donatore PA con un punto sull'estremità prossimale dell'apertura nella IVC e inizia a suturare continuamente con 4-5 stiches dal'estremità distale della vena cava inferiore. Questa volta, perché l'aorta è nel senso, si assicura la sutura della parete sinistra della PA del donatore è all'interno della IVC.
- Lavare lume IVC con eparina e soluzione salina (100 unità / ml). Chiudere la parete destra del donatore e del ricevente PA IVC suturando loro continuamente all'estremità distale.
- Togliere la legatura distale e controllare l'emorragia applicando una topica agente emostatico sterile riassorbibile. Quando l'emorragia si arresta completamente, rimuovere la sutura prossimale e controllare l'emorragia allo stesso modo.
- Ritorno intestini e chiudere la muscolatura addominale e la pelle in due strati con un 6-0 nero poliammide monofilamento di sutura.
- Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea e posizionare il mouse in una gabbia di recupero su un rilievo di riscaldamento fino a quando il mouse è completamente mobile. Al momento del recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia con biancheria da letto di carta. Dare farmaci antidolorifici (ibuprofene, 30 mg / kg, acqua potabile) per 48 ore. FareNon restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
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Representative Results
La Figura 1 illustra gli schemi della valvola modello di trapianto di cuore con trapianto di cuore eterotopico. La valvola cardiaca è stato raccolto da un donatore e impiantato su un cuore da un secondo mouse donatore. Poi il cuore con la nuova valvola cardiaca è stato impiantato all'addome di un mouse destinatario. Figura 2 mostra una illustrazione del cuore impiantato nello spazio addominale (A), subito dopo trapianto cardiaco (B), e 5 minuti dopo il trapianto. Per la rimozione suture su entrambi i lati della aorta e IVC, il cuore inizia a battere 1-2 min più tardi e diventa pinker con più circolazione sanguigna. Si noti che l'atrio destro è più dilatato in (C) di (B). Il cuore batte gradualmente più forte ed è stabile dopo 24 ore.
Il flusso sanguigno attraverso la valvola polmonare impiantata è stata misurata per via percutanea 10 giorni dopo l'impianto utilizzandoun sistema di ultrasuoni ad alta frequenza con la modalità Doppler pulsato (Figura 3). Le posizioni dell'aorta, ventricolo destro (RV), impiantati valvola polmonare (PV), e l'arteria polmonare (PA) in modalità B è stato mostrato in Figura 3 (A). Il volume di campione giallo overlay si trova sulla PV impiantato. Figura 3 (B) mostra un diagramma di anatomia e la posizione della sovrapposizione volume del campione. Come mostrato in figura 3 (C), l'onda QRS cuore del donatore è stato rilevato ritmicamente e indipendente dell'onda cardiaca destinatario. La pressione sistolica misurata e il volume diastolica al fotovoltaico impiantato corrispondere l'onda cuore del donatore. La velocità di picco era di circa 100 mm / sec.
Figura 1.60; Schema di trapianto di valvole cardiache Una valvola cardiaca polmonare è stato raccolto da un primo topo donatore e impiantato in un cuore da un secondo topo donatore.. Poi il cuore con la nuova valvola è stato impiantato heterotopically in un topo ricevente.
Figura 2. Il cuore trapiantato. A) Un diagramma di un cuore con nuova valvola cardiaca impiantato nello spazio addominale (B) subito dopo l'impianto, e (C) 5 min dopo l'impianto.
Misurazione Figura 3. Flusso sanguigno in implanted valvola polmonare. A) immagine B-mode che indica le posizioni dei aorta, ventricolo destro (RV), valvola polmonare impiantata (PV) e arteria polmonare (PA). B) Un diagramma di anatomia e la posizione della sovrapposizione volume del campione. C) la misura della velocità al fotovoltaico impiantato con ECG onda.
