Summary
Для того чтобы понять клеточные и молекулярные механизмы, лежащие neotissue формирование и развитие стеноза в ткани инженерии клапанов сердца, была разработана мышиной модели гетеротопической трансплантации сердца клапана. Легочное сердце клапан был пересажен получателю с помощью гетеротопической технику трансплантации сердца.
Abstract
Тканевые инженерии клапанов сердца, особенно decellularized клапаны, начинают набирать обороты в клинического использования реконструктивной хирургии со смешанными результатами. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы развития neotissue, клапана утолщения и развития стеноза не исследовал экстенсивно. Чтобы ответить на эти вопросы, мы разработали мышиный гетеротопической клапана сердца модель трансплантации. Клапана сердца собирали из клапана мыши-донора и пересадить к сердечному мыши-донора. Сердце с новым клапаном был пересажен гетеротопически к мыши-реципиента. Пересаженного сердца показали свой сердцебиение, независимо от сердцебиения получателя. Кровоток измеряют, используя высокую ультразвуковую систему частоты с помощью импульсного волнового Доплера. Поток через имплантированного клапана легочной артерии показал вперед поток с минимальным срыгивания и пиковый поток был близок к 100 мм / сек. Это мышиной модели трансплантации сердечного клапана является Highlу универсальным, так что он может быть модифицированы и адаптированы, чтобы обеспечить различные гемодинамические сред и / или могут быть использованы с различными трансгенных мышей для изучения neotissue развитие в ткани инженерии клапанов сердца.
Introduction
Врожденные сосудистые дефекты являются одним из ведущих причин детской смертности в западном мире 1,2. Среди них, стеноз легочной артерии клапана и двустворчатый аортальный дефекты клапанов часто встречающиеся формы 3. Замена клапанов сердца хирургия является рутинной выбор реконструктивных операций; Однако осложнения, включая стеноз и кальцификации клапана сердца, и на протяжении всей жизни зависимость от антикоагулянтов являются существенным источником хронического нездоровья и смерти 4-7. Кроме того, отсутствие потенциала роста требуется операции редактирования, который еще больше увеличивает смертность этих молодых пациентов 4,8,9.
В попытке разработать функциональную замену сердечного клапана с потенциалом роста, Shinoka др.. Сеяных аутологичных клеток на биоразлагаемых синтетических сердечного клапана 8. Синтетический клапан трансформируется в родном сердечного клапана, как структура с Potenti ростадр.. Предварительные крупные исследования на животных показали возможность использования этой методологии для создания функциональной сердечный клапан 10. Однако долговременные имплантации исследования показали плохую прочность из-за прогрессирующего утолщения neotissue клапана в результате сужения клапана сердца. Работа с Sodian соавт. Использовали методологию Shinoka, но в конечном счете заменить матрицу PGA с биоразлагаемым эластомера, который дал биомеханические свойства ткани инженерных клапана построить более физиологический профиль 9,11,12. В исследовании в естественных условиях, несмотря на успех имплантации, сливающийся эндотелиальных клеток подкладка была не сформирована, которые могли бы ограничить долгосрочный успех этого эшафот 12.
Для того, чтобы рационально проектировать улучшенное второе поколение синтетического сердечный клапан, на мышиной модели трансплантации клапана сердца была создана для расследования клеточные и молекулярные механизмы underlyinформирование г neotissue, клапан утолщение, и развитие стеноза. Мышиные модели предлагают широкий спектр молекулярных реагентов, в том числе трансгенных, которые не являются легкодоступными для других видов 7. В этом сердечной трансплантации клапана модели, экс естественных сингенными замена легочное сердце клапана была выполнена первая; и тогда сердце с имплантированным сердечным клапаном был имплантирован гетеротопически в сингенной хозяина с помощью микрохирургической техники. Эта модель позволяет замену клапана сердца без необходимости искусственного кровообращения.
В данной работе, подробное объяснение урожай клапана сердца, препараты донорской сердце, трансплантация сердца клапан, и гетеротопическая трансплантация сердца описывается. Результаты показали непрерывный сердцебиение от донорского сердца, которая была независимой от сердцебиения получателя. Кровоток через имплантированного клапана легочной артерии измеряли с помощью высокой ультразвуковую систему частот с импульсно-волновом лиppler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все животные процедуры были одобрены комитетом больницы Уходу за животными и использовать Национальная детская мимо.
