Summary
Redes corticais são controlados por um conjunto de pequenos, mas diversificada de interneurónios inibitórios. Investigação funcional dos interneurônios, portanto, requer a gravação específica e rigorosa identificação. Descrito aqui é uma abordagem conjunta, envolvendo gravações de células inteiras de pares simples ou synaptically acoplados de neurônios com rotulagem intracelular, post-hoc Análise morfológica e imunocitoquímica.
Abstract
GABAérgicos interneurónios inibitórios desempenham um papel central em circuitos neuronais do cérebro. Interneurônios compreendem um pequeno subconjunto da população neuronal (10-20%), mas mostram um alto nível de heterogeneidade fisiológica, morfológica e neuroquímica, refletindo suas diversas funções. Portanto, a investigação de interneurônios fornece importantes insights sobre os princípios de organização e função dos circuitos neuronais. Isso, no entanto, requer uma abordagem fisiológica e neuroanatomical integrada para a seleção e identificação dos tipos interneuron individuais. Whole-cell patch-clamp gravação de fatias cerebrais agudos de animais transgénicos, que expressam proteínas fluorescentes sob os promotores de marcadores específicos de Interneuron, fornece um método eficiente para alvejar e electrofisiologicamente caracterizar as propriedades intrínsecas e sinápticos dos tipos Interneuron específicos. Combinado com marcação com corante intracelular, esta abordagem pode ser estendida com post-hoc moanálise rphological e imunocitoquímica, permitindo a identificação sistemática dos neurônios registrados. Estes métodos podem ser adaptados para atender uma ampla gama de questões científicas a respeito propriedades funcionais de diversos tipos de neurônios corticais.
Introduction
Circuitos neuronais do hipocampo têm sido objecto de intenso escrutínio, no que diz respeito a ambos anatomia e fisiologia, devido ao seu papel essencial na aprendizagem e na memória, bem como navegação espacial em humanos e roedores. De igual modo, o proeminente, mas simples organização laminar do hipocampo torna esta região um objecto preferido de estudos sobre as propriedades estruturais e funcionais das redes corticais.
Circuitos do hipocampo são constituídos por células excitatórias principais (> 80%) e um menor (10-20%), mas coorte altamente diversificada de interneurónios inibitórios 1-3. Interneurônios libertar ácido γ-aminobutírico (GABA) a partir dos seus terminais de axónios, que actua em receptores ionotrópicos rápido GABA A (GABAA Rs) e receptores de GABA B metabotrópicos lentas (Rs GABA B) 4. Estes mecanismos inibidores contrabalançar excitação e regular a excitabilidade de células principais, e, assim, otempo ir e padrão de descarga. No entanto, o GABA libertado interneurónios actua não só em células principais, mas também nos próprios 5,6 interneurónios. Receptores pré e pós-sinápticos mediar regulação por feedback e interações mútuas inibitórios entre os vários tipos de interneuron. Estes mecanismos inibitórios em redes interneuron se acredita serem fundamentais para a geração e formação de padrões de atividade da população, em especial as oscilações em diferentes freqüências 7.
De célula inteira gravação patch-clamp é um método bem estabelecido para o exame das propriedades intrínsecas e interações sinápticas de neurônios. No entanto, devido à grande diversidade de tipos de Interneuron, investigação de interneurónios inibitórios requer rigorosa identificação das células gravadas. Como tipos interneuron hipocampo são características distintas morfológicas e neuroquímicas expressão do marcador, anatômico combinado e imunocitoquímica eXAME pode fornecer um meio para determinar preciso 6,8,9 identidade interneuron.
No presente trabalho, descrevemos uma abordagem experimental em que de célula inteira gravações de patch-clamp de neurônios individuais ou pares synaptically acoplados são combinados com rotulagem intracelular, seguido pelo post-hoc análise morfológica e imunocitoquímica, permitindo a caracterização de lento GABA B mediada pelo receptor efeitos inibitórios em interneurónios identificados. Como exemplo, vamos nos concentrar em um tipo principal de interneuron, um subconjunto das chamadas "células cesta" (BC), que inerva o Soma e proximal dendritos de suas metas pós-sinápticos e é caracterizada por um "spiking rápido" (FS) descarregar padrão, um axónio densamente cobrindo a camada de corpo celular e a expressão da proteína de ligação a parvalbumina de cálcio (PV) 10,11. Esses interneurônios exibir grandes correntes inibitórios pós-sinápticos, bem como pré destaquemodulação sináptica da sua saída sináptica, em resposta ao GABA B R activação 12. A combinação das técnicas aqui descritas podem ser aplicadas igualmente bem para investigar mecanismos intrínsecos ou sinápticas em uma variedade de outros tipos de neurónios identificados.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos e manutenção de animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais, a lei alemã Bem-Estar Animal, o Conselho Europeu a Directiva 86/609 / CEE do Conselho relativa à protecção dos animais, e as orientações das autoridades locais (Berlim, T-0215/11 )
1 Preparação de fatias Agudo-hipocampo
- Tome um rato transgênico (17 a 24 dias de idade), expressando a proteína fluorescente Venus / YFP sob o promotor vGAT, que rotula a maioria dos interneurônios inibitórios corticais 13. Decapitar os ratos. Dissecar o cérebro rapidamente (<40 segundos) em semifrozen, carbogenated (95% de O2 / 5% de CO 2) à base de sacarose líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF-sacarose, Figura 1A).
