Summary
Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.
Abstract
GABAerjik inhibitör beyin nöronal devrelerin içinde merkezi bir rol oynarlar. Internöron nöronal bir topluluğun canlılığını (% 10-20) küçük bir alt kümesi ihtiva eder, ancak bunların çeşitli fonksiyonları yansıtan, fizyolojik morfolojik ve nörokimyasal heterojenlik yüksek bir seviyesini gösterir. Bu nedenle, internöronlar incelenmesi önemli organizasyon ilkeleri anlayışlar ve nöronal devrelerin fonksiyonu sağlar. Ancak bu durum, tek tek interneuron türlerinin seçimi ve tanımlanması için bir fizyolojik ve Nöroanatomik bir yaklaşım gerektirmektedir. Interneuron özel markörlerin promotörler altında floresan protein ifade eden transgenik hayvanların akut beyin kesitleri, kayıt, tam hücre patch-clamp, hedef ve elektrofizyolojik spesifik interneuron türleri iç ve sinaptik özelliklerini karakterize etmek için etkili bir yöntem sağlar. Hücre içi boya etiketleme ile birlikte, bu yaklaşım post-hoc mo ile uzatılabilirrphological ve immünositokimyasal analizi, kaydedilen nöronların sistematik bir şekilde tanımlanması sağlanır. Bu yöntemler kortikal nöronların çeşitli türdeki fonksiyonel özellikleri ile ilgili bilimsel sorular geniş bir yelpazede uygun hale getirilebilir.
Introduction
Hipokampal nöronal devreler nedeniyle uzun süredir insanlar ve kemirgenler hem onların öğrenme ve hafızada önemli bir rol yanı sıra mekansal navigasyon için anatomi ve fizyoloji, hem de saygı ile, yoğun inceleme konusu olmuştur. Aynı şekilde, hipokampusun önemli, ama basit laminar organizasyon bu bölge kortikal ağların yapısal ve fonksiyonel özelliklerini ele çalışmaların bir tercih konusu yapar.
Hipokampal devreleri uyarıcı asıl hücrelerin (>% 80) ve daha küçük (% 10-20), ancak inhibitör 1-3 derece çeşitli kohort oluşmaktadır. Internöron hızlı iyonotropik GABA A reseptörlerinin hareket akson terminallerinden γ-amino butirik asit (GABA) (GABA A Rs) ve yavaş metabotropik GABA B reseptörleri (GABA B TL) bırakın 4. Bu inhibisyon mekanizması uyarma dengelemek ve ana hücrelerinin uyarılabilirliğini düzenleyen ve böyleceir zamanlama ve deşarj desen. Bununla birlikte, GABA internöronlar salınan ana hücreler üzerinde değil, aynı zamanda kendilerini 5,6 internöronlar üzerinde de etki eder. Ön ve postsinaptik reseptörleri interneuron çeşitli türleri arasında geribildirim düzenleme ve inhibitör karşılıklı etkileşimlere aracılık. Interneuron ağlarda Bu önleyici mekanizmalar farklı frekanslarda 7'de özellikle sallantı- nesil ve nüfus aktivite desen şekillendirme, merkezi olduğuna inanılmaktadır.
Tüm hücre patch-kelepçe kayıt içsel özellikleri ve nöronların sinaptik etkileşimlerinin incelenmesi için köklü bir yöntemdir. Ancak, interneuron türleri yüksek çeşitlilik nedeniyle, inhibitör incelenmesi kaydedilen hücrelerinin titiz belirlenmesini gerektirir. Hipokampal interneuron türleri farklı morfolojik özellikler ve nörokimyasal işaretleyici ifade, kombine anatomik ve immünositokimyasal e nitelendirildiğindenxamination hassas interneuron kimlik 6,8,9 belirlemek için bir araç sağlayabilir.
Bu yazıda biz yavaş GABA B karakterizasyonu için izin, tek nöronların veya sinaptik-birleştiğinde çiftlerinden tüm hücre patch-kelepçe kayıtları post-hoc morfolojik ve immünositokimyasal analizi ile takip, hücre içi etiketleme ile kombine edildiği deneysel bir yaklaşım tanımlamak reseptör tespit internöronlarda inhibitör etkilere aracılık. Örnek olarak, biz onun postsinaptik hedeflerin soma ve proksimal dendritler innerve ve bir "fast çivilenmesi" (FS) ile karakterize edilir interneuron bir ana tip, sözde "basket hücrelerinde" (BC) bir alt kümesi, odaklanmak kalsiyum-bağlayıcı protein parvalbumin (PV), 10,11 desen yoğun hücre gövdesi kaplama tabakası bir akson ve ifade boşaltın. Bu internöron büyük postsinaptik inhibitör akımları, yanı sıra önde gelen pre gösterilecekGABAB R aktifleşmesinin 12 tepki olarak sinaptik çıkış sinaptik modülasyonu. Burada açıklanan tekniklerin kombinasyonu tanımlanmış diğer nöron türlerinden çeşitli intrinsik veya sinaptik mekanizmalarını incelemek için de eşit ölçüde uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Açıklama: Tüm prosedürler ve hayvan bakım Kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı, Alman Hayvan Refahı Yasası, Avrupa Konseyi hayvanların korunmasına ilişkin Direktifi 86/609 / EEC ve yerel otoriteler (Berlin, T-0215/11 den kılavuzlar )
Akut-hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.
- Kortikal inhibitör 13 çoğunluğunu etiketler vGAT promoteri altında, floresan Venüs / YFP proteini ifade edilmesi, (17-24 günlük) bir transgenik fare al. Sıçan başını kesmek. Hızla carbogenated, semifrozen (% 95 O 2 /% 5 CO 2) sakaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı (sakaroz-ACSF, Şekil 1A) içine beyin (<40 sn) teşrih.
- , Lamba ve 515 emisyon filtresi LED gözlük bir çift üzerine monte nm bir 505 ile Venüs / YFP floresan için disseke sıçan beyni değerlendirin.
