Summary
皮层网络由一个小的，但不同组抑制性控制。因此的interneurons功能调查需要有针对性的记录和严格的鉴定。这里描述的是一种涉及从单个或突触耦合对神经元细胞内的标记，事后的形态学和免疫细胞化学分析的全细胞记录相结合的方法。
Abstract
GABA能抑制性脑部神经回路中发挥核心作用。的interneurons包括神经元群（10-20％）的一小部分，但表现出的生理，形态和神经化学异质性很高的水平，反映了他们不同的功能。因此，的interneurons的调查提供了重要的见解的组织原则和神经回路的功能。然而，这需要一个综合的生理和解剖学的方法对个别interneuron类型的选择和鉴定。全细胞膜片钳从转基因动物中的急性脑切片，表达下的interneuron特异性标志物的启动子的荧光蛋白的记录，提供了一种有效的方法来定位和电生理学表征特定interneuron类型的特性和突触性质。结合细胞内的染料标记，这种方法可以扩展事后MOrphological及免疫细胞化学分析，使记录的神经元系统的鉴定。这些方法可以被定制，以满足范围广泛的方面的皮层神经元的不同类型的功能性的科学问题。
Introduction
海马神经元电路一直是严格审查的主体，对于两者的解剖和生理，由于人类和啮齿类动物学习和记忆的重要作用以及空间导航。同样，海马突出，但简单的分层组织，使本地区的研究，解决皮层网络的结构和功能特性青睐的主题。
海马电路是由兴奋性主细胞（> 80％）和一个较小的（10-20％），但抑制性1-3的高度多样化的队列。释放的interneurons从他们的轴突末梢，其作用在快离子型GABA受体γ-氨基丁酸（GABA）（GABA A RS）和慢代谢型GABA受体乙 （GABA 乙 RS）4。这些抑制机制抵消激励和调节主细胞的兴奋性，从而IR时间和放电模式。然而，从GABA释放的interneurons行为不仅对主细胞，同时也对自己的interneurons 5,6。前和突触后受体介导的各类interneuron之间的反馈调节和抑制的相互交互。在interneuron网络这些抑制机制被认为是中心的产生和人口活动模式成形，特别是振动在不同的频率7。
全细胞膜片钳记录是一种行之有效的方法固有特性和神经元的突触相互作用的检查。然而，由于interneuron类型的高多样性，抑制性的调查，需要严格识别所记录的细胞。作为海马interneuron类型的特点是鲜明的形态特征和神经化学标志物的表达，结合解剖和免疫Ëxamination可以提供一种方法来确定精确的interneuron身份6,8,9。
在本论文中，我们描述了一种实验方法，其中从单个神经元或突触耦合对全细胞膜片钳记录是结合胞内标记，随后事后形态学和免疫细胞化学分析，允许缓慢GABA B中的特征受体介导的中鉴定的interneurons抑制作用。作为一个例子，我们专注于interneuron的一个主要类型，即所谓的“篮状细胞”（BC）的一个子集，它支配其突触后目标的胞体和树突的近端和的特点是“快扣球”（FS）放电模式中的钙结合蛋白小清蛋白（PV）10,11，一个轴突密集覆盖的电池主体层，并表达。这些显示的interneurons大的抑制性突触后电流，以及突出的前它们的突触输出突触调节，以应对GABA; B R激活12。这里所描述的技术的组合可用于同样，调查在各种其他确定神经类型的本征或突触机制。
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Protocol
道德声明：所有程序与动物维修均按照制度执行指引，德国动物福利法案，欧盟理事会86/609 / EEC号指令对动物的保护，地方当局（柏林，T 0215/11准则）
1，制备急性，海马
- 以转基因大鼠（17〜24日龄），在VGAT子，其中标签的大部分皮质抑制性13表达的荧光金星/ YFP的蛋白质。杀头的老鼠。迅速解剖大脑（<40秒）进semifrozen，carbogenated（95％O 2/5％CO 2）的基于蔗糖的人工脑脊髓液（蔗糖-ACSF， 图1A）。
- 评估解剖大鼠脑金星/ YFP的荧光505 nm的LED灯和515排放过滤器，安装在一对护目镜。