- Avaliar o cérebro de rato dissecado por Vénus / YFP fluorescência com uma lâmpada de 505 nm e um filtro de emissão de LED 515, montado sobre um par de óculos.
- Remover o terceiro frontal do córtex e Cerebellum; em seguida, separar os hemisférios, todos com um bisturi. Retirar a superfície dorsal do córtex para proporcionar uma superfície plana para colar o cérebro para baixo, como previamente descrito 14.
- Cortar fatias transversais (300 um) da formação do hipocampo de um vibratome, os hemisférios deve ser cercado com semifrozen, carbogenated sacarose-ACSF (Figura 1B) 14. Remover regiões adicionais de rostral do córtex, mesencéfalo e tronco cerebral. Transferir cada fatia de uma câmara de retenção submersos contendo sacarose-ACSF, que é carbogenated e aquecida a 35 ° C.
- Deixe as fatias de recuperar a 35 ° C por 30 min a partir do momento da última fatia de entrar no ACSF aquecido. Faça isso a fim de reativar os processos metabólicos e facilitar a relacração de processos neuronais cortadas. Em seguida, a transferência para a temperatura ambiente durante o armazenamento (Figura 1C).
2 Fabricação e Enchimento de gravação pipetas
- Pupipetas remendo ll de capilares de vidro, de modo que uma resistência de 2-4 mohms pipeta é conseguido quando cheio com filtrada (filtro de seringa, tamanho de poro: 0,2 um) uma solução intracelular contendo 0,1% de biocitina (para marcação intracelular). Manter a solução intracelular arrefecidas em gelo para evitar a degradação dos seus constituintes.
- Encha pipetas remendo para identificação de correntes pós-sinápticos com uma solução contendo um baixo Cl fisiologicamente relevante - concentração (E R (Cl) = -61 mV; ver lista solução).
- Para gravações emparelhados para identificar as respostas mediadas pelo receptor pré-sináptico, preencha pipetas de patch com a solução intracelular com baixo Ca 2 + capacidade tampão para evitar a interferência com a liberação do transmissor pré-sináptica, bem como quatro vezes maior Cl - concentração (E R (Cl) = -20 mV) para melhorar a relação sinal-ruído de IPSCs observados 5, permitindo a avaliação precisa de resp farmacológicoonsiveness. Note que a alteração Cl - concentração pode alterar a cinética da IPSC 15.
3. Whole Cell Gravação patch-clamp de FS-ins
- Carbogenate ACSF e alimentar através do sistema de perfusão à câmara de gravação, por meio de uma bomba peristáltica (que também remove o ACSF da câmara de registo através de uma linha de sucção, a Figura 2A). Ligue todos os equipamentos da instalação, em preparação para a gravação.
- Transferir uma fatia para a câmara de gravação e fixe com um anel de platina amarrado com fibras individuais de seda. Posicionar a fatia de modo a que o estrato piramidal (str.) De CA1 corre verticalmente através do campo de visão, que permite o acesso com duas pipetas de tanto o str. radiatum e str. oriens simultaneamente (Figuras 2C e 4A).
- Coloque a câmara para a instalação e começar a perfusão de carbogenated e aquecida (32-34 ° C) a gravação de umCSF a um caudal de 5-10 ml / min.
- Avalie a qualidade fatia sob a ótica IR-DIC em 40X objetivo, e visualize com uma câmera CCD visualizado em um display. Assuma boa qualidade fatia se um grande número de células contrastadas, moderadamente piramidais CA1 redondas (CA1 PC) pode ser visto em str. pyramidale em profundidades de 20-30 mM abaixo uma superfície lisa e levemente crateras (Figura 2C). Fatias de má qualidade contêm um grande número de alto contraste, as células encolhidas ou inchados, com uma superfície de corte irregular.
- Identificar FS putativos interneurônios sob iluminação de epifluorescência como aqueles que expressam Venus / YFP (Figura 2B), com grande somata multipolar dentro ou perto do str. pyramidale. Selecione as células razoavelmente profunda dentro da fatia (50-100 um, Figura 2C), a fim de melhor preservar a sua integridade morfológica.
- Monte o eletrodo de registro no suporte da pipeta sobre a headstage; então apply uma baixa pressão, positivo (20-30 mbar) através da linha de tubos. Diminuir a pipeta para a superfície da fatia, ligeiramente deslocada para o centro do neurónio seleccionado.
- Obter configuração de gravação de células inteiras, como descrito anteriormente 14,16 e ver também Figuras 2D e 2E:
- Alvo de um celular: Aumenta a pressão para 70-80 mbar e reduzir rapidamente a pipeta através da fatia um pouco acima da soma da célula selecionada (Figura 2D, em cima).
- Aproxime-se da célula: Pressione a pipeta contra a membrana da célula para produzir uma "covinha" sobre ele (Figura 2D, em cima). Executar este passo rapidamente, a fim de evitar a rotulagem biocitina de células vizinhas.
- Criar um selo giga-ohm: Solte a pressão e, simultaneamente, aplicar um comando de tensão 20 mV para a pipeta. Um selo giga-ohm (1-50 GÊ; Figura 2D, fundo e figura 2E meio) Neossoloaliado desenvolve rapidamente. Uma vez selado, aplicar o potencial de repouso da membrana esperado (tipicamente entre -70 e -60 mV) como um comando de tensão.