1. Легочная клапана сердца Добывается из донорского сердца Valve Mouse
- Автоклав все хирургические инструменты перед операцией: 1x тонких ножниц, 3x микро щипцы, 2x микро сосудистые зажимы, 1x зажим, применяющие щипцы, 1x микро держатель иглы, 1x весенние ножницы, 1x втягивающим.
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров легких сердечного клапана. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (Кетамин, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировка.
- Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Expose сердце, сделать небольшой разрез на правом предсердии, и заливать левого желудочка с ледяной физиологический раствор.
- Грубо рассекают легочной артерии (ПА) из восходящего аОрта. Вырежьте легочного клапана (PV) наряду с 2 мм манжеты легочной артерии. Утилизировать оставшейся части сердца.
- Хранить PV в холодной гепарина и солевым раствором (100 единиц / мл). Примечание: PV может храниться в растворе в течение двух часов перед трансплантацией в донорского сердца.
2. Донорское сердце Подготовка
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей используют в качестве доноров сердца. Отключив мышь из клетки и взвесить его, то эвтаназии с кетамин / ксилазина коктейля (кетамина, 200 мг / кг и ксилазина, 20 мг / кг, IP) передозировки. Это процедура терминал.
- Клип грудь и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Затем сделайте торакотомию. Грубо отделить сердце, нижнюю полую вену (IVC), верхней полой вены (SVC), восходящей аорты, PA, и легочную вену. Заливать IVC ледяной стерильного физиологического раствора.
- Лигируют IVC, SVC, и легочную вену с 6-0 шелковой нити затем разрезают превосходитлигатуры.
- Разрежьте аорты и ПА с 2 мм манжеты.
- Вырежьте PV и распоряжаться им.
3. Клапана сердца Трансплантация на донорское сердце
- Сразу после шага 2.5, поместите клапан сердца, начиная с шага 1.5 в донорского сердца и ориентировать сердечный клапан.
- Закрепите PV с стежка на правой стороне клапана, используя 10-0 мононити швов на конических игл и начать сшивать непрерывно с 5-6 Stiches от другой стороны PV.
- После окончания переднюю сторону, повернуть сердце горизонтально и начать сшивать заднюю сторону ФВ на донорского сердца.
- Хранить сердце в холодном стерильного раствора гепарин / физиологического раствора. Примечание: донорское сердце может храниться в растворе в течение двух часов перед имплантацией к мыши-реципиента.
4. Гетеротопическая Трансплантация сердца на Получателю Mouse
- 6-8 недельных самок C57BL / 6 мышей использовали в качестве RECIpient. Удалить мыши из клетки и взвешивают его, а затем анестезировали кетамином / ксилазина коктейль (кетамин, 100 мг / кг и ксилазина 10 мг / кг). Кетопрофен (5 мг / кг) используют в качестве предварительных мероприятий по наркозу анальгетик.
- После проверки уровня седации хвостом щипать, обрезать брюшного пресса и волосы на груди. Смажьте глаза стерильной глазной мази, и поместите курсор в спинной позиции отдохновение на площадку. Лечить живот бетадином и алкогольной колодки. Затем накрыть мышь с стерильной драпировки и разоблачить область разреза только.
- Сделайте срединный лапаротомии разрез от ниже xyphoid к надлобковой области, и вставить самостоятельно стопорное втягивающим. Оберните кишечник в солевом смоченной марлей. Грубо определить инфраренальной аорту и полую вену.
- Поместите два 6-0 шелковые швы проксимально и дистально вокруг аорты и нижней полой вены сдерживать кровообращение.
- Поместите донорского сердца на правой стороне брюшной аорты и покрыть ее стерильной Гауге. Увлажнение его физиологическим раствором.
- Сделать aortotomy в брюшной аорты с использованием 30 г иглы и расширить отверстие с помощью ножниц до размера доноров аорты.
- Выполните конца в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасность донорской аорты с одним швом на проксимальном конце отверстие в брюшной аорты и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
- Флип сердце с левой стороны, покрыть ее солевым придают марли, и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches от дистального конца брюшной аорты.
- Сделайте венотомия в НПВ, используя 30 г иглы и расширить отверстие до размеров доноров легочной артерии.
- Выполните конец в сторону анастомоза с использованием стерильных 10-0 мононити швов на конических игл. Безопасный донор ПА с одним швом на проксимальном конце отверстие в нижней полой вены и начинают шов непрерывно с 4-5 Stiches издистальный конец нижней полой вены. На этот раз, потому что аорта находится в пути, убедитесь, ушивание левой стене ПА донора находится на внутренней нижней полой вены.