- 删除皮质和cereb的正面第三ellum;然后分离出半球，全部用手术刀。除去皮层的背侧表面，以提供一个平坦的表面粘上脑下，如先前所描述的14。
- 切断海马结构的横切片（300微米）上vibratome，半球应semifrozen包围，carbogenated蔗糖学联（ 图1B）14。去除皮质延髓，中脑和脑干的其他地区。每片转移到含有蔗糖，学联，这是carbogenated，并加热到35ºC淹没保持室。
- 离开片恢复在35°C下进入回暖学联的最后一个片段的时间为30分钟。为了激活代谢过程，并促进神经切断过程的再密封做到这一点。然后转移到室温下储存（ 图1C）。
2，制作与录音移液器的灌装
- 浦从玻璃毛细管LL补丁移液管，以便为2-4MΩ移液管电阻时填充有过滤实现（注射器过滤器，孔径：0.2微米），含有0.1％生物胞素（用于胞内标记）的细胞内溶液。请在冰上冷却，以防止其成分的降解细胞内液。
- 填写补丁移液器识别性突触后电流与含有生理相关的低氯溶液-浓度（E R（氯离子）= -61毫伏;看到解决方案的列表）。
- 用于配对的记录，以确定在突触前受体介导的反应，填充修补移液器与低的 Ca 2 +的缓冲能力，以防止与发射机释放干扰突触前，以及4倍高氯细胞内液-浓度（E R（氯离子）= -20毫伏），以改善信号对噪声观测IPSC的5允许药理RESP的准确评估的onsiveness。需要注意的是不断变化的Cl -的浓度可以改变IPSC动力学15。
从FS-INS 3全细胞膜片钳记录
- Carbogenate的ACSF和通过灌注系统馈送到记录室中，用蠕动泵（它也消除ACSF从录音室经由吸入管线， 图2A）的装置。在准备打开在设置中的所有设备进行记录。
- 转片到录音室，并固定在其位置与铂金戒指串成单纤维丝。定位片，使CA1区的地层（STR）锥体垂直贯穿的视野，允许访问与2移液器两个海峡。 radiatum和STR。 oriens同时（ 图2C和图4A）。
- 将腔进入设置和启动carbogenated灌注和加热（32-34℃）录制的相关CSF为5-10毫升/分钟的流速。
- 评估下的IR-DIC的光学切片质量的40倍物镜放大倍数，并用可视化的CCD摄像头在显示器上观看。设好片的质量，如果有大量圆形，中等对比CA1区锥体细胞（CA1电脑）都可以在海峡可见。锥体深度为20〜30微米以下的顺利，轻轻陨石坑的表面（ 图2C）。质量差的片含有大量的高对比度，萎缩或肿胀的细胞，具有不均匀的片表面。
- 下表荧光照明识别推定的FS的interneurons那些表达金星/ YFP（ 图2B），并在或靠近STR大的多极胞体。锥体 。相当深，以切片（50-100微米， 图2C）中选择单元格，以便更好地维护自己的形态完整。
- 安装在上的探头的移液管固定器的记录电极;然后应用程序立法院通过管线低，正压力（20-30毫巴）。降低吸移管向片的表面上，稍有偏移到所选择的神经元的中心。
- 获得全细胞记录的配置如前所述14,16和还可参见图2D和2E：
- 靶细胞：增大压力，以70-80毫巴，并通过切片所选择的小区（ 图2D中 ，上部）的体细胞向正上方迅速降低吸移管。
- 接近电池：按吸管对细胞膜产生一个“酒窝”就可以了（ 图2D，上图）。迅速地执行该步骤，以防止相邻小区中的生物胞素标记。
- 创建一个千兆欧姆封：释放压力，并同时应用20 mV的电压指令的吸管。 Ä千兆欧姆封（1-50GΩ; 图2D，底部和图2E中）炎热的典型盟友迅速发展。一旦密封，申请预期静息膜电位（通常介于-70和-60毫伏）作为电压指令。
- 突破的补丁：一旦密封，破裂的膜修补用的负压的短脉冲;由此实现了全细胞构型（ 图2E，底部）。
- 补偿的全细胞电容和串联电阻（R S）。 R 5 为通常5-20MΩ，稳定长达120分钟。抛弃细胞，如果膜电位（V M）上的突破比-50毫伏以上的去极化; R 5是比最初的30MΩ更大;或R S发生变化超过20％以上的记录的过程。
- 确定FS-INS通过他们的反应（在电流钳模式），以一个家庭hyper-对去极化电流脉冲（-250〜250 pA的， 图2F，上图）。 FS-INS已经相对去极化V M（通常是-50吨Ø-60毫伏），短膜时间常数（<20毫秒），并响应500 pA的去极化电流注入与动作电位火车（APS）在频率> 100 Hz的11（ 图2F，下图），这是明显的有别于海马CA1电脑（ 图2F，中）。