- Romper o patch: Uma vez fechado, romper o remendo de membrana com um curto pulso de pressão negativa; conseguindo assim a configuração de célula inteira (Figura 2E, parte inferior).
- Compensar capacitância de célula inteira e resistência em série (R S). R s é normalmente 5-20 mohms e estável por até 120 min. Abandonar as células se o potencial de membrana (V M) em break-through é mais despolarizada que -50 mV; R S é inicialmente maior do que 30 mohms; ou R S alterações por mais de 20% ao longo da gravação.
- Identificar FS-ins por sua resposta (no modo atual-clamp) para uma família de hiper a despolarização pulsos de corrente (-250 a +250 pA, figura 2F, em cima). FS-ins têm relativamente despolarizado V M (tipicamente -50 to -60 mV), o curto tempo de membrana constante (<20 ms) e responder a uma 500 pA despolarizante de injecção de corrente, com um trem de potenciais de acção (AP) a frequências> 100 Hz 11 (Figura 2F, fundo), que são marcadamente diferentes daqueles em PCs CA1 (Figura 2F, no meio).
4. Extracelular Estimulação Elétrica para evocar respostas GABA B R-mediadas
- Para observar as respostas synaptically evocados, posicionar um eletrodo extracelular estimulação (uma pipeta de patch cheio de 2 M NaCl; Resistance: 0,1-0,3 mohms) na fatia na fronteira de str. radiatum e str. lacunosum-moleculare. Posicione o eletrodo de 200-300 mM lateral à soma para evitar a estimulação elétrica direta do celular e minimizar artefatos de estimulação (Figura 3A).
- Uma vez que o eléctrodo de estimulação está posicionado, obter gravação de células inteiras dea célula e escolhido avaliar o fenótipo fisiológico no modo de corrente grampo como na secção 3.9 (Figura 3B).
- Com o neurônio registrado em tensão-clamp (V M -65 mV), entregar a estimulação elétrica de axônios pré-sinápticos a 50 V (~ 500 uA estímulo eficaz) a cada 20 segundos, utilizando um isolado de tensão constante estimulador. Use único estímulos (100 ms de duração, Figura 3C, em cima) para observar GABA B R IPSCs mediadas, e intercalar com os trens de múltiplos estímulos (a 200 Hz) para produzir uma maior liberação do transmissor.
- Banheira aplicar antagonistas dos receptores ionotrópicos do glutamato (receptores de AMPA: DNQX [10 mM]; receptor de NMDA: d-AP5 [50 uM]) para revelar o isolado monossináptico IPSC (Figura 3C, média superior). Além disso isolar o IPSC GABA B R-mediada com a aplicação de um bloqueador de GABA A R (gabazine [10 mM]; Figura 3C meio lower).
- Confirme a resultante slow-corrente para o exterior (Figura 3C inferior, expandido) como sendo GABA B R-mediada pela posterior aplicação de CGP-55.845 [5 mM] (Figura 3C inferior, sustentada em cinza)
5. emparelhados Gravações de synaptically acopladas FS-IN e PCs CA1
- Avaliar o controle pré-sináptica GABA B R-mediada da transmissão sináptica inibitória com gravações simultâneas, realizadas entre synaptically-acoplados em pares e PC, conforme descrito abaixo.
- Em primeiro lugar, estabelecer uma gravação de células inteiras de um interneuron pré-sináptico (como na seção 3) e confirmar o fenótipo FS (Figura 4A).
- Então remendar um vizinho CA1 PC (20-100 distância um, Figura 4A) e aplicar breve suprathreshold despolarização pulsos de corrente (1 ms de duração, 1-5 nA amplitude) para a pré-sináptico IN (realizada em modo atual-clamp) para provocar APs. Se um co sinápticannection está presente, APs no resultado da IN em IPSCs no CA1 PC, realizado em tensão-clamp (compensar R S a cerca de 80%).
- Se necessário, preencher um novo eletrodo de registro e registro de novos PCs CA1 até que uma conexão é encontrada.
- Uma vez que uma conexão é estabelecida, obter pares de APs na pré-sináptico FS-IN para avaliar tanto a resposta sináptica unitário e comportamento dinâmico. Usar um protocolo típico de dois estímulos despolarizantes emparelhado-pulso com um intervalo de 50 ms (Figura 4B).
- Coletar vestígios de controle em condições basais. Em seguida, aplicam-se as de GABA B baclofeno R agonistas selectivos (10 uM) para o ACSF de perfusão, activando assim Rs GABA B, seguido por o antagonista CGP-55845 (5 uM), para bloquear completamente os efeitos mediados pelo receptor. Recolhe ~ 50 traços durante o estado estacionário para cada condição da droga (Figura 4B e C).
- Uma vez que a gravação for concluída, selar a membrana somática, formando uma outside-out patch: Lentamente retirar a pipeta do corpo celular em V-clamp e como os R S aumenta, reduzir a V M a -40 mV. Fazê-lo para facilitar a formação do penso fora para fora; em seguida, retire a pipeta da banheira.
6 Análise de propriedades eletrofisiológicas
- NOTA: Uma multidão de diferentes pacotes de software estão disponíveis para a aquisição de dados eletrofisiológicos. Aqui, WinWCP, um programa do Windows no pacote de Strathclyde Eletrofisiologia Software livre é usado, que permite a gravação de até 16 canais de entrada analógica e saída de 10 sinais digitais.
