Transplantation af pulmonale ventilen med en musemodel af Heterotop Heart Transplantation

Summary

For at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger neotissue dannelse og stenose udvikling manipuleret væv hjerteklapper, blev en murin model af heterotop hjerteklap transplantation udvikles. En pulmonal hjerteklap blev transplanteret til modtageren vha. heterotopisk hjerte transplantation teknik.

Abstract

Manipuleret væv hjerteklapper, især decellulariserede ventiler, er begyndt at tage fart i klinisk brug af rekonstruktionskirurgi med blandede resultater. Imidlertid er de cellulære og molekylære mekanismer i neotissue udvikling, ventil fortykkelse, og stenose udvikling ikke undersøgt grundigt. For at besvare ovenstående spørgsmål, udviklede vi en murin heterotopisk hjerteklap transplantation model. Hjerteklap blev høstet fra en ventil donormus og transplanteres til et hjerte donormus. Hjertet med en ny ventil transplanteret heterotopisk til en modtager mus. Det transplanterede hjerte viste sin egen puls, uafhængigt af modtagerens hjerteslag. Blodstrømmen blev kvantificeret under anvendelse af en højfrekvent ultralyd-system med en pulseret bølge Doppler. Strømmen gennem den implanterede pulmonal ventil viste fremløb med minimal opstød og peak flow var tæt på 100 mm / sek. Denne musemodel af hjerteklap transplantation er highly alsidig, så det kan ændres og tilpasses til at levere forskellige hæmodynamiske miljøer og / eller kan bruges med forskellige transgene mus for at studere neotissue udvikling i et manipuleret væv hjerteklap.

Introduction

Medfødte kardiovaskulære defekter er en af de førende årsager til børnedødelighed i den vestlige verden ^1,2. Blandt dem, pulmonic ventil stenose og bicuspid aortaklappen defekter er en hyppigt forekommende form ^3. Hjerteklap udskiftning kirurgi er en rutinemæssig valg af rekonstruktiv kirurgi; dog komplikationer, herunder stenose og forkalkning af hjerteklappen, og livslang afhængighed af antikoagulanter er en væsentlig kilde til kronisk dårligt helbred og død ^4-7. Desuden manglende vækstpotentiale kræver revisionskirurgier, hvilket yderligere øger dødeligheden af disse unge patienter ^4,8,9.

I et forsøg på at udvikle en funktionel erstatning hjerteklap med vækstpotentiale Shinoka et al. Udsåede autologe celler på en bionedbrydelig syntetisk hjerteklap ^8. Den syntetiske ventil transformeret til en indfødt hjerteklap lignende struktur med vækst potential. Foreløbige store dyrestudier viste mulighederne for at anvende denne metode til at skabe en funktionel hjerteklap ^10. Men langsigtede implantationsforsøg viste en ringe holdbarhed på grund af progressiv fortykkelse af ventilen neotissue resulterer i indsnævring af hjerteklap. Arbejde fra Sodian et al. Brugte Shinoka metoden, men i sidste ende erstattet PGA matrix med en biologisk nedbrydelig elastomer, som gav biomekaniske egenskaber af manipuleret væv ventil konstruere en mere fysiologiske profil ^9,11,12. I in vivo-undersøgelse, på trods af den succes implantation, en sammenflydende endothelcelle foring ikke blev dannet som kan begrænse den langsigtede succes af denne stillads ^12.

For rationelt at designe en forbedret anden generation syntetisk hjerteklap blev en murin model for hjerteklap transplantation skabt til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer underlying neotissue dannelse, ventil fortykkelse og stenose udvikling. Murine modeller tilbyder en bred vifte af molekylære reagenser, herunder transgene, som ikke er let tilgængelige i andre arter ^7. I denne hjerteklap transplantation model blev et ex vivo syngenisk pulmonal hjerteklap udskiftning udføres først; og derefter hjerte med implanteret hjerteklap blev implanteret heterotopisk i en syngen vært ved hjælp af et mikrokirurgisk teknik. Denne model gør det muligt for hjerteklap udskiftning uden behov for kardiopulmonær bypass.