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Discussion
Il tasso di mortalità di questa procedura è vicino al 20%, che è stato causato principalmente da emorragia nel sito di trapianto PV e anastomosi sull'aorta donatore all'aorta addominale destinatario. Nella maggior parte dei casi, il tasso di mortalità diminuisce significativamente chirurgia 48 hr postale. I topi hanno mostrato di sopravvivenza cuore batte forte e il flusso di sangue attraverso il fotovoltaico impiantato. L'intero processo dura quattro ore per una micro chirurgo esperto. Ci vorranno circa 250 topi per padroneggiare la tecnica. Il trapianto cardiaco eterotopico è relativamente semplice rispetto alla impianto fotovoltaico al cuore del donatore. Uno dei passaggi più critici per un trapianto HV successo è raccolto della struttura FV da un topo donatore. La struttura PV deve essere sezionato circa 1-2 mm al di sotto della valvola. Se il tessuto rimanente è troppo breve, anastomosi sarà impegnativo. Se il tessuto al di sotto del PV è troppo lungo (cioè. PA sarà troppo lungo rispetto al salireing aorta dopo l'impianto), la PA impiantato può torcere o piegare. Un altro passo fondamentale è l'anastomosi tra la PA impiantato e il destinatario IVC. Poiché l'IVC è molto sottile, è estremamente facile da strappare durante sutura.
In questo modello, il sangue aortico entra attraverso l'aorta, scorre attraverso le arterie coronarie, poi esce attraverso seno coronarico per il RA donatore. Quindi il volume di sangue di passare attraverso il PV è impiantato 5% del volume totale del sangue nella stima, che è la più significativa limitazione di questo modello nello studio TEHV. Per aumentare il flusso di sangue anche se il fotovoltaico, sono stati creati tre modelli aggiuntivi. In primo luogo, un terzo anastomosi è stata creata dal RV donatore al ricevente IVC. Il terzo anastomosi può aumentare il flusso di sangue da 10% al 50% del volume totale del sangue. In secondo luogo, per aumentare ulteriormente il flusso di sangue, dopo aver posizionato il terzo anastomosi, l'IVC è stato ligato prossimale al terzo anastomosi. Questo metodo assicurato il 50% del flusso di sangue attraverso l'PV impiantato. In terzo luogo, al fine di aumentare il flusso attraverso il PV impiantato e di mantenere più fisiologica circolazione, il cuore è stato trapiantato con i polmoni. Questo metodo potrebbe aumentare il flusso fino al 50% del flusso totale del sangue e, soprattutto, il ventricolo sinistro e atrio sinistro mantenere la loro circolazione. Questi diversi modelli di flusso fisiologici ci permettono di studiare come la differenza in condizioni di flusso fisiologiche influenzano lo sviluppo di neotissue e stenosi in una valvola cardiaca trapiantato.
Di recente, abbiamo condotto uno studio pilota per il trapianto decellularized HV senza semina delle cellule usando la tecnica descritta in questo documento. Il fotovoltaico impiantato mostrato simili caratteristiche del flusso sanguigno come controllo, predecellularized PV trapiantato. In futuro, diversi tipi di cellule saranno seminate per studiare la formazione e lo sviluppo neotissue stenosi HV trapiantato. Inoltre, utilizzando topi transgenici, come proteina fluorescente verde (GFP) topi o un mouSE modello di malattia HV, il processo di formazione neotissue può essere studiato meccanicamente studiando la fonte di cellule che popolano valvola cardiaca decellularized o malato utilizzando l'immunoistochimica, che aiuterà lo sviluppo di più razionalmente progettati, ingegneria tessutale valvole cardiache seconda generazione. La possibilità di utilizzare diverse condizioni di flusso fisiologico, topi transgenici, di impianti fotovoltaici decellularized, e le possibili combinazioni di tutti e tre mostrano la versatilità e potenzialmente importante utilità di questo modello preclinico trapianto HV.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto, in parte, da una sovvenzione del NIH (RO1 HL098228) per CKB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
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