- Filtro passa-baixa todos os dados 5-10 kHz e amostra a 20 kHz.
- Analisar dados fisiológicos com uma suíte de análise off-line.
NOTA: Stimfit, um pacote de software de fonte aberta, que inclui um shell Python, é usado neste caso; no entanto outras alternativas podem ser facilmente usados em seu lugar.- Analisar passiva membrana pROPRIEDADES de neurônios registrados, adquiridas em pinça de corrente, de potencial de repouso da membrana.
- Medir o potencial de membrana em repouso média da linha de base de respostas registados a partir do início da gravação.
- Calcule a resistência de entrada, usando a lei de Ohm, a partir da resposta de tensão para os mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes (≤ -50 PA). Para melhorar a relação sinal-ruído, vários traços médios. Nota: os exemplos são tipicamente médias de 10-50 varreduras individuais.
- Estime o tempo membrana aparente constante ajustando uma curva monoexponencial para a decadência das respostas aos mais pequenos pulsos de corrente hiperpolarizantes.
- Analisar potencial de ação de forma de onda para determinar o limiar, amplitude (limite de pico) e duração (largura medida a meia altura) provocada por nível de limiar de despolarização pulsos de corrente.
- Analise GABA B R IPSCs mediadas de gravações de fixação de tensão. Filtrar traça off-line em500 Hz (filtro de Gauss) e avaliar a amplitude do pico e latência da resposta mediada por GABA B R (em médias de pelo menos 10 traços).
- Detectar o efeito de Rs GABAB na saída inibidora de Ins como uma alteração na amplitude de pico dos IPSCs GABA A R-mediadas medidos entre pico e de linha de base anterior. Calcule a amplitude média de ≥50 vestígios para o período de controle eo estado de equilíbrio de todas as épocas farmacológicos.
7 Visualização e Imunocitoquímica de FS-Ins
- Após as gravações, fixar as fatias por imersão em paraformaldeído a 4% com tampão fosfato 0,1 M (PB, pH = 7,35) S / N a 4 ° C.
- Se fatias necessários podem ser transferidos para PB e armazenados durante ~ 1 semana antes da transformação.
- Fatias Lavar abundantemente em PB fresco e, posteriormente, em 0.025 M PB com NaCl 0,9% (PBS, pH = 7,35).
- Para reduzir o anticorpo não-específico de ligação, bloquear as fatias for 1 hora à temperatura ambiente numa solução contendo 10% de soro de cabra normal (NGS), 0,3% de Triton-X100 (um detergente para permeabilizar as membranas) e 0,05% de NaN 3, fez-se em PBS.
- Para etiquetar para expressão PV, utilizar um anticorpo anti-PV monoclonal de ratinho diluído em uma solução contendo 5% de NGS, 0,3% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, em PBS. Incubar anticorpos primários durante 2-3 dias a 4 ° C 12. Lavar cuidadosamente as fatias em PBS.
- Aplicar anticorpos fluorescentes anti-ratinho secundário (por exemplo, AlexaFluor-546.) Juntamente com a biotina estreptavidina-proteína de ligação, conjugado com um fluorocromo (por exemplo, AlexaFluor-647); e incuba-se uma solução contendo 3% de NGS, 0,1% de Triton-X100, 0,05% NaN 3, diluído em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
- Liberalmente lavar fatias 2-3x com PBS, seguido por 2-3 lavagens em PB. Monte as fatias em lâminas de vidro. Usar um 300 um espaçador ágar para evitar o corte entre em colapso. Fatias Cover-derrapante com um FLUOREScento de montagem médio e vedação com unhas verniz.
8 Imagem e Reconstrução de Visualized FS-Ins
- Visualize as fatias utilizando um microscópio confocal de varredura, com o repórter fluorochome animado com a linha de laser apropriado (laser de diodo 635 nm para AlexaFluor-647; Hélio-Neon 543 nm para AlexaFluor-546 rotulagem para PV e Argon 488 ou 515 nm para Venus / YFP).
- Tome imagens numa resolução Z apropriado (tipicamente 0,5-1 uM passos, usando uma objectiva de 20X) para produzir uma-pilha Z de toda a célula. Múltiplas pilhas são normalmente necessários para a imagem de toda a célula, que pode ser digitalmente costurados fora da linha utilizando FIJI / software ImageJ (Figura 5A).
- Reconstruir a célula da pilha imagem montada utilizando um método de rastreamento semi-automática (plug-in simples Neurite Tracer no pacote de software FIJI / ImageJ 17, Figura C).
- Por fim, avaliar a PV-imunorreatividade do interneuron com uma lente objetiva de alta abertura numérica (60X silício-imersão, NA = 1.3). Fazer imagens da soma, dendritos proximais e axônio proximal, ou, alternativamente, de terminais do axônio se washout somática do PV é muito forte. As células são consideradas imunorreactivo para PV-se marcação imuno é visto para se alinhar com as estruturas marcadas com biocitina (Figura 5B).