I dette papir, er donor hjerte præparater, hjerteklap transplantation og heterotopisk hjerte transplantation beskrevet en detaljeret forklaring af en hjerteklap høst. Resultaterne viste en løbende hjerteslag fra donor hjerte, der var uafhængig af modtageren hjerteslag. Blodgennemstrømningen i den implanterede pulmonal ventil blev målt under anvendelse af en højfrekvent ultralyd system med en pulserende bølge aktiviteterppler.

Protocol

Bemærk: Alle dyreforsøg blev godkendt af Nationwide Børnehospital Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Pulmonal hjerteklap Harvest fra en hjerteklap Donor Mouse

1. Autoklave alle de kirurgiske redskaber før operationen: 1x fine saks, 3x mikro pincet, 2x mikro vaskulære klemmer, 1x klemme anvender pincet, 1x mikro nåleholder, 1x foråret saks, 1x retractor.
2. En 6-8 uger gammel kvinde C57BL / 6 mus anvendes som en pulmonal hjerteklap donor. Fjern musen fra sit bur og vejes derefter aflive med ketamin / xylazin cocktail (ketamin 200 mg / kg og xylazin 20 mg / kg, IP) overdosering.
3. Clip brystet og placere musen i en dorsal recumbence position på en pude. Så gør det torakotomi. Expose hjertet, gør et lille snit på højre atrium, og perfuse venstre ventrikel med iskoldt saltvand.
4. Uden omsvøb dissekere lungepulsåren (PA) fra opstigende enOrta. Klip pulmonal ventil (PV) sammen med 2 mm manchet af lungepulsåren. Kassér resten af ​​hjertet.
5. Opbevar PV i koldt heparin og saltopløsning (100 enheder / ml). Bemærk: Den PV kan holdes i opløsningen i to timer før transplantation til donor hjerte.

2.. Donorhjerte Forberedelse

1. En 6-8 uger gammel kvinde C57BL / 6 mus benyttes som et hjerte donor. Fjern musen fra sit bur og vejes derefter aflive med ketamin / xylazin cocktail (ketamin 200 mg / kg og xylazin 20 mg / kg, IP) overdosering. Dette er en terminal procedure.
2. Clip brystet og placere musen i en dorsal recumbence position på en pude. Så gør det torakotomi. Omsvøb adskille hjertet, inferior vena cava (IVC), vena cava superior (SVC) opstigende aorta, PA, og lungevene. Perfuse IVC med iskoldt sterilt saltvand.
3. Ligere IVC, SVC, og pulmonal vene med 6-0 silkesutur derefter skæres overlegen i forhold tilligaturer.
4. Skær aorta og PA med 2 mm manchet.
5. Klip PV og bortskaffe det.

3.. Hjerteklap Transplantation på en donor hjerte

1. Umiddelbart efter trin 2.5, placeres hjerteklap fra trin 1.5 i donor hjerte og orientere hjerteklap.
2. Fastgør PV med et sting på højre side af ventilen ved hjælp 10-0 monofilament sutur på koniske nåle og begynder at sy kontinuerligt med 5-6 masker fra den anden side af PV.
3. Efter afslutning af den forreste side, drejes hjertet vandret og begynder at sy bagsiden af ​​PV på donor hjerte.
4. Opbevar hjertet i en kold steril heparin / saltvand. Bemærk: Den donor hjerte kan holdes i opløsningen i to timer før implantation til modtageren musen.