- Korteks ve Cereb cephe üçte çıkarınEllum; sonra tüm bir neşter ile, hemisferlerdir ayırmak. Daha önce tarif edildiği gibi 14, beyin aşağı yapıştırmak için düz bir yüzey temin etmek üzere korteks dorsal yüzeyini çıkarın.
- Bir vibratom üzerinde hipokampal oluşumun enine dilim (300 mikron) Kesme, hemisfer semifrozen ile çevrili olmalı, sakaroz-ACSF (Şekil 1B) 14 carbogenated. Rostral korteks, midbrain ve beyin sapı ek bölgeleri çıkarın. Carbogenated ve 35 ° C'ye ısıtılır sükroz ACSF ihtiva eden bir yarı-tutma odasına her dilim aktarın.
- Isındı ACSF giren son dilimin zaman 30 dakika boyunca 35 ° C'de kurtarmak için dilimleri bırakın. Metabolik süreçleri etkinleştirmek ve kesilmiş nöronal süreçlerin kapanmanın kolaylaştırmak için bunu yapın. Daha sonra depolama (Şekil 1C), oda sıcaklığında transfer.
2. İmalat ve Kayıt Pipetler dolumu
- Pu(hücre içi etiketleme için)% 0.1 biocytin ihtiva eden hücre içi çözelti filtreden geçirilmiş ile doldurulduğu zaman 2-4 M? bir pipet direnci elde edilir, böylece cam kılcal LL yama pipetler, (0.2 mikron bir şırınga filtreden, gözenek boyutu). Bileşenlerinin bozunmasını önlemek için buz üzerinde soğutulmuş, hücre içi çözelti tutun.
- Konsantrasyon (; çözelti listesine bakınız E R (Cl) = -61 mV), - fizyolojik olarak ilgili olan, düşük Cl ihtiva eden bir çözelti ile postsinaptik akımlar tespit edilmesi için yama pipetler doldurun.
- Konsantrasyonunu (E R (Cl) = - eşleştirilmiş kayıtları presinaptik reseptörü kaynaklı tepkileri belirlemek için, düşük bir Ca 2 + tampon presynaptically transmiter salımına engel olmamak için kapasitesi, hem de 4-kat daha yüksek bir Cı gibi, hücre içi çözelti ile yama pipet dolgu -20 mV) sinyal-gürültü farmakolojik respin doğru değerlendirilmesini sağlayan gözlenen iPSCs 5 artırmak içinonsiveness. Konsantrasyon IPSC kinetik 15 değiştirebilecek - Cl değişen unutmayın.
FS-ins 3. Tüm Hücre Patch-kelepçe Kayıt
- ACSF Carbogenate ve (aynı zamanda emme hattı, Şekil 2A aracılığıyla kayıt odasından ACSF kaldırır) bir peristaltik pompa vasıtasıyla, kayıt odasına perfüzyon sistemine beslenir. Kayıt için hazırlık kurulum tüm ekipmanı açın.
- Kayıt odasına bir dilim aktarın ve ipek tek lifleri ile sinirli bir platin halkası ile yerinde tutun. CA1 stratum (str.) Pyramidale hem str 2 pipet ile erişim sağlayan, görüş alanında dikey olarak çalışacak şekilde dilim yerleştirin. radiatum ve str. oriens anda (Şekil 2C ve 4A).
- (32-34 ° C) kayıt A kurulum içine odasına yerleştirin ve carbogenated perfüzyon başlar ve ısındı5-10 ml / dakika bir akış hızında CSF verildi.
- 40X objektif büyütme IR-DIC optik altında dilim kalitesini değerlendirmek ve bir ekranda izlendi CCD kamera ile görselleştirmek. Yuvarlak, orta kontrastlı CA1 piramidal hücreleri (CA1 PC), çok sayıda str görüldüğü takdirde iyi bir dilim kaliteli varsayalım. pürüzsüz ve hafifçe kraterli yüzeyi (Şekil 2C) altına 20-30 mikron derinlikte pyramidale. Kalitesiz dilimleri pürüzlü bir dilim yüzeye sahip, yüksek kontrastlı, çökmüş ya da şişmiş hücrelerin çok sayıda içerir.
- Veya str yakın büyük kutuplu somata ile Venüs / YFP (Şekil 2B), ifade gibi epifloresans aydınlatma altında farazi FS internöronlardan tanımlayın. pyramidale. Makul derin amacıyla dilim (50-100 mikron, Şekil 2C) içindeki hücreleri seçin daha iyi morfolojik bütünlüğünü korumak için.
- Headstage pipet tutucu kayıt elektrodu monte; Daha sonra uygulamaly tüp hattı üzerinden düşük, pozitif basınç (20-30 mBar). Dilim yüzeyine indirin pipet hafifçe seçilen nöronun merkezine kaydırın.
- Daha önce 14,16 anlatıldığı ve aynı zamanda 2D ve 2E Rakamlar bkz olarak tam hücreli kayıt yapılandırmasını edinin:
- Bir hücreyi hedef: 70-80 mBar'a basıncını arttırın ve hızla sadece seçili hücreye (Şekil 2B, üstte) soma yukarıda dilim aracılığıyla pipet indirin.
- Hücreyi Yaklaşım: (üst, Şekil 2B) bunun üzerine bir "gamze" üretmek için hücre zarı karşı pipet basın. Komşu hücrelerin biocytin etiketleme önlemek için, hızlı bir şekilde bu adımı gerçekleştirin.
- Giga-ohm mühür oluşturun: pipet 20 mV gerilim komutu uygulamak eşzamanlı basıncı bırakın ve. Bir giga-ohm mühür (1-50 GΩ Şekil 2B, alt ve Şekil 2E orta) typicmüttefiki hızla gelişir. Bir kez gerilim komut olarak potansiyel beklenen dinlenme membran (tipik olarak -70 ve -60 mV) uygulanacaktır, mühürlü.