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Representative Results
Desde que a qualidade é apreciável fatia boa, registrando tanto PCs CA1 e FS-ins podem ser alcançados com um mínimo de dificuldade. A linhagem de ratos transgênicos expressando Venus / YFP sob o promotor vGAT 13 não inequivocamente identificar FS-ins, ou de fato BCs. No entanto gravações de INs e em torno de str. piramidal, em que a densidade de FS-ins é tipicamente uma alta, resulta em um maior probabilidade de seleccionar FS-Ins (Figura 2B). FS-ins podem ser distinguidos por suas propriedades fisiológicas características diferentes das dos dois PCs CA1 e RS-ins. Eles têm uma membrana relativamente despolarizado potencial de repouso (-58,9 ± 1,5 mV, 15 células, contra -62,6 ± 1,1 mV em PCs CA1, 26 células), baixa resistência de entrada (92 ± 12 vs 103 ± mohms 14 mohms em PCs) rápido e constante de tempo membrana aparente (15,4 ± 2,6 vs 22,0 ± ms 2,7 ms em PCs), resulting em resposta rápida de tensão para hiperpolarizando pulsos de corrente (Figura 2F). FS-ins descarregada potenciais de ação muito breves (0,38 ± 0,01 ms) de relativamente baixa amplitude (82,8 ± 1,0 mV), seguido de muito proeminente afterhyperpolarization rápido (média de 22,6 ± 2,9 amplitude mV). Em resposta a pulsos de corrente grande de despolarização (250 Pa), FS-ins demitido em altas freqüências (82 ± 10 Hz; Range: 34-128 Hz; Figura 2D, à esquerda).
Para avaliar GABA B correntes pós-sinápticas mediada por R em FS-ins, as respostas sinápticas farmacologicamente isoladas foram provocadas pela estimulação extracelular de fibras inibidoras no str. radiatum / lacunosum-moleculare fronteira. Figura 3 mostra um exemplo de um FS-IN, em que o bloqueio sequencial dos componentes da resposta sináptica isola o composto monossináptico GABA B mediada por R lenta IPSC. Respostas sinápticas foram elicitado por estímulos individuais ou trens de 3-5 estímulos (50 intensidade V, 0,1 ms de duração, entregue a 200 Hz) para o str. lacunosum-moleculare / border radiatum (Figura 3A). A resposta inicial composto incluindo componentes tanto excitatórios e inibidores (Figura 3C, no topo) foi fortemente reduzida por aplicação de banho de antagonistas dos receptores NMDA e AMPA (DNQX, 10 uM e AP-5, 50 ^ M, respectivamente: Figura 3C, no meio). O residual monossináptico IPSC composto um início rápido para dentro atual (um dentro Cl putativo - atual Mediada na exploração potencial de -65 mV, com um potencial de reversão de aproximadamente -60 mV, nesses experimentos) e uma mais lenta corrente externa (mediada por um putativo condutância com uma inversão de potencial perto de 100 mV + K). Aplicação do GABA A R gabazine antagonista selectivo (SR-95531, 10 ^ M) aboliu o jejum de IPSC, deixando umisolaram o lento GABA B R-mediada IPSC (Figura 3C, inferior, traço preto); que foi observado em resposta à estimulação única, mas de forma mais clara em resposta a estímulos de comboios curtos. Esta resposta foi confirmada como um GABA B condutância de K + activadas por R, uma vez que foi bloqueada pela potente e selectivo antagonista CGP-55845 (CGP, 5 uM, Figura 3C, inferior, cinza de rastreio). FS BCs normalmente apresentam grandes IPSCs mediada por R amplitude GABA B, como mostrado na nossa recente publicação 12.
Para avaliar a regulação pré-sináptica da FS-IN saída inibitória por Rs GABA B, gravações pareadas foram realizadas a partir de PCs FS-IN e CA1 synaptically acoplados. Conectividade sináptica entre FS BCs e PCs CA1 é relativamente alto, como mostrado anteriormente 1,3. Nestes registros, como mostrado anteriormente, a probabilidade de acoplamento é mais de 50% entre os pares de células em locais próximos (≤50 m;
Uma vez que a gravação tinha sido completado, um remendo fora para fora formado com êxito, as fatias foram fixados durante a noite e subsequentemente processada para visualizar e analisar a morfologia das células gravadas e determinar o seu teor marcador neuroquímica. Figura 5A ilustra a morfologia de um representante FS BC em uma projeção de pilhas de imagens combinadas obtidas em um microscópio confocal. A expressão das células de PV foi confirmada na marcação imunocitoquímica que deram um sinal imuno-claro sobre o corpo celular e dendritos proximais do registado e célula-biocitina rotulado (Figura 5B). A reconstrução tridimensional da célula foi realizada a partir de pilhas de imagens costuradas usando o plugin do Simples Neurite Tracer em software FIJI (Figura 5C) 17. O axônio mostraram uma alta densidade de colaterais e está perto do str. pyramidale com &# 8220; cestas "formado em torno do somata de PCs CA1 (Figura 5A), inserir, supostamente identificar essa célula como um BC. Além disso, a localização do soma perto a str. pyramidale e os dendritos orientados radialmente, abrangendo todas as camadas da CA1 correspondem bem à característica morfológica típica da FS BCs 10.
Em resumo, nas gravações de células inteiras obtidos a partir PV FS identificado + BCs, temos demonstrado que estas células expressam grandes amplitude GABA B IPSCs lentos mediado-R e sua produção sináptico também é marcadamente inibida pela ativação de pré-sinápticos Rs GABA B.