- Флеш просвет IVC с гепарином и солевым раствором (100 единиц / мл). Закройте правую стену доноров ПА и получателя IVC сшиванием их постоянно к дальнему концу.
- Удалить дистального лигатуры и контролировать кровотечение, применяя актуальные рассасывающиеся стерильную кровоостанавливающего средства. Когда кровотечение останавливается полностью, удалить проксимального шва и контролировать кровотечение так же.
- Вернуться кишечник и закрыть брюшную мускулатуру и кожу в два слоя с использованием 6-0 черный полиамид мононити шов.
- Введите 0,5 мл физиологического раствора подкожно и поместите курсор в восстановление клетке на потепление площадку, пока мышь не является полностью мобильным. После восстановления, возвращения мышь на новую клетку с бумажной постельные принадлежности. Дайте обезболивающее (ибупрофен, 30 мг / кг, питьевой воды) в течение 48 часов. Делатьне возвращать животное, которое претерпела операцию по компании других животных, пока полностью не выздоровел.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показаны схемы клапана трансплантации модели сердца с помощью гетеротопической трансплантации сердца. Клапана сердца собирали из донорского сердца и имплантируют в сердце из второго мыши-донора. Затем сердце с новым сердечного клапана имплантировали в брюшную полость мыши-реципиента. Рисунок 2 показывает иллюстрацию имплантированного сердца на брюшной полости (А), сразу после трансплантации сердца (B), и через 5 мин после трансплантации. По удалении швов с обеих сторон аорты и нижней полой вены, сердце начинает биться 1-2 мин позже и становится Пинкер с более кровообращения. Следует отметить, что правое предсердие более расширенные в (С), чем (В). Сердце постепенно бьет сильнее и стабилен после 24 часов.
Кровоток через имплантированного клапана легочной артерии измеряли подкожно через 10 дней после имплантации с использованиемвысокая частота ультразвуковая система с режимом доплеровского импульсно-волновой (рис. 3). Места расположения аорты, правый желудочек (RV), имплантировали легочной клапан (PV) и в легочной артерии (ПА) в режиме B было показано на фиг.3 (А). Желтый образец объем наложение расположен на имплантированного PV. Фиг.3 (B) показана схема анатомии и расположения объема образца наложения. Как показано на фиг.3 (С), волна QRS сердца донора был обнаружен ритмично и не зависит от сердечной получатель волны. Измеренная систолическое и диастолическое объем крови в имплантированного PV соответствовала донором сердца волну. Пик скорость была около 100 мм / сек.
Рисунок 1.60; Схема трансплантации сердца клапана легочной клапан сердца собирали из первой мыши-донора и имплантировали в сердце от второго мыши-донора.. Тогда сердце с нового клапана имплантировали гетеротопически в мышь-реципиента.
Рисунок 2. Пересаженного сердца.)-Схема сердца с новым сердечного клапана имплантировали в брюшной полости (В) сразу же после имплантации, и (С) 5 мин после имплантации.
Измерение Кровоток Рисунок 3. В Implanted клапана легочной артерии.) в В-режиме изображение с указанием местоположения аорты, правого желудочка (RV), имплантированный легочного клапана (PV) и легочной артерии (ПА). B) схема анатомии и расположения объема выборки наложения. С) измерения скорости на имплантированного PV с ЭКГ волны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Смертность этой процедуры близка к 20%, что в основном вызванной кровотечением в месте трансплантации PV и анастомоза на донорской аорты получателю брюшной аорты. В большинстве случаев, смертность значительно снижает 48 ч после операции. Мыши выживания показал сильные удары сердца и кровоток через имплантированный PV. Весь процесс занимает четыре часа для опытного микро хирурга. Это займет примерно 250 мышей освоить технику. Гетеротопическая трансплантация сердца является относительно прямой по сравнению с PV имплантации в донорского сердца. Одним из наиболее важных шагов для успешного HV трансплантации урожай структуре PV от мыши-донора. Структура PV должны быть перерезаны вокруг 1-2 мм ниже клапана. Если оставшиеся ткани слишком коротка, анастомоз будет сложной задачей. Если ткань ниже PV слишком длинное (т.е.. ПА будет слишком долго по сравнению с восхожденияING аорты после имплантации), имплантировали ПА может крутить или излом. Другим важным шагом является анастомоз между имплантированного ПА и получателя IVC. Поскольку IVC очень тонкая, это очень легко оторвать во время наложения швов.