- Yama kırmaya: mühürlü sonra, negatif basınç kısa bir darbe ile membran rüptürü yama; böylece bütün hücre konfigürasyonu (Şekil 2E ve alt) etkisi.
- Bütün hücre kapasitans ve seri direnç (R S) dengeleyin. R s 120 dakikaya kadar normalde 5-20 M? Ve kararlı. Break-through membran potansiyeli (V M) -50 mV daha depolarize ise hücreleri terk; R S 30 M? Daha başlangıçta büyüktür; Kaydın boyunca% 20'den fazla ya da R ve S değişir.
- (+250 PA, Şekil 2F, top -250) akım darbeleri Depolarizan için hiper bir aile (akım kelepçe modunda) onların yanıt FS-İnş tanımlayın. FS-INs nispeten V M (genellikle -50 t depolarize varo -60 mV), kısa membran zaman sabiti (<20 msn) ve frekanslarda aksiyon potansiyelleri bir tren (AP) ile akım enjeksiyon Depolarizan 500 pA yanıt> 100 Hz 11 (Şekil 2F, alt), belirgin olan CA1 PC'ler (Şekil 2F, orta) olanlar farklı.
4. Hücre dışı Elektriksel Stimülasyon GABA B R-aracılı yanıtları uyandırmak için
- Str sınırında dilim:; synaptically uyarılmış yanıtları gözlemlemek için, bir hücre dışı uyarım elektrot (0.1-0.3 M? Direnç 2 M NaCl ile dolu bir yama pipet) yerleştirin. radiatum ve str. lacunosum-moleculare. stimülasyon eserler (Şekil 3A) hücrenin doğrudan elektrik stimülasyonu önlemek ve en aza indirmek için soma elektrodu 200-300 mikron yanal yerleştirin.
- Stimülasyon elektrodu bir biçimde pozisyonlandığı zaman, tüm hücre kayıt eldeseçilen hücre ve 3.9 bölüm (Şekil 3B) olarak akım kelepçe modunda fizyolojik fenotipi değerlendirmek.
- Voltaj-kelepçe (V M -65 mV) kaydedilen nöron ile bir presinaptik akson elektriksel uyarımı sağlamak 50 V (~ 500 uA etkili uyarıcı), izole edilmiş bir sabit voltaj uyarıcısı kullanılarak her 20 saniye,. Tek uyaranlara kullanın (100 mikro-saniye süresi, Şekil 3C, üst) GABA B R aracılı iPSCs gözlemlemek, ve daha verici serbest üretmek için (200 Hz) birden uyaranların trenler ile birbirinden.
- İzole monosinaptik IPSC (orta üst Şekil 3C) ortaya çıkarmak için:;: Banyo İyonotropik glutamat reseptör antagonistleri (d-AP5 [50 iM] NMDA reseptör DNQX [10 iM] AMPA reseptörü) uygulanır. Bundan başka, bir GABA A, R'nin bloker tatbik edilmesi ile, GABAB R aracılı iPSC izole (gabazine [10 uM]; Şekil 3C, L ortaower).
- GABA B sonraki uygulama CGP-55845 [5 mcM] (Şekil 3C alt, gri bindirmiştir) tarafından R-aracılı olarak bileşkesini yavaş dışa akım (genişletilmiş Şekil 3C düşük) onaylayın
FS-IN ve CA1 PC'ler birleştiğinde synaptically 5. Eşli Kayıtlar
- Aşağıda açıklandığı gibi sinaptik-birleştiğinde IN ve PC çiftleri arasında yapılan eş zamanlı kayıtları ile inhibitör sinaptik iletim GABA B R aracılı presinaptik kontrolünü değerlendirmek.
- Öncelikle, (bölüm 3 gibi) bir presinaptik interneuron bütün bir hücre kayıt kurmak ve FS fenotip (Şekil 4A) onaylayın.
- Sonra komşu CA1 PC (20-100 mikron mesafe, Şekil 4A) yama ve APleri ortaya çıkarmak için (akım kelepçe modunda tutulan) presinaptik IN akım darbeleri (1 msn süre, 1-5 nA genlik) Depolarizan kısa suprathreshold geçerlidir. Sinaptik bir işbirliği halindennection, voltaj-kelepçe düzenlenen CA1 PC, içinde olarak iPSCs neden olmaktadırlar AP (yaklaşık% 80 ila R S telafi) kullanılır.
- Gerekirse bir bağlantı bulunana kadar, daha CA1 PC'ler yeni kayıt elektrot ve kayıt doldurun.
- Bir bağlantı kurulduktan sonra, üniter sinaptik tepki ve dinamik davranışı hem değerlendirmek için presinaptik FS-IN içinde AP çiftleri ortaya. 50 milisaniye aralıklarla (Şekil 4B) ile 2 olan depolarize edici uyarılara tipik bir eşleştirilmiş darbe protokolünü kullanır.
- Bazal koşullarda kontrol izlerini toplayın. Daha sonra, bu şekilde tam olarak reseptör aracılı etkileri engellemek için, antagonistin CGP-55845 (5 uM), ardından GABAB Rs, aktivasyon, perfüze ACSF için seçici GABAB R agonisti baklofen (10 uM) uygulanır. Her ilaç durumda (Şekil 4B ve C) Kararlı durum sırasında ~ 50 izleri toplayın.
- Kayıt işlemi tamamlandıktan sonra, bir dışında Paris oluşturarak somatik membran sızdırmazE-üzerinden yama: Yavaş V-kıskacına hücre gövdesinden pipet çekilme ve R S arttıkça, mV -40 V M azaltır. Dış kısım-dış yama oluşumunu kolaylaştırmak için bu fazlası; Daha sonra banyosundan pipet çıkarın.
Elektrofizyolojik Özellikleri 6. Analizi
- NOT: farklı yazılım paketleri bir çokluk elektrofizyolojik veri edinimi için kullanılabilir. Burada, WinWCP, ücretsiz Strathclyde Elektrofizyoloji Yazılım paketinde bir Windows programı kadar 16 analog giriş kanalları kayıt ve 10 dijital sinyallerin çıkışını sağlayan, kullanılır.