Figura 1: Preparação de fatias de hipocampo agudas. (A) do cérebro de rato recém-dissecados. Note-se a gelo em torno do cérebro, mantendoa temperatura de todo o cérebro perto de 0 ° C. (B) de corte de fatias de hipocampo de 300 um sobre um vibratome Leica VT1200S. Os hemisférios são alinhados de modo que a superfície cortical é cortada em primeiro lugar. Observa-se grande quantidade de gelo em torno dos hemisférios lamacento e a carbogenation constante da ACSF gelado (seta). (C) Depois de cortar as fatias de cérebro são movidos para aqueceu-sacarose ACSF. As fatias foram virados e aparado para remover o cérebro anterior e do cérebro médio, deixando apenas o hipocampo e córtex sobrejacente.
Figura 2.-célula inteira de gravação de patch-clamp de interneurónios. (A) A configuração de gravação em torno da câmara. Note-se a entrada e saída estão em lados opostos da câmara a atingir um fim de fluxo laminar. Também são visíveis a recording de eléctrodos, montados nas headstages, e os eléctrodos de terra sobre os dois lados, bem como o objectivo de epifluorescência imagem de baixa potência do sinal vGAT-Vénus / YFP em (40X, de imersão em água) no meio. (B) CA1 do hipocampo em uma fatia. (C) imagem IR-DIC da mesma área. As setas em B e C indicam um interneuron positivo Venus / YFP na camada de corpo celular. (D) de alta potência imagens IR-DIC da soma do neurônio indicado no painel B, com uma pipeta de patch aproximando formar a covinha no superfície (em cima) e, subsequentemente, a célula na configuração de célula inteira (parte inferior). (E) Ilustração esquemática das principais etapas da criação de uma gravação de células inteiras de patch-clamp (lado esquerdo), com respostas de banda desenhada para uma voltagem de teste -Pulse monitorando a resistência na ponta da pipeta (lado direito). Linha superior: Pipeta no banho de fora da célula; Média superior: formação Dimple, acompanhado por umredução da amplitude de pulso, indicando um aumento moderado da resistência. Média baixa: formação de selo Giga-ohm. Note-se que a atual amplitude de pulso é drasticamente reduzido. Apenas as correntes capacitivas rápidos são visíveis no início e no final do impulso de pipeta antes capacitância é compensada. Resumindo: a configuração de gravação de célula inteira é conseguido através da ruptura do remendo de membrana sob a ponta da pipeta. Note-se que as grandes mas relativamente lenta correntes capacitivas, no início e no final do impulso de compensação antes da resistência em série é aplicada. (F) traços representativos de um FS-EM (topo) e CA1 PC (inferior), induzidos por uma família de hiper - a despolarização pulsos de corrente (protocolo mostrado acima). Observe a descarga muito alta freqüência do FS-IN em comparação com a queima muito mais lento do CA1 PC. Inserções à direita: Comparação da forma de onda AP do CA1 PC (em cima) ea FS-IN (parte inferior, na cor cinza, sobreposto ao PC AP em preto), ilustrando o diferença na forma de onda da AP e o AHP.
Figura 3. dissecção Farmacológica da resposta sináptica composto, isolando IPSCs mediada por R GABAB lentas num FS-EM. (A) imagem IR-DIC da fatia na câmara de gravação, com o eletrodo de registro (Patch) colocado na fronteira do str. oriens (Ori.) e pyramidale (Pyr.) eo eletrodo de simulação (Stim) na fronteira do str. radiatum (. Rad) e lacunosum-moleculare (LM) (B) À esquerda:. Ilustração esquemática da configuração da gravação. Direita: Sobreposta respostas de tensão na FS-IN desencadeados por uma família de hiper a despolarização injeções de corrente (C) traços representativos verificados a partir do FS-IN em resposta à estimulação extracelular.. Top: O compostoresposta sináptica produzido em ACSF normal, provocada por um único estímulo (intensidade 50 V, 0,1 ms de duração). Média alta: Isolado monossináptico IPSC após a aplicação de banho de DNQX (10 mM) e d-AP-5 (50 m). Média baixa: Os IPSCs monosinápticos rápidas é bloqueado após a adição de gabazine (10 mM) para o banho. Parte inferior: Um trem de 5 estímulos (a 200 Hz) revela um GABA B lenta R mediada IPSC (traço preto), que é bloqueada por aplicação subsequente de GFC (5 uM) ao banho (sobreposto traço cinzento).
Figura 4 Análise de modulação pré-sináptico da transmissão sináptica inibidora em uma gravação emparelhado a partir de um FS-EM e CA1 PC par acoplado. (A) Painel esquerdo: imagem IR-DIC das duas pipetas de gravação, o que restou corrigida para o FS-IN na fronteira do < em> str. oriens (Ori.) e pyramidale (Pyr.) eo direito remendado em um CA1 PC mais perto do str. radiatum (Rad.). Painel da direita:. Um esquemática da configuração de gravação, com respostas de tensão representativos da FS-EM (esquerda) e CA1 PC (direita) a uma família de impulsos de corrente (B) representativos traços que mostram os APs induzidos nas pré-sinápticos FS-IN (topo) e o IPSC curta latência unitária em CA1 PC (inferior), sob condições de controlo (traços da esquerda), após a aplicação do banho de baclofeno (10 ^ M, meio), e subsequente aplicação de CGP (5 uM, direita) . Note-se que o baclofen reduziram a amplitude de IPSC por ~ 50%, ao passo que o GFC resultou em uma recuperação praticamente completa da amplitude IPSC. Vestígios controle são mostradas sustentada. Claro plot (C) Tempo da amplitude IPSC mostra o efeito do baclofen e CGP. IPSCs foram registrados em intervalos de 10 segundos.