4，外电刺激唤起的GABA 乙 R-介导的反应
- 在海峡的边界切片：;观察突触诱发反应，位置的细胞外刺激电极（0.1〜0.3MΩ电阻贴片吸管充斥着2 M氯化钠）。 radiatum和STR。腔隙-moleculare。放置电极200-300微米横向于体细胞，防止细胞的直接电刺激，并尽量减少刺激伪影（ 图3A）。
- 一旦刺激电极被定位，得到的全细胞记录所选择的细胞，并评估生理学表型在电流钳模式，如第3.9节（ 图3B）。
- 记录在电压钳（V M -65毫伏）的神经元，突触传递轴突的电刺激，在50 V（〜500μA有效的刺激），每20秒，使用独立的恒压刺激。使用单一刺激（100微秒的持续时间， 如图3C所示 ，顶端）观察GABA; B R介导的IPSC的，并具有多种刺激的列车交错（在200赫兹），以产生更大的发送器释放。
- 巴斯申请离子型谷氨酸受体拮抗剂（AMPA受体：DNQX [10 M]。NMDA受体：D-AP5 [50μm]的）揭示孤立突触IPSC（ 图3C，中上部）。进一步孤立氨基丁酸乙 R-介导的IPSC与应用程序的GABA A R阻滞剂（gabazine [10 M]。 图3C中L奥尔）。
- 确认所产生慢外向钾电流（ 图3C低，扩）为被氨基丁酸乙的R-介导的后续应用的CGP-55845 [5微米]（ 图3C较低，伏在灰色）
突触的5成对录音加上FS-IN和CA1电脑
- 评估抑制性突触传递的具有同步记录，如下所述突触耦合器IN和PC机对之间进行的GABA 乙 R-介导的突触前的控制。
- 首先，建立突触前interneuron的全细胞记录（如在第3节），并确认FS型（ 图4A）。
- 然后修补邻近CA1电脑（20-100微米的距离， 图4A），并应用简单阈上的去极化电流脉冲（1毫秒的时间，1-5 nA的幅度）的突触前输入（电流钳模式持有）引出的AP。如果突触合作nnection存在时，在IN结果在CA1的PC，在电压钳保持IPSC的接入点（补偿R 5至约80％）。
- 如果有必要，填补进一步CA1区个人电脑的新记录电极和记录，直至找到一个连接。
- 一旦建立了连接，引起对受影响的突触前的FS-IN来评估两者的单一的突触响应和动态行为。使用2去极化刺激典型的双脉冲协议与50毫秒的间隔（ 图4B）。
- 收集在基准条件控制的痕迹。然后，应用选择性的GABA; B R激动剂巴氯芬（10μM）的灌流ACSF，从而激活GABA 乙卢比，其次是拮抗剂CGP-55845（5μM），以完全阻止该受体介导的作用。在对每种药物的条件（ 图4B和C）稳态收集〜50的痕迹。
- 一旦录音完成后，通过形成outsid密封体膜电子出补丁：慢慢从细胞体抽出吸管在V形夹紧和作为R 5的增加，降低了V M至-40毫伏。这样做是为了便于外出补丁的形成;然后从浴吸管。
电生理特性的分析6。
- 注：多种不同的软件包可用于收购电数据。在这里，WinWCP，在免费的斯特拉斯克莱德电软件包Windows程序时，它可录制高达16个模拟输入通道和10个数字信号输出。
- 低通滤波器的所有数据，在5〜10 kHz和样品在20千赫。
- 与离线分析套件分析生理数据。
注：Stimfit，一个开源的软件包，其中包括一个Python的外壳，用在这种情况下;但是其他方法可以很容易地被使用。- 分析被动膜糖蛋白记录神经元的roperties，在电流钳收购，从静止膜电位。
- 测量从记录开始记录响应的基线的平均静息膜电位。
- 计算输入电阻，用欧姆定律，从电压响应于最小的超极化电流脉冲（≤-50 PA）。为了改善信噪比，平均的多次波轨迹。注：我们的例子是典型的10-50个人的扫描平均值。
- 估计表观膜时通过安装一个单指数曲线的响应最小的超极化电流脉冲的衰减时间常数。
- 分析动作电位波形来确定的阈值，振幅（阈值到峰值）和持续时间（宽度的一半高度测量）根据阈值水平去极化电流脉冲引起。
- 分析GABA; B R的电压钳记录介导的IPSC的。滤波器跟踪离线处500赫兹（高斯滤波器），并评估该峰振幅和潜伏期的GABA; B R介导的应答的（在至少10痕迹的平均值）。