- Alçak geçiren filtre 20 kHz tüm 5-10 kHz veri ve örnek.
- Bir off-line analiz suite ile fizyolojik verileri analiz.
NOT: Stimfit, bu durumda kullanılan bir Python kabuğu içeren açık kaynak kodlu bir yazılım paketi; Ancak diğer alternatifler kolayca yerine kullanılabilir.- Pasif membran p AnalizKaydedilen nöronların roperties, membran dinlenme potansiyeli Bulunduğum kelepçe satın aldı.
- Kaydın başlangıcında kaydedilen yanıtların başlangıca göre ortalama dinlenme membran potansiyelinin ölçülmesi.
- Küçük hiperpolarizan atımlannm (≤ -50 pA) için gerilim yanıtı, Ohm kanunu kullanarak, giriş direnci hesaplayın. Gürültü oranı, ortalama birden izleri sinyali artırmak için. Not: Bizim örnekler 10-50 bireysel Piyango ortalamasıdır.
- Küçük hiperpolarizan akım darbelerine yanıtların çürüme bir monoexponential eğri oturtularak sürekli görünür membran zaman tahmin.
- Eşik genliği (tepe eşik) ve süreyi (yarı yükseklikte ölçülen genişlik) mevcut edilen kutuplaşma giderici darbelerin ortaya çıkardığı eşik seviyesinin belirlenmesi için aksiyon potansiyeli dalga analiz edin.
- GABA B R gerilim kelepçe kayıtları aracılı iPSCs analiz edin. Filtre off-çizgi izler500 Hz (Gauss filtresi) ve (en az 10 izleri ortalamalarının) GABAB R aracılık yanıtının tepe genliği ve gecikmeyi belirlemek.
- Tepe ve önceki taban arasında ölçülen GABA A R-aracılı iPSCs pik genliği bir değişiklik olarak ins inhibitör çıkışında GABA B Rs etkisini algılar. Kontrol süresi ve tüm farmakolojik dönemini kararlı devlet için ≥50 izlerinden ortalama genlik hesaplayın.
7. Görselleştirme ve İmmünositokimya FS-Ins
- Kayıtlarından sonra, 4 ° C 'de 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH = 7.35) O / N oranı ile% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile dilimleri sabitleyin.
- Gerekli dilimleri işlemeden önce 1 ~ haftaya kadar PB transfer ve saklanabilir edin.
- Liberal taze PB ve daha sonra% 0.9 NaCl ile 0.025 M PB yıkayın dilimleri (PBS, pH = 7.35).
- Fo dilimleri bloke spesifik olmayan antikor azaltmak için% 10 normal keçi serumu (NGS),% 0.3 Triton-X100, PBS içinde hazırlanmış NaN3 ve% 0.05 (membranları nüfuz edilebilir kılınması için bir deterjan) ihtiva eden bir çözelti içinde, oda sıcaklığında 1 saat r.
- PBS, NaN3% 5 NGS,% 0.3 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde seyreltilmiş bir anti-BD monoklonal fare antikoru kullanarak, BD ekspresyon için etiketlemek için. 4 ° C'de 12 gün boyunca 2-3 primer antikorlar inkübe edin. Iyice PBS dilimleri durulayın.
- Floresan anti-fare sekonder antikor uygulayın (örneğin AlexaFluor-546). Biyotin bağlayıcı protein streptavidin ile birlikte bir florokrom konjüge edilmiş (örneğin, AlexaFluor-647); ve PBS içerisinde seyreltilmiş NaN3,% 3 NGS,% 0.1 Triton-X100,% 0.05 ihtiva eden bir çözelti içinde inkübe edildi ve 4 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin.
- Liberal 2-3 PB durular ile PBS ile takip 2-3x dilimleri durulayın. Cam slaytlar dilimleri monte edin. Çökmesini dilim önlemek için 300 mikron ağar ayırıcı kullanın. Bir Fluores ile kapak kayma dilimleritırnak-cilası ile yüzde montaj orta ve mühür.
8. Görüntüleme ve Visualized İmar FS-Ins
- Uygun lazer çizgisinin (diyot lazer AlexaFluor-647 için 635 nm ile heyecanlı fluorochome muhabiri ile bir tarama konfokal mikroskop kullanılarak dilimleri görselleştirmek; Venus AlexaFluor-546 PV için etiketleme ve Argon 488 veya 515 nm Helyum-Neon 543 nm / YFP).
- Bütün hücrenin Z-yığını elde etmek için (20X objektif kullanarak, tipik haliyle 0.5-1 um adımlar) uygun bir Z çözünürlükte al. Birden yığınları normal görüntüye dijital FIJI / İmageJ yazılım (Şekil 5A) kullanarak off-line dikişli olabilir tam hücre, gereklidir.
- Bir yarı-otomatik izleme yöntemi kullanılarak dikişli görüntü yığını hücreyi yeniden yapılandırma (FİJİ / İmageJ yazılım paketi 17 Basit nörit İzleyici eklentisi, Şekil C).