Figura 5 Visualization, reconstrução e identificação imunocitoquímica de um rótulo biocitina registrado FS-BC. (A) A projeção de pilhas costurados de imagens de um FS-IN fotografada com uma objetiva de 20x em um microscópio confocal. O somata está localizado na fronteira do str. radiatum (Rad.) e pyramidale (Pyr.) da área de CA1, os dendritos correr radialmente e abrangem todas as camadas, enquanto a maioria dos axônios é encontrado dentro e ao redor da camada de corpo celular; como típico para BCs. Barra de escala: 100 um. Inset, canto superior direito: projeção de alta ampliação de 20 camadas, mostrando cestos típicos de axônio formando em torno putativo CA1 PC somata (asteriscos laranja). Barra de escala:. 10 m (B) O corpo cheio de biocitina célula da IN (pseudocolour branco, painel inferior, seta) mostra imunorreatividade para PV (em verde, painel superior). Escalabar:. de 20 um (C) de projecção de 3 a reconstrução tridimensional da célula. A soma e dendritos são em preto e axônio de cor vermelha. Camadas de CA1 são delineadas a azul. Abreviaturas: Ori, str. oriens; LM, str. lacunosum-moleculare. Barra de escala: 100 um.
| Nome | Composição (mM) | Use | Notas |
| Sacarose-ACSF | 87 NaCl, 2,5 de KCl, 25 de NaHCO3, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glicose, sacarose 75, 7 de MgCl2, 0,5 de CaCl2, 1 Na-piruvato, 1 Na-ascorbato | Preparação e conservação das fatias de cérebro | pH = 7,4; osmolaridade = ~ 350 mOsm |
| Gravação ACSF | NaCl 125, KCl 2,5, NaHCO3 25, 1,25 NaH 2 PO 4, 25 glucose, 1 MgCl | Gravar a partir de fatias de cérebro | pH = 7,4; osmolaridade = 310-315 mOsm |
| Solução intracelular (1) | 125 K-gluconato, KCl 10, 10 HEPES, 10 EGTA, 2 de MgCl2, 2 de Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1-fosfato de Na e 0,1% de biocitina | Enchendo eletrodos de gravações GABAB IPSC | pH = 7,4; osmolaridade = 295-305 mOsm |
| Solução intracelular (2) | 105 K-gluconato, KCl 40, 10 de HEPES, 0,1 de EGTA, 2 de MgCl2, 2 de Na-ATP, 0,3 Na-GTP, 1-fosfato de Na e 0,1% de biocitina | Enchendo eletrodos para gravações emparelhados | pH = 7,4; osmolaridade = 295-305 mOsm |
| Tampão fosfato (PB) | 100 mM de NaH 2 PO 4 | Enxaguar fatias fixos | pH = 7,4 |
| Salina tamponada com fosfato (PBS) | 25 mM de NaH 2 PO 4 </ Sub>, NaCl 154 mM (0,9% w / v) | Enxaguar fatias fixos e anticorpo incubação | pH = 7,4 |
| Paraformaldeído fixador | 4% w / v de paraformaldeído, 0,1 mM de PB | Fixação de fatias do cérebro | pH = 7,4 |
Tabela lista 1. Solutions.
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Discussion
Nós descrevemos um método que combina técnicas eletrofisiológicas e neuroanatômicas para caracterizar funcionalmente neurônios morphologically- e identificados neuroquimicamente in vitro; em especial, os diversos tipos de Ins inibitórios corticais. Os principais aspectos do processo são: (1) pré-seleção de potenciais INs; (2) gravação intracelular e visualização neurônio; e, finalmente, (3) análise morfológica e imunocitoquímica de Ins gravados. Embora este estudo dirigiu-ins PV, em particular, o protocolo descrito pode ser utilizado para gravação de qualquer interneurónio similares ou outros tipos neuronais, com alteração mínima.
O número relativamente baixo de interneurônios em áreas corticais faz seleção aleatória e gravação a partir dessas células altamente ineficientes. Localização divergente e características morfológicas têm possibilitado aos pesquisadores distinguir e rotineiramente gravar a partir de alguns tipos interneuron. No entanto, em fatias, a identificação de estagiárioeurons dentro e nas imediações das camadas de células do corpo continua a ser difícil, como com FS-ins. O advento das linhas de camundongos transgênicos, expressando as proteínas fluorescentes em populações específicas interneuron oferece uma solução elegante que faz pré-seleção e gravação desses neurônios muito mais eficiente 2. Agora, muitas linhagens transgênicas, principalmente ratos, mas cada vez mais também os ratos 13 estão disponíveis, facilitando a investigação de interneurônios. Ao utilizar linhagens transgênicas, no entanto, é essencial para estabelecer a extensão ea especificidade da expressão repórter.
