Summary

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

Published: September 30, 2014
doi:

Summary

Redes corticales son controlados por un conjunto pequeño, pero diverso de interneuronas inhibidoras. Investigación funcional de interneuronas por lo tanto requiere la grabación específica y la identificación rigurosa. Aquí se describe un enfoque combinado que involucra conjunto de células grabaciones de pares individuales o sinápticamente acoplados de neuronas con el etiquetado intracelular, post-hoc morfológica y inmuno análisis.

Abstract

Interneuronas GABAérgicas inhibitorias juegan un papel central dentro de los circuitos neuronales del cerebro. Las interneuronas representan un pequeño subconjunto de la población neuronal (10-20%), pero muestran un alto nivel de heterogeneidad fisiológica, morfológica, y neuroquímicos, que refleja la diversidad de sus funciones. Por lo tanto, la investigación de las interneuronas ofrece importantes conocimientos sobre los principios de organización y funcionamiento de los circuitos neuronales. Esto, sin embargo, requiere un enfoque fisiológico y neuroanatómico integrado para la selección e identificación de tipos de interneuronas individuales. De células enteras de grabación de cortes de cerebro agudos de animales transgénicos, que expresan proteínas fluorescentes bajo los promotores de marcadores-interneuron específica de patch-clamp, proporciona un método eficiente para apuntar y caracterizar propiedades intrínsecas y sinápticas de tipos específicos interneuron electrofisiológicamente. Combinado con tinte de etiquetado intracelular, este enfoque se puede ampliar con mo post-hocanálisis rphological y inmunocitoquímica, que permite la identificación sistemática de las neuronas registradas. Estos métodos se pueden adaptar para adaptarse a una amplia gama de cuestiones científicas sobre las propiedades funcionales de los diversos tipos de neuronas corticales.

Introduction

Circuitos neuronales del hipocampo han sido durante mucho tiempo objeto de un intenso escrutinio, con respecto tanto a la anatomía y la fisiología, debido a su papel esencial en el aprendizaje y la memoria, así como la navegación espacial en los seres humanos y roedores. Igualmente, la organización laminar prominente, pero simple del hipocampo hace de esta región un tema favorito de estudios sobre las propiedades estructurales y funcionales de las redes corticales.

Circuitos del hipocampo se componen de células excitatorias principales (> 80%) y una más pequeña (10-20%), pero muy diversa cohorte de interneuronas inhibidoras 1-3. Las interneuronas liberan ácido γ-aminobutírico (GABA) desde sus terminales de los axones que actúa en ionotrópicos rápido receptores GABA A (GABA A Rs) y los receptores de GABAB metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estos mecanismos inhibitorios se equilibran de excitación y regulan la excitabilidad de las células principales, y por lo tanto laIR temporización y el patrón de descarga. Sin embargo, liberado de interneuronas GABA actúa no sólo en las células principales, sino también en los propios 5,6 interneuronas. Receptores pre y postsinápticos median la regulación por retroalimentación y las interacciones mutuas inhibitorias entre los diversos tipos de interneuronas. Estos mecanismos inhibitorios en las redes de interneuronas se cree que son fundamentales para la generación y conformación de los patrones de actividad de la población, en particular las oscilaciones a diferentes frecuencias 7.

Grabación de patch-clamp de célula entera es un método bien establecido para el examen de las propiedades intrínsecas y las interacciones sinápticas de las neuronas. Sin embargo, debido a la gran diversidad de tipos de interneuronas, la investigación de las interneuronas inhibidoras requiere la identificación rigurosa de las células grabadas. Como los tipos de interneuronas del hipocampo se caracterizan por rasgos distintivos morfológicos y la expresión de marcadores neuroquímicos, anatómica combinada y inmunocitoquímica eXAMEN puede proporcionar un medio para determinar la identidad precisa 6,8,9 interneuron.