- Son olarak, i PV-bağışıklık tepkiselliğini tahlilyüksek sayısal açıklık objektif lens ile nterneuron (60X silikon-daldırma, NA = 1.3). PV somatik arınma çok güçlü ise soma görüntüleri, proksimal dendritler ve proksimal akson veya alternatif akson terminallerinin olun. Immün-etiketleme biocytin-etiketli yapılar (Şekil 5B) ile uyum görülürse Hücreler PV için imünoreaktif sayılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağlanan bu dilim kalite hem CA1 PC'ler ve FS-INs az zorlukla elde edilebilir kayıt, kayda değer iyidir. VGAT promoter 13 altında Venüs / YFP ifade transgenik fare hattı tümden FS-INS, ya da gerçekten BCs tespit etmez. Ancak ve str etrafında INS gelen kayıtları. pyramidale, FS-ins yoğunluğu 1 genellikle yüksek olduğu, FS-ins (Şekil 2B) seçerek bir yüksek olasılık sonuçları. FS-INs CA1 PC'ler ve RS-INS, her ikisi de farklı karakteristik fizyolojik özellikleri ile ayırt edilebilir. Onlar nispeten depolarize dinlenme potansiyeli membran (-58,9 ± 1,5 mV, 15 hücreleri, vs CA1 PC'ler, 26 hücreler -62.6 ± 1.1 mV), düşük giriş direnci var (92 ± 12 M? Vs 103 PC'lerde ± 14 M?) ve hızlı belirgin membran zaman sabiti (15.4 ± 2.6 msn ve PC'lerde 22.0 ± 2.7 msn), resulhızlı gerilim yanıt ting akım darbeleri (Şekil 2F) hiperpolarize için. FS-INs (genlik 22.6 ± 2.9 mV ortalama) çok önemli hızlı afterhyperpolarization ardından nispeten düşük genlikli (82.8 ± 1.0 mV) çok kısa aksiyon potansiyelleri (0.38 ± 0.01 msn) taburcu edildi. (: Sol, Şekil 2D;; 34-128 Hz Kademe 82 ± 10 Hz) büyük depolarizasyon akımı darbeleri (250 pA) cevaben, FS-INs yüksek frekanslarda ateşledi.
FS-ins GABA B R aracılı postsinaptik akımları değerlendirmek için, farmakolojik izole sinaptik yanıtları str inhibitör liflerin dışı uyarılması ile ortaya çıkarıldı. radiatum / lacunosum-moleculare sınır. Şekil 3, bu bileşik, sinaptik tepkinin bileşenlerinin ardışık blokajı monosinaptik GABAB R aracılı yavaş iPSC izole edildiği bir FS-IN, bir örneğini göstermektedir. Sinaptik yanıtları Eli vardıTek uyaranlara veya str (200 Hz teslim 50 V yoğunluğu, 0.1 msn süresince,) 3-5 uyaranların trenler ile gösterdi. lacunosum-moleculare / radiatum sının (Şekil 3A). Uyarıcı ve inhibitör, her iki bileşenin (Şekil 3C, üst) dahil olmak üzere ilk bileşiği, kuvvetli bir tepki (Şekil 3C, sırasıyla orta DNQX, 10 uM ve AP-5, 50 uM), AMPA, NMDA reseptör antagonistlerinin, banyo tatbik edilmesi ile azaltılmıştır. (- Bu deneylerde, yaklaşık -60 mV bir ters potansiyele sahip tutma potansiyeli -65 mV'de aracılıdır akımı farazi bir içe Cl) ve bir akım daha yavaş dışarı doğru (bir varsayımsal aracılık Tortusal monosinaptik IPSC akım içeri doğru erken hızlı bir gibidir K + 100 mV bir ters potansiyel yakın iletkenlik). Seçici GABAA R antagonisti gabazine uygulanması (SR-95531, 10 uM), bir bırakarak hızla iPSC kaldırıldıYavaş GABAB R aracılı IPSC (Şekil 3C, alt, siyah iz) elde; bu uyaranlara tepki kısa trenleri için daha açık bir şekilde, tek bir uyarıya yanıt olarak görülebilir, fakat edildi. Bu güçlü ve seçici antagonist CGP-55845 (CGP, 5 um, Şekil 3C, alt, gri iz) tarafından tamamen bloke edilmiştir şekilde bu yanıt, bir GABAB R-aktivasyonlu K * iletimi gibi teyit edilmiştir. FS BC ler, tipik olarak bizim son yayın 12 'de gösterildiği gibi büyük genlik GABAB R aracılı iPSCs göstermektedir.
FS-IN GABA B Rs inhibitör çıktı, eşleştirilmiş kayıtları synaptically-birleştiğinde FS-IN ve CA1 PC'lerden yapıldı presinaptik düzenlenmesini değerlendirmek için. Daha önce 1,3 gösterildiği gibi FS nana ve CA1 PC'ler arasında sinaptik bağlantı nispeten yüksektir. Daha önce gösterildiği gibi, bu kayıtları, birleştirme olasılık yakından bulunduğu hücre çiftleri (≤50 um arasında% 50'nin üzerindedir;
Bir kayıt tamamlandıktan sonra, bir dış-dışarı yama başarıyla oluşmuş, dilim gecede sabit ve sonradan görselleştirmek ve analiz kaydedilen hücrelerinin morfolojisi ve nörokimyasal işaretleyici içeriğini belirlemek. Şekil 5A bir temsilci FS M.Ö. morfolojisini göstermektedir için işlendi konfokal mikroskop elde kombine görüntü yığınlarının bir projeksiyonu. PV hücresinin ifadesi bir hücre gövdesi üzerinde açık immüno-sinyali ve proksimal dendrit verdi imüno etiketleme doğrulanmıştır kaydedilir ve biocytin etiketli hücre (Şekil 5B). Hücrenin üç boyutlu rekonstrüksiyon FIJI yazılımı (Şekil 5C) 17 Basit Neurite Tracer eklentisi kullanarak dikişli görüntü yığınlarının arasından yapıldı. Akson ve str yakın teminatların yüksek bir yoğunluğa gösterdi. pyramidale ile ve# 8220; varsayımsal bir M.Ö. bu hücreyi tanımlayan, CA1 PC'ler (Şekil 5A, ek) somata etrafında oluşan sepetler ". Ayrıca, soma lokalizasyonu yakın str. pyramidale ve CA1 tüm katmanlarını kapsayan radyal odaklı dentritler FS Faydalanıcı Ülkenin 10 tipik morfolojik özelliği iyi gelmektedir.
Özetle, tanımlanmış FS + PV BCS elde edilen bütün hücre kayıtları, bu hücreler büyük genlik GABAB R aracılı yavaş iPSCs ifade etmesi ve sinaptik çıkışı da belirgin bir şekilde, presinaptik GABAB Rs aktive edilmesi sonucu inhibe olduğunu göstermiştir.