- 检测γ -氨基丁酸乙卢比对土著民族的抑制输出的峰值和前面的基线之间测得的GABA A R-介导的IPSC的峰值振幅变化的影响。从≥50痕迹的控制周期和所有药物时代的稳态计算的平均幅度。
7，可视化及免疫细胞化学FS宏
- 以下的录音，通过浸渍固定切片在4％多聚甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液（PB，pH值= 7.35），O 2 / N，4℃。
- 如果必要的切片可以处理之前被转移到PB和存储长达〜1周时间。
- 洗涤切片用大量新鲜的PB，并随后在0.025M的PB用0.9％的NaCl（PBS，pH值= 7.35）。
- 为了减少非特异性抗体结合，阻断FO切片中，R 1小时，在室温在含有10％正常山羊血清（NGS），0.3％的Triton-X100（清洁剂通透膜）和0.05％NaN 3的，由在PBS中的溶液。
- 标记为光伏表达，使用抗光伏单克隆小鼠抗体稀释在含有5％NGS，0.3％的Triton-X100，0.05％NaN 3的，在PBS中的溶液。在4℃下孵育12的初级抗体为2-3天。冲洗切片彻底的PBS中。
- 应用荧光抗小鼠的二抗（ 例如，Alexafluor-546。）连同生物素结合蛋白链菌素，缀合至荧光染料（ 例如 ，Alexafluor-647）;并培养在含3％农工商，0.1％的Triton-X100，0.05％NaN 3的解决方案，用PBS稀释，并培育在o / n 4℃。
- 宽松冲洗2-3倍，用PBS其次是2-3中的冲洗PB片。装在载玻片上的切片。使用300微米琼脂垫片，以防止片坍塌。盖滑片与fluores分装中，密封，钉清漆。
8，成像和可视化重建FS宏
- 可视化利用共聚焦显微镜切片，与fluorochome记者兴奋与适当的激光线（激光二极管635 nm处Alexafluor-647;氦氖543 nm处Alexafluor-546标签的PV和氩气488或515纳米的金星/ YFP）。
- 拍摄图像在适当的Z分辨率（通常为0.5-1微米的步骤，用20倍的目标）产生一个Z堆栈整个细胞。多个堆栈通常需要将图像的整个细胞，其可以被数字缝合离线使用斐济/ ImageJ的软件（ 图5A）。
- 用半自动跟踪的方法重建的拼接图像的堆栈单元（简单轴突示踪插件斐济/ ImageJ的软件包17， 图C）。
- 最后，评估光伏免疫反应的Interneuron具有高数值孔径的物镜（60X硅浸渍，NA = 1.3）。使胞体的图像，近端树突和轴突近端，或者对轴突末梢，如果光伏发电体冲刷太强。细胞被认为是阳性的光伏如果免疫标记看出，以符合生物胞素标记的结构（ 图5B）。
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Representative Results
只要切片质量明显好，无论从CA1电脑和FS的插件可以用最少的困难，实现记录。在VGAT子13表示金星/ YFP的转基因鼠线不明确标识的FS-INS，或实际上的BC。然而，在和周围STR从诸IN录音。锥体 ，其中fs插件的密度通常很高1，结果在选择FS-INS（ 图2B）的概率较高。 FS的插件可以通过其特有的生理特性与两个CA1区的PC和RS-INS的不同来区分。他们有一个相对去极化静息膜电位（-58.9±1.5 mV时，15单元，与-62.6±1.1 mV的海马CA1电脑，26个细胞），低输入阻抗（92±12MΩ与103在PC的±14MΩ）快速的表观膜时间常数（15.4±2.6毫秒与22.0±2.7毫秒的电脑），resul婷在快速电压响应超极化电流脉冲（ 图2F）。 FS-INS放电幅度相对较低（82.8±1.0毫伏），其次是非常突出快后超极化的非常简短的动作电位（0.38±0.01毫秒）（平均幅度22.6±2.9毫伏）。为了应对大量的去极化电流脉冲（250 PA），FS-INS发射在高频率（82±10赫兹;范围：34-128赫兹; 图2D，左）。