4.. Heterotop Heart Transplantation på en modtager Mouse

1. En 6-8 uger gammel kvinde C57BL / 6 mus blev anvendt som recipient. Fjern musen fra sit bur og vejes derefter bedøvet med ketamin / xylazin cocktail (ketamin 100 mg / kg og xylazin 10 mg / kg). Ketoprofen (5 mg / kg) anvendes som preanesthesia smertestillende.
2. Efter kontrol af sedationsniveau ved hale knibe, klip den abdominale og bryst hår. Smør øjnene med steril oftalmologiske salve, og placere musen i en dorsal recumbence position på en pude. Desinficer maven med betadin og alkoholservietter. Så dækker musen med en sterilt afdækningsstykke og eksponere snittet eneste område.
3. Lav en midterlinjen laparotomi snit fra under xyphoid til suprapubiske region, og indsætte en selv støttemur retractor. Wrap tarmene i saltvand gaze. Omsvøb definere den infrarenale aorta og vena cava.
4. Placer to 6-0 silkesuturer proksimalt og distalt omkring aorta og IVC at begrænse blodcirkulationen.
5. Placer donor hjerte på højre side af den abdominale aorta og dække det med sterilt Gauze. Moisturize det med saltvand.
6. Lav en aortotomy i den abdominale aorta ved anvendelse af en 30 G nål og udvide åbningen med en saks til størrelsen af ​​donor aorta.
7. Udfør en ende-til anastomose med sterile 10-0 monofilament suturer på koniske nåle. Fastgør donor aorta med en maske på proksimale ende af åbningen i den abdominale aorta og begynder at sy kontinuerligt med 4-5 masker fra den distale ende af den abdominale aorta.
8. Flip hjertet til venstre side, dække det med saltvand infunderet gaze og begynde at sy kontinuerligt med 4-5 masker fra den distale ende af den abdominale aorta.
9. Foretag en venotomy i IVC anvendelse af en 30 G kanyle og udvide åbningen til størrelsen af ​​donor lungepulsåren.
10. Udfør en ende på anastomose med sterile 10-0 monofilament suturer på koniske nåle. Fastgør donor PA med et sting på den proksimale ende af åbningen i IVC og begynder at sy kontinuerligt med 4-5 masker fraden distale ende af vena cava inferior. Denne gang, fordi aorta er i vejen, sørge sutur af venstre væg af donorens PA er på indersiden af ​​IVC.
11. Skyl IVC lumen med heparin og saltopløsning (100 enheder / ml). Luk højre væg donor PA og modtager IVC ved suturering dem kontinuerligt til den distale ende.
12. Fjern den distale ligatur og styre blødning ved at anvende en topisk absorberbar steril arterieklemme middel. Når blødning stopper helt fjerne den proksimale sutur og styre blødning på samme måde.
13. Retur tarmene og lukke mavemuskulaturen og hud i to lag ved hjælp af en 6-0 sort polyamid monofil sutur.
14. Injicer 0,5 ml saltvand subkutant og placere musen i et opsving bur på en opvarmning pad, indtil musen er fuldt mobil. Ved genopretning returnere musen til en ny bur med papir strøelse. Give smertestillende medicin (Ibuprofen, 30 mg / kg, drikkevand) til 48 timer. Gørikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskabet af andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.

Representative Results

Figur 1 illustrerer de skemaer af hjerteklappen transplantation model ved hjælp heterotopisk hjerte transplantation. Hjerteklappen blev høstet fra en donor hjerte og implanteret på et hjerte fra en anden donor mus. 2 viser en illustration af den implanterede hjerte på bughule (A), lige efter hjerte transplantation (B), og 5 min efter transplantation Derefter hjerte med nye hjerteklap blev implanteret i maven af en modtager mus. Figur. Efter fjernelse af suturer på begge sider af aorta og IVC, hjertet begynder at slå 1-2 min senere og bliver lyserøde mere blodcirkulation. Bemærk, at det højre atrium er mere forstørrede i (C) end (B). Hjertet gradvist slår stærkere og er stabil efter 24 timer.

Blodgennemstrømningen i den implanterede pulmonal ventil blev målt perkutant 10 dage efter implantation under anvendelse afen højfrekvent ultralyd-system med pulserende bølge Doppler (figur 3). Placeringerne af aorta, højre ventrikel (RV), implanteret pulmonal ventil (PV) og pulmonær arterie (PA) i B-mode blev vist i figur 3 (A). Den gule prøvevolumen overlay er placeret på den implanterede PV. Figur 3 (B) viser et diagram af anatomi og placeringen af prøvevolumen overlay. Som vist i figur 3 (C) blev donor hjerte QRS bølge detekteres rytmisk og uafhængig af modtageren hjerte bølge. Den målte systolisk og diastolisk blodvolumen på den implanterede PV matchede donor hjerte bølge. Den maksimale hastighed var omkring 100 mm / sek.

Figur 1.60, Skematisk af hjerteklap transplantation En pulmonal hjerteklap blev høstet fra en første donor mus og implanteret i et hjerte fra en anden donor mus.. Derefter hjerte med nye ventil blev implanteret heterotopisk i en recipient mus.

Figur 2. Det transplanterede hjerte. A) Et diagram af et hjerte med ny hjerteklap implanteret til bughule (B) lige efter implantation, og (C) 5 minutter efter implantation.