Akut hipokampal dilim Şekil 1. hazırlanması. (A) taze disseke sıçan beyin. Sürdürmek, beyni çevreleyen buz Not0 ° C'ye yakın tüm beyin sıcaklığı. (B), bir Leica VT1200s vibratome üzerinde 300 um hipokampal dilimler kesme. Hemisfer kortikal yüzeyi ilk kesilir, böylece hizalanır. Yarısının ve beyin dilimleri kestikten sonra buzlu ACSF (ok). (C) sabit carbogenation çevredeki çamurlu buz büyük miktarda Not ısındı sakaroz-ACSF taşınır. Dilimler üzerinde döndü ve sadece hipokampus ve örten korteks bırakarak, ön beyin ve Ortabeyin çıkarmak için kesilmiş edildi.
Internöronları Şekil 2. Tüm hücre patch-kelepçe kayıt. (A) odasının etrafında kayıt yapılandırması. Giriş ve çıkış laminer akışa yakın bir bölmenin elde edilmesi için karşılıklı yanları üzerinde olduğuna dikkat edin. Ayrıca, görünür olan recordielektrot ng headstages üzerine monte edilir ve iki yanı üzerinde toprak elektrodları, hem de amacı, orta (40X, su-immersiyon). (B) vGAT-Venüs / YFP sinyalin düşük-enerji epifluorescent Resim Bir dilim hipokampusun CA1. aynı bölgede (C) IR DIC görüntüleme. B ve C okları hücre gövdesi katmanındaki bir Venüs / YFP pozitif interneuron göstermektedir. (B) panel B belirtilen nöronun soma Yüksek güç IR DIC görsel üzerindeki çukur oluşturan yaklaşan bir yama pipet Bir test voltaj çizgi tepkiler ile kayıt bir tam hücre patch-kelepçe (sol taraf) kurulmasına da aşamalarının ardından yüzey (üst) ve, tam hücre konfigürasyonu (alt) hücre. (E) şematik gösterimi Pipet ucu (sağ taraf) ile pulse direncinin görüntülenmesi. Üst sıra: uzak hücreden banyosunda Pipet; Üst orta: iğneler çökelti oluşumu, bir eşlikdarbe genlik azalma, direnç ılımlı bir artış göstermektedir. Alt orta: Giga-ohm mühür oluşumu. Mevcut darbe genlik önemli ölçüde kısalır. Sadece hızlı kapasitif akımlar pipet kapasitans telafi önce nabız başında ve sonunda görebilir. Alt: Tüm hücre kayıt konfigürasyonu pipet altında membran yama kırarak elde edilir. Başında ve seri direnç tazminat önce darbe sonunda büyük ama nispeten yavaş kapasitif akımlar uygulanır unutmayın. (F) hiper bir aile tarafından ortaya bir FS-IN (üst) ve CA1 PC (alt) Temsilcisi izleri, - Depolarizan akım darbelerinin (protokol yukarıda gösterilen). CA1 PC'nin çok daha yavaş ateş ile karşılaştırıldığında FS-IN çok yüksek frekanslı deşarj edin. Sağdaki Insets: CA1 PC (üst) ve (siyah PC AP üzerine yerleştirilmiş alt, gri,) FS-IN gelen AP dalga karşılaştırılması, di gösterenAP ve AHP dalgaformunda fference.
Şekil 3. Farmakolojik bileşik sinaptik yanıtın diseksiyonu, bir FS-IN yavaş GABA B R-aracılı iPSCs izole. Str sınırında yer kayıt elektrodu (Patch) ile kayıt odasında dilim (A) IR-DIC görüntü. oriens (Ori.) ve pyramidale (Pir.) ve str sınırında simülasyon elektrot (Buyar). radiatum (. Rad) ve lacunosum-moleculare (LM) (B) Sol:. kayıt yapılandırmasının şematik gösterimi. Sağ: hiper bir aile tarafından ortaya FS-IN süperempoze gerilim tepkileri akım enjeksiyon depolarize hücre dışı uyarıya yanıt olarak FS-IN kaydedilen (° C) Örnek izler.. En: BileşikSinaptik tepki tek bir uyarıcı (50 V yoğunluk, 0.1 msn süre) ile ortaya çıkarılan, normal ACSF üretti. Üst orta: DNQX (10 uM) ve d-AP-5 (50 uM) uygulanmasından sonra banyo monosinaptik IPSC yalıtılmıştır. Alt orta: hızlı monosinaptik iPSCs banyosuna gabazine ilavesi (10 uM), aşağıdaki engellenir. Alt: (200 Hz) 5 uyaranların bir tren banyoya KYİ'nin sonraki uygulama (5 mcM) (üst üste gri iz) tarafından engellenir IPSC (siyah iz) aracılı yavaş GABA B R ortaya koymaktadır.
Inhibitör sinaptik iletim presinaptik modülasyonu Şekil 4. Analizi bir birleştiğinde FS-IN ve CA1 PC çifti kayıt eşleştirilmiş. (A) Sol panel: iki kayıt pipetler IR-DIC görüntü sınırında <de FS-IN üzerine yamalı sola bir em> str. oriens (Ori.) ve pyramidale (Pir.) ve yakın str bir CA1 PC'ye yamalı doğru. radiatum (Rad.). Sağ paneli:. Kayıt yapılandırmasının şematik, akım darbelerinin bir ailenin FS-IN (solda) ve CA1 PC (sağ) temsilcisi gerilim yanıtları ile (B) presinaptik olarak ortaya APleri gösteren Temsilcisi izleri FS-IN (hakkı 5 uM) (üst) ve kontrol koşullarında CA1 PC kısa gecikme Üniter IPSC (alt) (solda eser miktarda), baklofen banyo uygulama (10 uM, orta) sonra ve CGP sonraki uygulamasını . CGP IPSC genlik neredeyse tam iyileşmeye neden ise baklofen,% 50 ~ tarafından IPSC genliği azalır unutmayın. Kontrol izleri taban üzerine olarak gösterilmektedir. IPSC genlik (C) Deney süresince LNCaP arsa baklofen ve CGP etkisini göstermektedir. IPSCs 10 saniye aralıklarla kaydedilmiştir.