评估FS-INS GABA 乙 R-介导突触后电流，药理孤立的突触反应被抑制纤维在海峡的外刺激引起。 radiatum /腔隙-moleculare边界。 图3示出的一个FS-IN，其中，所述化合物的突触响应的分量的顺序封锁隔离单突触GABA 乙 R-介导的慢IPSC的例子。突触反应是礼由单一的刺激或刺激3-5（50 V的强度，0.1毫秒的时间，在200赫兹交付）到海峡火车引用。腔隙-moleculare / radiatum边界（ 图3A）。初始化合物反应包括兴奋性和抑制元件（ 图3C，顶 ）强烈受到浴应用的AMPA和NMDA受体拮抗剂（： 如图3C所示，中间 DNQX，10μM及AP-5，50μM，分别）降低。剩余的突触IPSC由早期的快速内向电流（假定的向内氯-在保持电位-65 mV的介导的电流，约为-60 mV的反转电位，在这些实验中）和较慢的外向电流（由假定的介钾离子电导与反转电位接近100毫伏）。选择性GABA A R拮抗剂gabazine中的应用（SR-95531，10微米）取消了快速IPSC，留下孤立慢GABA 乙 R-介导的IPSC（ 图3C，底部的黑色痕迹）;其中观察到响应于单一的刺激，但更清楚地响应于刺激的短列车。这个反应被确认为GABA 乙 R-活化的K +电导的，因为它阻断了有效和选择性拮抗剂CGP-55845（CGP，5μM， 如图3C所示，底部，灰迹线）。 FS的BC通常显示大振幅的GABA 乙 R-介导的IPSC的，如在我们最近的出版物12中所示。
为了评估FS-IN由乙氨基丁酸抑制卢比输出，搭配录音是从突触耦合的FS-IN和CA1电脑进行突触前调节。 FS BC和CA1 PC之间的突触连接是比较高的，如先前1,3所示。在这些记录，如前所示，耦合概率接近位于细胞对（≤50微米之间的50％以上;
一次的记录已经完成，成功形成的外部输出的补丁，该切片固定过夜，并随后进行处理，以可视化和分析所记录的细胞的形态，并确定它们的神经化学标记物的含量。 图5A中示出了一个代表性的FS BC的形态得到的共聚焦显微镜结合图像栈的投影。 PV的细胞的表达中，给了一个明确的免疫信号多细胞体和近端树突免疫细胞化学标记，确认所记录的和生物胞素标记的细胞（ 图5B）。从拼接图像堆栈使用简单轴突示踪插件斐济软件（ 图5C）17进行细胞的三维重建。轴突显示，和附近的STR络的高密度。锥体与＆＃8220;各地CA1电脑（ 图5A，插图 ）的胞体构成，近似于识别该小区为公元前篮子“。此外，SOMA的定位接近海峡。锥体和径向为主的树突跨越CA1区的所有层以及对FS的BC 10典型的形态特征相符。
综上所述，在从标识FS PV +的BC获得全细胞记录，我们已经证明，这些细胞表达大振幅的GABA 乙 R-介导的慢IPSC的和它们的突触输出也被显着地由突触前GABA 乙 Rs中的活化抑制。
图1制备急性海马脑片。（A）新鲜解剖老鼠的大脑。注意周围的脑冰，保持接近0℃的整个大脑的温度。（b）切割300微米海马在莱卡VT1200s vibratome。半球被对准，使得皮质表面被第一切断。注意，大量的周围的半球和冰冷的ACSF（箭头）（C）的恒定carbogenation切割脑切片后泥泞的冰被移动到温热蔗糖-ACSF。切片被翻转和调整，以去除前脑和中脑，只留下了海马和皮质覆。
图2全细胞膜片钳记录从的interneurons：（A）周围的腔室中的记录的配置。注意，流入和流出是在相对的腔室的侧面，实现了接近层流。也可见是recordi纳克电极，安装在所述的探头，并在两侧的接地电极，以及目标（40X，浸水），中间（B）的VGAT金星/ YFP的信号在低功耗啶图像在切片的海马CA1（C）的IR-DIC同一地区的影像。在B和C中的箭头表示在该单元主体层的维纳斯/ YFP阳性interneuron（D）在图B中所示的神经元的胞 体的高功率IR-DIC图像，用接近膜片电极上形成的凹坑表面（顶部），并随后在全细胞构型（底）的细胞（E）管脚建立一个全细胞膜片钳记录（左侧）与卡通响应于测试电压的主要阶段的说明-pulse监测电阻在枪头（右侧）。顶行：移液器在洗澡远离细胞;中上：酒窝的形成，伴随着降低脉冲幅度，表明适度增加阻力。中等偏下：千兆欧姆密封形成。需要注意的是，电流脉冲幅值被大大降低了。仅快速容性电流是可见的脉冲的开始和结束前吸管电容进行补偿。底部：全细胞记录的配置是通过移液管尖下膜的膜片破实现。注意，在开始时和串联电阻补偿前的脉冲结束的大，但相对缓慢的容性电流被施加（F）的一个FS-IN（顶部）和CA1的PC（底部）代表的痕迹，由一个家庭超的引出 - 向去极化电流脉冲（如上所示协议）。注意的FS-IN的频率非常高的放电相比，在CA1 PC的慢得多的焙烧。右边小图：来自CA1的PC（顶部）和FS-IN（底，中灰色，叠加在PC上的AP在黑色）AP的波形的比较，示出了二fference在AP和层次分析法的波形。