En el presente trabajo se describe un enfoque experimental en el que su conjunto de células patch-clamp grabaciones de las neuronas individuales o pares sinápticamente acoplados se combinan con el etiquetado intracelular, seguido de post-hoc de análisis morfológico y inmunocitoquímica, lo que permite la caracterización de lenta GABA B receptor mediada efectos inhibitorios en interneuronas identificados. A modo de ejemplo, nos centramos en uno de los principales tipos de interneuronas, un subconjunto de las llamadas "células cesto" (BC), que inerva el soma y dendritas proximales de sus metas post-sinápticas y se caracteriza por un "Rematar rápida" (FS) descargar patrón, un axón cubriendo densamente la capa de cuerpo de la célula, y la expresión de la proteína parvalbúmina de unión a calcio (PV) 10,11. Estas interneuronas muestran grandes corrientes postsinápticas inhibitorias, así como pre prominentemodulación sináptica de su producción sináptica, en respuesta a la activación de GABA B R 12. La combinación de las técnicas descritas aquí se puede aplicar igualmente bien para investigar los mecanismos intrínsecos o sinápticas en una variedad de otros tipos de neuronas identificadas.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos y de los animales de mantenimiento se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la Ley Alemana de Bienestar Animal, el Consejo Europeo de la Directiva 86/609 / CEE relativa a la protección de los animales, y las directrices de las autoridades locales (Berlín, T-0215/11 ) 1 Preparación de rebanadas de hipocampo aguda- Tome una rata transgénica (17 a 24 días de edad), que expresa la proteína Venus / YFP fluo…

Representative Results

A condición de que la calidad del corte es considerablemente buena, la grabación tanto de CA1 PC y FS-ins se puede conseguir con dificultad mínima. La línea de rata transgénica que expresa Venus / YFP bajo el promotor VGAT 13 no identifica inequívocamente FS-ins, o incluso chalecos. Sin embargo grabaciones del INS en los alrededores de str. pyramidale, donde la densidad de FS-ins es típicamente alta 1, da como resultado una alta probabilidad de seleccionar FS-ins (Figura 2B)…

Discussion

Se describe un método que combina técnicas electrofisiológicas y neuroanatómicas para caracterizar funcionalmente neuronas morphologically- y neuroquímicamente identificados in vitro; en particular, los diversos tipos de INS inhibitorias corticales. Los aspectos clave del procedimiento son: (1) pre-selección de INS potenciales; (2) el registro intracelular y la visualización de las neuronas; y, finalmente, (3) el análisis morfológico y inmunocitoquímica de IEE registrados. Aunque este estudio se ha ocupado de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer a Ina Wolter por su excelente asistencia técnica. VGAT-Venus ratas transgénicas fueron generadas por los Dres. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi y Y. Kawaguchi en el Instituto Nacional de Ciencias Fisiológicas, Okazaki, Japón, usando pCS2-Venus proporcionada por el Dr. A. Miyawaki.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Transgenic vGAT-venus rats see Uematsu et al., 2008
Venus (515 nm) goggles BLS Ltd., Hungary
Dissection tools i.e. FST For brain removal
Vibratome Leica VT1200S Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation
Slice holding chambers Custom-made in lab
Upright IR-DIC microscope Olympus, Japan BX50WI With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.
CCD camera Till Photonics VX55
505 nm LED system Cairn Research OptiLED system Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. 
Multiclamp 700B  Axon Instruments Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers 
WinWCP acquisition software John Dempster, Strathclyde University Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. 
Electrode Puller Sutter P-97 Used with box-filament
Borosilicate pipette glass Hilgenberg, Germany 1405020 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament
Peristaltic pump Gilson Minipuls Other pumps or gravity feed could be used instead
Digital Thermometer Custom made
Digital Manometer Supertech, Hungary
Isolated constant voltage stimulator Digitimer, Cambridge DS-2A
Biocytin Invitrogen B1592 Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine 
DL-AP5(V) disodium salt Abcam Biochemicals ab120271
DNQX disodium salt Abcam Biochemicals ab120169 Alternatively NBQX or CNQX
Gabazine (SR95531) Abcam Biochemicals ab120042 Alternatively bicuculline methiodide
R-Baclofen Abcam Biochemicals ab120325
CGP-55,845 hydrochloride Tocris 1248
Streptavidin 647 Invitrogen S32357
anti-PV mouse monoclonal antibody Swant, Switzerland 235 Working concentration 1:5000-1:10,000
anti-mouse secondary antibody  Invitrogen A11030 If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.
Normal Goat Serum Vector Labs S-1000
Microscopy slides Any high quality brand 
Glass coverslips Usually 22 x 22 mm
Agar spacers Agar block, cut on vibratome to 300 μm
Laser scanning confocal microscope Olympus, Japan Fluoview FV1000 Or other comparable system
Fiji (Fiji is just ImageJ) http://fiji.sc/Fiji See Schindelin et al., 2012

References

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Cite This Article
Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. J. Vis. Exp. (91), e51706, doi:10.3791/51706 (2014).

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