В этой модели аорты кровь поступает через аорту, протекает через коронарные артерии, затем выходит через коронарный синус донору РА. Таким образом, объем крови проходить через имплантированный PV 5% от общего объема крови в оценке, что является наиболее существенным ограничением этой модели при изучении TEHV. Чтобы увеличить приток крови хотя ФВ, были созданы три дополнительные модели. Во-первых, третий анастомоз был создан из донорской RV получателю IVC. Третий анастомоз может увеличить приток крови на 10% до 50% от общего объема крови. Во-вторых, дальнейшее увеличение кровотока, после размещения третьего анастомоза, IVC лигировали проксимально по отношению к третьему анастомоза. Этот метод застрахованы 50% кровотока черезимплантированы П.В.. В-третьих, с целью повышения потока через имплантированный PV и поддерживать более физиологический кровообращение, сердце было трансплантировали легких. Этот метод может увеличить поток до 50% от общего кровотока и что более важно, левый желудочек и левое предсердие поддерживать их распространить. Эти различные модели физиологические потока позволит нам изучить, как разница в физиологических условиях потока влияют на развитие neotissue и стеноз в пересаженным сердечного клапана.
В последнее время мы провели экспериментальное исследование на трансплантации decellularized HV без посева клеток с помощью описанной методики в данной работе. Имплантированы П.В. показал сходные характеристики кровотока в качестве контроля, predecellularized пересаженных PV. В дальнейшем различные типы клеток будут посеяны изучить neotissue формирование и развитие стеноза пересаженной HV. Кроме того, с использованием трансгенных мышей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) мышей или мусебе модель болезни HV, процесс neotissue образования могут быть изучены механистически, изучая источник клеток, населяющих decellularized или больной клапан сердца с помощью иммуногистохимии, который будет способствовать развитию более рационально разработанных, ткани инженерии клапанов сердца второго поколения. Возможность использования различных условий физиологического течения, трансгенных мышей, decellularized PV имплантации и возможные комбинации всех трех показать универсальность и потенциально важную доклинические полезность этого HV трансплантации модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана, в частности, за счет гранта от НИЗ (РВЫХ1 HL098228) в ЦКБ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), Female | Jackson Laboratories | 664 | 8-12 weeks |
| Ketamine Hydrochloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| Xylazine Sterile Solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| Ibuprofen | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin Sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% Sodium chloride Injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| Petrolatum Ophthalmic Ointment | Dechra Veterinary Products | NDC 17033-211-38 | |
| Iodine Prep Pads | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| Alcohol Prep Pads | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| Cotton tipped applicators | Fisher Sientific | 23-400-118 | |
| Fine Scissor | FST | 14028-10 | |
| Micro-Adson Forcep | FST | 11018-12 | |
| Clamp Applying Forcep | FST | 00072-14 | |
| S&T Vascular Clamp | FST | 00396-01 | |
| Spring Scissors | FST | 15008-08 | |
| Colibri Retractors | FST | 17000-04 | |
| Dumont #5 Forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | FST | 11274-20 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | 11251-35 | |
| Tish Needle Holder/Forceps | Micrins | MI1540 | |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | For sutureing the graft |
| Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | For musculature and skin closure |
| Non Woven Sponges | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| 1 ml Syringe | BD | 309659 | |
| 3 ml Syringe | BD | 309657 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 | |
| 18 G 1 1/2 in, Needle | BD | 305190 | |
| 25 G 1 in., Needle | BD | 305125 | |
| 30 G 1 in., Needle | BD | 305106 | |
| Warm Water Recircultor | Gaymar | TP-700 | |
| Warming Pad | Gaymar | TP-22G | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| VEVO2100 High Frequency Ultrasound | VisualSonics | http://www.visualsonics.com/vevo2100 | The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives. |
| Ultrasound transmission gel | Parker Laboratories, INC. |
01-02 | |
| Table Top Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip, INC. | 901806 | |
| Isoflurane | Baxter | 1001936060 |
References
- Polito, A., et al. Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease. Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).
- Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations. Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).
- Vacanti, J. P. Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture. Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).
- Tudorache, I., et al. Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts. Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).
- van Geldorp, M. W., et al. Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).
- El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. Choice of prosthetic heart valve in today's practice. Circulation. 117, 253-256 (2008).
- Quinn, R. W. Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs. Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model. The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).
- Sodian, R., et al. Tissue engineering of heart valves in vitro experiences. The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).
- Shinoka, T., et al. Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation. 94, II164-II168 (1996).
- Sodian, R., et al. Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves. ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).
- Sodian, R., et al. Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves). Circulation. 102, III22-III29 (2000).