图3复合突触反应的药理学解剖，分离速度慢的GABA 乙 R-介导的IPSC的一个FS-IN。录音室中的切片（A）IR-DIC图像，与放置在海峡的边界记录电极（补丁）。 oriens（ORI）和锥体 （比利牛斯）和模拟电极（兴奋剂）在str的边界。 radiatum（拉德）和腔隙-moleculare（LM）（B）左：在记录结构的示意图。右：在FS-IN叠加电压响应由一个家庭hyper-引起的去极化到目前注射（三）在FS-IN为响应刺激细胞外记录代表的痕迹。上图：该化合物突触反应产生的正常学联由单一的刺激（50 V的强度，0.1毫秒的时间）引起。中上部：后DNQX（10微米）和D-AP-5（50微米）的浴应用隔离单突触IPSC。中间下：快速突触IPSC的是以下的加成gabazine（10μM）的浴阻止。下图：5刺激的一列火车（200赫兹），揭示了一个缓慢的GABA; B R介导的IPSC（黑色线），这是阻止CGP的后续申请（5微米）到浴（叠加灰色轨迹）。
抑制性突触传递的突触前调制图4分析配对的耦合FS-IN和CA1电脑对录音。 （一）左图：两个记录移液器IR-DIC图像，左逐一的边界<修补到FS-IN EM>海峡。 oriens（ORI）和锥体 （比利）和修补到CA1电脑靠近海峡的权利。 radiatum（拉德）。右面板中：录制结构的示意图，从FS-IN（左）和海马CA1电脑（右）代表电压响应一个家庭的电流脉冲（b）显示在引起突触前受影响的痕迹代表的FS-IN （顶）和短延迟酉IPSC在海马CA1 PC（底部）的控制条件下（在左侧迹线），浴后应用巴氯芬（10μM，中）和CGP的后续申请（5μM，右） 。注意，巴氯芬降低了IPSC振幅由〜50％，而CGP导致IPSC振幅的几乎完全恢复。控制迹线被示出为伏（C）的时间过程的IPSC振幅的曲线图显示了巴氯芬和CGP的效果。 IPSC的记录，在10秒的间隔。
图5可视化，重建和免疫识别生物胞素标记的记录FS-BC的（A）一个FS-IN成像与激光共聚焦显微镜20倍的目标图像的拼接栈的投影。的胞体位于海峡的边界。在CA1区，树突运行径向和跨越所有层，而大多数轴突和周围的细胞体层被发现的radiatum（拉德）和锥体 （比利牛斯）;作为典型的BC。比例尺：100μm左右。插图，右上：一个20层的高放大倍率的投影，呈现出轴突周围形成公认的CA1区电脑胞体（橙色星号），典型的篮子。比例尺：10μm以下（B）的中的生物胞素填充细胞体（白色pseudocolour，下面板，箭头）显示免疫反应性为PV（显示为绿色，上图）。规模棒：单元格的三维重建的20微米（C）投影。胞体和树突的黑色和轴突红色。 CA1区层划定为蓝色。缩写：大利，STR。 oriens; LM， 海峡。腔隙-moleculare。比例尺：100μm左右。
| 产品名称 | 组合物（毫摩尔） | 使用 | 注意事项 |
| 蔗糖学联 | 87氯化钠，氯化钾2.5，25的NaHCO 3，1.25和NaH 2 PO 4，25葡萄糖75蔗糖，7的MgCl 2，0.5的CaCl 2，1丙酮酸钠，1的Na-抗坏血酸 | 制备和贮存脑片 | pH值= 7.4;渗透压=〜350毫渗量 |
| 学联记录 | 125氯化钠，氯化钾2.5，25的NaHCO 3，1.25和NaH 2 PO 4，25葡萄糖，1氯化镁 | 从脑片记录 | pH值= 7.4;渗透压= 310-315毫渗量 |
| 细胞内溶液（1） | 125 K-葡萄糖，氯化钾10，10 HEPES，10 EGTA，2 氯化镁 ，2钠三磷酸腺苷，0.3的Na-GTP，1钠磷酸和0.1％生物胞素 | 灌装GABAB IPSC记录电极 | pH值= 7.4;渗透压= 295-305毫渗量 |