Figur 3.. Blood flowmåling i implanted pulmonal ventil. A) B-mode billede angiver placeringen af aorta, højre hjertekammer (RV), implanteret pulmonal ventil (PV) og lungepulsåren (PA). B) Et diagram af anatomi og placering af prøvevolumen overlay. C) Velocity måling på den implanterede PV med EKG bølge.

Discussion

Dødeligheden af ​​denne procedure er tæt på 20%, hvilket hovedsageligt skyldes blødning ved PV transplantation stedet og anastomose på donor aorta til modtageren abdominale aorta. I de fleste tilfælde er dødeligheden markant, 48 timer postoperativt. Overlevelsen mus viste stærke hjerteslag og blodgennemstrømning gennem det implanterede PV. Hele processen tager fire timer for en erfaren mikro kirurg. Det vil tage omkring 250 mus til at mestre teknikken. Heterotop hjertetransplantation er relativt ligetil i forhold til PV implantation til donor hjerte. En af de mest kritiske trin for en vellykket HV transplantation høst af PV-struktur fra en donor mus. PV strukturen bør transected omkring 1-2 mm under ventilen. Hvis den resterende væv er for kort, vil anastomose være udfordrende. Hvis vævet under PV er for lang (dvs.. PA vil være for lang i forhold til opstigningenning aorta efter implantation), kan den implanterede PA vride eller knækket. Et andet afgørende skridt er anastomose mellem den implanterede PA og modtager IVC. Da IVC er meget tynd, er det ekstremt let at rive under suturering.

I denne model, aorta blod kommer gennem aorta, strømmer gennem kranspulsårerne, og derefter ud gennem koronar sinus til donoren RA. Så blodvolumen til at passere gennem den implanterede PV er 5% af det totale blodvolumen i estimering, som er den væsentligste begrænsning i denne model til at studere TEHV. For at øge blodgennemstrømningen selvom PV blev tre yderligere modeller oprettet. Først blev en tredje anastomose oprettet fra donor RV til modtageren IVC. Den tredje anastomose kan forøge blodgennemstrømningen med 10% til 50% af den samlede blodvolumen. For det andet, for yderligere at øge blodgennemstrømningen, efter at placere den tredje anastomose blev IVC ligeret proximalt til tredje anastomose. Denne fremgangsmåde sikrede 50% af blodstrømmen gennemimplanteret PV. For det tredje, for at øge strømmen gennem den implanterede PV og opretholde mere fysiologisk omløb, hjertet transplanteret med lungerne. Denne metode vil kunne øge strømmen på op til 50% af den samlede blodgennemstrømning og endnu vigtigere, den venstre ventrikel og venstre atrium opretholde deres omsætning. Disse forskellige fysiologiske flow-modeller giver os mulighed for at studere, hvordan forskellen i fysiologiske strømningsforhold påvirker udviklingen af ​​neotissue og stenose i en transplanteret hjerteklap.

For nylig har vi gennemført en pilotundersøgelse til transplantation decellulariserede HV uden cellepodning ved hjælp af den beskrevne teknik i dette papir. Den implanterede PV viste lignende blod flydeegenskaber som kontrol, predecellularized transplanterede PV. I fremtiden vil forskellige typer af celler podes at studere neotissue dannelse og stenose udvikling af transplanterede HV. Desuden bruger transgene mus, såsom grønt fluorescerende protein (GFP)-mus eller et mouSE model af HV sygdom, kan processen med neotissue dannelse være mekanistisk studeres ved at studere kilde til celler befolker decellulariserede eller syge hjerteklap hjælp immunhistokemi, som vil støtte udviklingen af ​​mere rationelt designede anden generation manipuleret væv hjerteklapper. Muligheden for at anvende forskellige fysiologiske flow betingelser, transgene mus, decellulariseret PV implantationer og mulige kombinationer af alle tre viser alsidighed og potentielt vigtig præklinisk anvendelighed af denne HV transplantation model.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14190-144
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% sodium chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 - Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non Woven Sponges	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18 G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25 G 1 in., Needle	BD	305125
30 G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500
VEVO2100 High Frequency Ultrasound	VisualSonics	http://www.visualsonics.com/vevo2100	The catalog number and pricing can be acquired from the sales representatives.
Ultrasound transmission gel	Parker Laboratories, INC.	01-02
Table Top Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip, INC.	901806
Isoflurane	Baxter	1001936060