Şekil 5. Görselleştirme, imar ve biocytin etiketli kaydedilmiş FS-MÖ immünositokimyasal kimlik. (A) konfokal mikroskop 20X amacı ile görüntülü bir FS-IN görüntüleri dikişli yığınlarının bir projeksiyon. Somata str sınırında yer almaktadır. radiatum (Rad.) ve pyramidale (Pir.) CA1 alanının akson çoğunluğu ve hücre gövdesi tabakasının etrafında bulunan iken, dendritler, radyal çalıştırın ve tüm katmanları yayılan arasında; Faydalanıcı için tipik olarak. Ölçek çubuğu: 100 mikron. Etrafında farazi CA1 PC somata (turuncu yıldız) oluşturan akson tipik sepetleri gösteren 20 kat yüksek büyütme projeksiyon,: Ankastre, sağ üst. Ölçek çubuğu:. 10 mikron (B) IN biocytin dolu hücre gövdesi (beyaz pseudocolour, alt panel, ok) (yeşil, üst panelde) PV için imünoreaktiviteyi gösterir. Ölçekçubuğu:. hücrenin 3-boyutlu yeniden 20 um (C), tahmin. Soma ve dendritler siyah ve akson kırmızı renkli. CA1 Katmanlar mavi tarif edilir. Kısaltmalar: Ori, str. oriens; Str, LM. lacunosum-moleculare. Ölçek çubuğu: 100 mikron.
| İsim | Kompozisyon (mM) | Kullanım | Notlar |
| Sakkaroz-ACSF | 87 NaCI, NaHCO3, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 glukoz, 75 sukroz, 7 MgCl2, 0.5 CaCl2, 1, Na-piruvat, 1 Na askorbat 2.5 KCI, 25 | Hazırlık ve beyin dilimleri depolama | pH = 7.4; osmolarite = ~ 350 mOsm |
| Kayıt ACSF | NaHCO3, 1.25 NaH 2 PO 4, 25 glukoz, 1 MgCI 125 NaCl, 2.5 KCl, 25 | Beyin dilimleri kayıt | pH = 7.4; ozmolaritenin = 310-315 mOsm |
| Hücre-içi solüsyon (1) | 125 K-glukonat, 10 KCI, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 MgCl2, • 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin ve% 0.1 biocytin | GABAb IPSC kayıtların elektrotlar Dolum | pH = 7.4; ozmolaritenin = 295-305 mOsm |
| Hücre-içi solüsyon (2) | 105 K-glukonat, 40 KCI, 10 HEPES, 0.1 EGTA, 2 MgCl2, • 2 Na-ATP, 0.3 Na-GTP, 1 Na-fosfokreatin ve% 0.1 biocytin | Eşleştirilmiş kayıtları için elektrotlar Dolum | pH = 7.4; ozmolaritenin = 295-305 mOsm |
| Fosfat tamponu (PB) | 100 mM NaH 2 PO 4 | Sabit dilimleri Durulama | pH = 7.4 |
| Fosfat tamponlu tuz (PBS) | 25 mM NaH 2 PO 4 </ Sub> 154 mM NaCl (% 0.9 a / h) | Sabit dilimleri ve antikor inkübasyon durulama | pH = 7.4 |
| Paraformaldehid sabitleme maddesi | % 4 ağ / Paraformaldehit, 0.1 mM PB h | Beyin dilimleri Fixation | pH = 7.4 |
Tablo 1. Çözümler listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz işlevsel in vitro morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan nöronlar karakterize etmek elektrofizyolojik ve Nöroanatomik tekniklerini birleştiren bir yöntem tarif; Özellikle kortikal inhibitör ins çeşitli türleri. Prosedürün önemli yönleri vardır: Potansiyel ins (1) ön seçim; (2) hücre içi kayıt ve nöron görselleştirme; ve nihayet (3) Kaydedilen INS morfolojik ve immünositokimyasal analizi. Bu çalışmada özellikle PV bileşenler ele olmasına rağmen, tarif edilen protokol minimal değişiklik herhangi interneuron veya başka nöronal tiplerin, benzer bir kayıt için kullanılabilir.
Kortekste internöron nispeten az sayıda son derece verimsiz bu hücrelerden rastgele seçilmiş ve kayıtlarının tutulmasını mümkün kılar. Iraksak yerelleştirme ve morfolojik özellikleri ayırt ve rutin bazı interneuron türleri kayıt etmesini sağlamıştır. Stajyer Ancak dilimleri, kimlikve hücre beden katmanlarının yakın eurons gibi FS-ins gibi, zor kalır. Belirli interneuron popülasyonlarda floresan proteinleri eksprese eden transjenik fare hatları çıkışı, 2 çok daha verimli bu nöronların ön seçim ve kayıt yapan zarif bir çözüm sunar. Şimdi birçok transgenik hatları, çoğunlukla farenin, ama giderek de sıçanlar 13 internöronlar soruşturma kolaylaştırılması mevcuttur. Transgenik hatları kullanıldığında, ancak kapsamını ve raportör ifade spesifikliğini belirlemek için gereklidir.