| 细胞内溶液（2） | 105 K-葡萄糖，氯化钾40，10 HEPES，0.1 EGTA，2 氯化镁 ，2钠三磷酸腺苷，0.3的Na-GTP，1钠磷酸和0.1％生物胞素 | 填充电极配对录音 | pH值= 7.4;渗透压= 295-305毫渗量 |
| 磷酸盐缓冲液（PB） | 100毫米的NaH 2 PO 4 | 漂洗固定片 | pH值= 7.4 |
| 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中 | 的25mM的NaH 2 PO 4 </ sub>的，154 mM氯化钠（0.9％重量/体积） | 漂洗固定片和抗体孵育 | pH值= 7.4 |
| 多聚甲醛固定液 | 4％w / v的多聚甲醛，0.1 mM的PB | 脑片固定 | pH值= 7.4 |
表1的解决方案列表。
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Discussion
我们形容它结合了电生理和神经解剖技术在体外功能鉴定morphologically-和确定的neurochemically神经元的方法;尤其是皮质的抑制诸IN的不同类型。该过程的主要方面是：（1）预选择潜在诸IN的; （2）细胞内记录和神经元的可视化;最后（3）记录的土著民族形态学及免疫细胞化学分析。虽然本研究中特别讨论的PV-INS，所描述的协议，可用于从任何interneuron或其他神经元的类型，以最少的改动类似录像。
的interneurons的皮层区域的数量相对较少，使得这些细胞的效率非常低选号和记录。不同的定位和形态特征已使研究人员能够区分和一些interneuron类型的常规记录。然而在切片，识别实习生在附近的细胞体层eurons仍然困难，如与FS的插件。转基因小鼠品系的出现，表达特定interneuron人群的荧光蛋白提供了一个优雅的解决方案，这使得这些神经元更为有效2预选和记录。现在很多转基因品系，主要是老鼠，但也越来越多地鼠13顷可用，便利的interneurons的调查。当使用转基因系，但是，它必须建立的程度和报告基因表达的特异性。
细胞标记和形态，以及电生理记录的质量，主要取决于可行的，高品质的片;大脑需要为其迅速解剖（最好20-40秒），很认真，不断冷却处理。我们发现，使用蔗糖-ACSF中，从而使整体的钠浓度，从而兴奋性神经元减少，剧的角度讲提高了切片和interneuron生存18的质量。然而，需要强调的是许多研究人员利用标准录音学联的切片准备，有很大的影响10,11,15。形态完整性在很大程度上取决于在该带被切成13的角度;而不同地区和细胞类型。然而，许多的interneurons可以可靠地记录在从横，冠状或矢状切片。为了进一步减少树突和轴突，细胞更深的组织要有针对性，虽然牺牲了IR-DIC的质量和千兆欧姆形成密封可靠性遣散。根据来自CA1区锥体细胞和这种情况下录音FS插件能够可靠地获得。
标签和神经元的可视化，实现如下一个典型的记录会话持续30分钟或更长的时间。如果记录持续小于30分钟，这是必要的，以允许固定，使生物之前这段时间cytin扩散到远端树突和轴突的过程，保证完整的灌装和细胞因而事后可视化。
在全细胞记录，保持稳定的低串联电阻是必须精确生理测量突触和内在属性，以及神经元的透彻标签。然而低电阻的电极允许与包含在移液管内的胞内溶液的细胞质的快速透析。补充与ATP在细胞内液，GTP和磷酸肌酸有一定的帮助，以保持能源供应和录音质量。然而，神经化学物质和蛋白质的透析可导致减少的反应，降低塑性19，也可以阻碍神经化学鉴定。例如光伏始终如一洗出神经元以上的较长的实验过程。因此，可能需要检查远端树突或轴突过程，以DETE所记录的神经元rmine免疫反应。在这样的情况下，这样的透析是一个问题，使用多孔贴片结构可以用于保护细胞内环境20的记录，但是该补丁必须在录音结束时或在其后，在全细胞构型“repatched”的神经断允许生物胞素馅。
记录神经元的药理研究是评估在塑造土著民族的内在和突触活动的不同神经调节机制的功能性意义的有效方法。在上述方法中，药理隔离和成对的记录被用来评估后和突触前GABA 乙 R-介导的效应，分别;但是可以很容易地修改受体激动剂和拮抗剂的组合，以评估替代受体家族的作用，例如大麻素系统21。