Qualidade de rotulagem e a morfologia celular, bem como o registo electrofisiológico, dependem criticamente, fatias de alta qualidade viáveis; para que o cérebro tem de ser rapidamente dissecado (idealmente 20-40 seg), tratadas com muito cuidado e de forma contínua gelada. Nós descobrimos que a utilização de sacarose-ACSF, pelo que a concentração de sódio em geral e, portanto, a excitabilidade de neurónios é reduzida, o dramaticamente melhora a qualidade do fatias e interneurónio sobrevivência 18. No entanto, deve-se ressaltar que muitos pesquisadores têm feito uso de ACSF gravação padrão para a preparação fatia, com grande efeito 10,11,15. Integridade morfológica depende muito do ângulo em que as fatias são cortadas 13; que varia conforme a região e tipo de célula. No entanto, muitos interneurônios podem ser gravados de forma confiável a partir de fatias transversais, coronais ou sagitais. Para minimizar ainda mais indenização de dendritos e axônios, células mais profunda no tecido devem ser alvo, ainda que sacrificar a qualidade e confiabilidade de formação de selo giga-ohm IR-DIC. Nestas circunstâncias gravações de ambas as células piramidais de CA1 e FS-ins podem ser obtidos de forma confiável.
Rotulagem e visualização dos neurônios é obtida após uma sessão de gravação típica com duração de 30 minutos ou mais. Se as gravações duram menos de 30 minutos, é necessário para permitir que este tempo antes da fixação para permitir a biocytin difundir em dendríticas distal e os processos axonais, que garanta o enchimento completo e, assim, a visualização post-hoc de células.
Em gravações de células inteiras, mantendo as resistências baixas e estáveis da série é imperativo para a medição fisiológica exata de propriedades sinápticas e intrínsecos, bem como a rotulagem completa dos neurônios. No entanto eléctrodos de baixa resistência permitir diálise rápida do citoplasma com a solução intracelular contido dentro da pipeta. Completando a solução intracelular com ATP, GTP e phosphocreatine certamente ajuda a manter os fornecimentos de energia e qualidade de gravação. No entanto, a diálise de neurotransmissores e proteínas pode levar a respostas diminuídas, reduzida plasticidade 19 e também pode dificultar a identificação neuroquímica. Por exemplo PV é constantemente lavadas de neurónios ao longo das experiências mais longos. Assim, o exame dos processos dendríticos ou axonais distais pode ser necessária para dete imunorreatividade rmine do neurônio gravado. Em tais casos em que tal é uma preocupação de diálise, utilizando gravações configuração perfurada-emplastro pode ser utilizada para preservar o ambiente intracelular de 20, no entanto, o sistema deve ser quebrada no fim de gravações ou, subsequentemente, o neurónio "repatched" na configuração de célula inteira para permitir o enchimento biocitina.
Investigação farmacológica dos neurônios registrados é um método útil para avaliar o significado funcional de mecanismos neuromoduladores divergentes na formação da atividade intrínseca e sináptica de INs. Nos métodos acima descritos, isoladamente farmacológica e gravações emparelhados são utilizados para avaliar os efeitos de GABA pré-sináptica e pós-B mediada por R, respectivamente; no entanto pode-se facilmente modificar a combinação de agonistas e antagonistas de receptores para avaliar o papel das famílias de receptores alternativos, por exemplo o sistema de canabinóide 21.
"> Processamento histológico e imuno-histoquímico de células gravadas é altamente fiável, uma vez que são os protocolos estabelecidos. Imunocitoquímica O protocolo aqui descrito foi ajustado em relação à combinação de anticorpos utilizados, a espessura da fatia e requisito para identificar o conteúdo neuroquímica. Nós utilizamos soro de cabra normal como todos os anticorpos secundários utilizados são levantadas em cabra. Como alternativa, é também possível a utilização de albumina de soro bovino (BSA) ou leite em pó como agentes de bloqueio. Deve notar-se que este protocolo utiliza salina tamponada com fosfato (PBS) para o anticorpo de incubação, contudo, alternativamente, pode-se utilizar simplesmente 0,1 M PB, em vez de PBS. Usando uma relativamente alta concentração de detergente (0,3% Triton X-100), não diminui a antigenicidade aparente, enquanto que permite a penetração dos anticorpos para a primeira camada 100 uM de superfície da fatia , em que os neurónios são rotineiramente registada. Se as células são mais profundos gravados, ou as fatias são mais espessas, é aconselhável resectisobre as fatias, utilizando um criostato ou um vibratome e executar a imunomarcação nos (40-70 um) seções finas. Para 300 um fatias, uma longa incubação dos anticorpos (a 4 ° C para preservar a integridade estrutural das fatias) produz resultados altamente fiáveis imunocitoquímicas.Identificação dos neurónios baseia-se na informação combinada obtida na gravação, o post-hoc de análise morfológica e imunocitoquímica. No hipocampo, devido à estrita organização laminar, distribuição axonal é um bom indicador dos alvos pós-sinápticos de interneurónios. Cortou axónio ou dendritos, no entanto, pode tornar a identificação difícil ou impossível. Além disso, mantém-se uma certa ambiguidade, por exemplo, na diferenciação de PV + BCs e interneurónios axo-axonic, devido à semelhança na localização global axonal. A identificação final definitiva exigiria análise de microscopia eletrônica de metas pós-sinápticos 1,3 or posterior dissecação imunocitoquímicas 22.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Ina Wolter pelo seu excelente assistência técnica. Ratos transgênicos VGAT-Vênus foram gerados pelos drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e Y. Kawaguchi no Instituto Nacional de Ciências Fisiológicas, Okazaki, Japão, usando pCS2-Venus fornecido pelo Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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