Hücresel etiketleme ve morfoloji gibi elektrofizyolojik kayıt kalitesi, kritik yüksek kaliteli, geçerli dilimleri bağlıdır; bunun için beyin hızla (ideal olarak 20-40 saniye) ayrılmış çok dikkatli bir şekilde ve sürekli olarak soğutulmuş ele alınması gerekir. Bu bulmak genel sodyum konsantrasyon ve böylece nöronların uyarılma yeteneği, tiyatro de azaldığı kabul edilir sakkaroz ACSF kullanımıdırolarak an- dilimleri ve hayatta kalma interneuron 18 kalitesini artırır. Ancak, birçok araştırmacı büyük etkisi 10,11,15 için dilim hazırlanması için standart kayıt ACSF, kullanımı yaptık vurgulanmış olmalıdır. Morfolojik bütünlük dilimler 13 kesilir hangi açısına büyük ölçüde bağlıdır; hangi bölge ve hücre tipine göre değişir. Ancak, pek çok ara nöronlar güvenilir enine koronal ve sajital kesitlerden kaydedilebilir. Daha dendritler ve akson, derin dokuda hücreler IR-DIC kaliteli ve giga-ohm mühür oluşumu güvenilirlikten ödün olsa, hedef olmalıdır kopmasının en aza indirmek için. CA1 piramidal hücreleri ve hem de bu koşullar kayıtları altında FS-INs güvenilir bir şekilde elde edilebilir.
Etiketleme ve nöronların görselleştirme 30 dakika veya daha uzun süren tipik kayıt oturumu takip başarılabilir. Kayıtlar en az 30 dakika sürecek, bu biyo etkinleştirmek için tespitin önce bu kez izin için gerekli olancytin tam dolum ve hücrelerin bu nedenle post-hoc görselleştirme garanti, uzak dendritik ve aksonal süreçleri içine yayılması.
Bütün hücre kayıtları olarak, düşük ve kararlı bir dizi dirençleri muhafaza sinaptik ve kendine özgü özelliklerine doğru fizyolojik ölçüm yanı sıra, sinir hücrelerinin tam etiketlenmesi için zorunludur. Bununla birlikte, düşük direnç elektrodlar pipet içinde bulunan hücre içi çözelti ile sitoplazma hızlı diyaliz sağlar. ATP ile hücre içi bir çözüm tamamlayan, GTP ve fosfokreatin kesinlikle enerji kaynakları ve kayıt kalitesini korumak için yardımcı olur. Ancak, nörokimyasalların ve protein diyaliz, azalmış tepkilere yol plastisite 19 azaltılmış ve ayrıca nörokimyasal kimlik engelleyebilir yapabilirsiniz. Örneğin, PV sürekli uzun deneyler boyunca nöronların yıkanır. Bu nedenle, uzak, dentritik ya da aksonal süreçlerin incelenmesi deterjanları gerekebilir Kaydedilen nöron rmine immünoreaktivitesi. Diyaliz bir husustur Bu durumda, hücre içi ortamı 20 korumak için kullanılabilir delikli yama konfigürasyonu kullanılarak kayıtlar Ancak yama kayıtların bittiği ya da daha sonra bütün hücre konfigürasyonunda "repatched" nörona kırılmalıdır biocytin doldurulması sağlanır.
Kaydedilen nöronların Farmakolojik soruşturma ins içsel ve sinaptik aktivite şekillenmesinde farklı nöromodülasyonundaki mekanizmaların işlevsel önemini değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir. Yukarıda tarif edilen yöntemlerde, farmakolojik izolasyon ve çift ölçümler sırasıyla, son ve presinaptik GABAB R aracılı etkilerinin değerlendirilmesi için kullanılır; Bununla birlikte kolayca örnek olarak, kanabinoid sistemi 21 için alternatif reseptör ailesinin rolünü değerlendirmek için reseptör agonistleri ve antagonistlerinin kombinasyonu değiştirebilir.
"> Histolojik ve kaydedilen hücrelerinin immünositokimyasal işleme protokolleri kurulmuştur kez. Burada açıklanan immünsitokimya protokol nörokimyasal içeriğini tanımlamak için kullanılan antikorların kombinasyonu bakımından, dilim kalınlığı ve gereksinimi ile ayarlanan olmuştur, son derece güvenilir. Biz normal keçi serumu kullanmak Kullanılan tüm ikincil antikorlar keçi içinde üretilmiş gibidir. alternatifler olarak, bloke edici maddeler olarak sığır serum albümini (BSA) veya süt tozu kullanmak da mümkündür. bu protokol antikor inkübasyon için fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullandığı not edilmelidir, Bununla birlikte alternatif olarak bir sade PBS yerine 0.1 M PB kullanabilir. deterjan nispeten yüksek bir konsantrasyonda kullanılması (% 0.3 Triton X-100) dilim ilk 100 um yüzey tabakası içine nüfuz antikorların izin verirken, belirgin antijenite azaltmamaktadır , nöronlar rutin derindeki hücreler kaydedilirse. kaydedilen veya dilimler kalın nerede, bu resecti tavsiye edilirdilimleri üzerinde, bir kriyostat veya vibratome kullanarak ve ince (40-70 mikron) bölümlerinde immünoyaftalama gerçekleştirin. 300 um dilimleri için, antikorlar çok uzun bir kuluçka (4 ° C'de dilimlerin yapısal bütünlüğünü korumak için) son derece güvenilir imüno sonuçlar üretir.Nöronların tanımlanması kayıt, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler de elde edilen birleşik bilgiye dayanır. Hipokampus nedeniyle sıkı laminer örgüt, aksonal dağıtım internöronlar postsinaptik hedeflerin iyi bir göstergedir. Akson ya da dentritler kesti, ancak, tanımlama zor veya imkansız hale getirebilir. Ayrıca, bazı belirsizlik genel aksonal lokalizasyonu nedeniyle benzerlik PV + BCs ve axo-axonic internöronlardan, ayırt örneğin, kalır. Son bir kesin belirleme postsinaptik hedeflerin 1,3 o elektron mikroskobik analizini gerektirirdaha immünositokimyasal diseksiyon 22 r.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar onu mükemmel teknik yardım için Ina Wolter teşekkür etmek istiyorum. VGAT Venüs transgenik fareler Dr ile oluşturulmuştur. Dr A. Miyawaki tarafından sağlanan pCS2-Venüs kullanarak Y. Yanagawa, M. Hirabayashi ve Milli Fizyolojik Bilimler Enstitüsü, Okazaki, Japonya Y. Kawaguchi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