“>组织学和记录单元的免疫细胞化学处理是高度可靠的，一旦协议被建立起来。这里所描述的免疫细胞化学的协议已被调整相对于抗体的结合使用，切片厚度和要求来确定的神经化学物质的含量，我们利用正常山羊血清作为所使用的所有二抗养在山羊，作为替代方案，也可以使用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉作为封端剂，它应当指出，这个协议使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）的抗体温育，然而备选地可以简单地使用0.1M的PB来代替PBS中。使用相对高浓度的洗涤剂（0.3％的TritonX-100），并不会削弱明显的抗原性，同时允许抗体的渗入片段的第一个100微米的表面层其中神经元被定期记录，如果更深的细胞被记录，或切片厚，最好是resecti在切片，用低温恒温器或vibratome，并执行对薄（40-70微米）部分的免疫标记。对于300微米的薄片，越抗体的潜伏期长（在4℃到保护片的结构完整性）产生高度可靠的免疫组化结果。神经元的鉴定依赖于在记录中， 事后形态学和免疫细胞化学分析得到的组合信息。在海马中，由于严格的层状组织，轴突分布的的interneurons的突触后的目标的良好指标。切断的轴突或树突，但是，可以使识别困难或不可能。此外，有些含糊仍然存在，例如在区分PV + BC和轴突-axonic的interneurons，由于相似的整体轴突定位。最后确定的鉴定需要突触后目标1,3Ø电子显微镜分析ř进一步的免疫解剖22。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢伊沃尔特为她出色的技术援助。由Drs生成VGAT金星转基因大鼠。华柳川，米平林和Y川口在全国生理学研究所，日本冈崎，利用博士答：宫胁提供PCS2金星。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | see Uematsu , et al., 2008 | ||
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | ||
| Dissection tools | i.e. FST | For brain removal | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | Custom-made in lab | ||
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. | |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | Custom made | ||
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | ||
| Isolated constant voltage stimulator |  Digitimer Ltd. |
DS-2A | |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5,000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | Any high quality brand | ||
| Glass coverslips | Usually 22 x 22 mm | ||
| Agar spacers | Agar block, cut on vibratome to 300 μm | ||
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | See Schindelin et al., 2012 |
References
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