Helcelle-patch-clamp Optagelser fra Morphologically- og Neurochemically identificerede Hippocampale interneuroner
Summary
Corticale netværk styres af en lille, men varieret sæt hæmmende interneuroner. Funktionel undersøgelse af interneuroner kræver derfor målrettet optagelse og stringent identifikation. Beskrevet her er en kombineret tilgang, der involverer hele-celle optagelser fra en enkelt eller synaptisk koblede par af neuroner med intracellulær mærkning, post-hoc morfologiske og immuncytokemisk analyse.
Abstract
GABAerge inhibitoriske interneuroner spiller en central rolle inden for neuronale kredsløb i hjernen. Interneuroner omfatter en lille delmængde af den neuronale befolkning (10-20%), men udviser en høj grad af fysiologiske, morfologiske og neurokemiske heterogenitet, hvilket afspejler deres forskellige funktioner. Derfor undersøgelse af interneuroner giver vigtige indsigt i tilrettelæggelsen principper og funktion af neuronale kredsløb. Det kræver imidlertid en integreret fysiologisk og neuroanatomiske tilgang til udvælgelse og identificering af de enkelte Interneuron typer. Whole-celle patch-clamp optagelse fra akutte hjerne skiver af transgene dyr, der udtrykker fluorescerende proteiner under initiativtagerne Interneuron-specifikke markører, giver en effektiv metode til at målrette og elektrofysiologisk karakterisere iboende og synaptiske egenskaber specifikke Interneuron typer. Kombineret med intracellulær farvestof mærkning, kan denne tilgang udvides med post-hoc-morphological og immuncytokemisk analyse, der gør det muligt systematisk identifikation af optagne neuroner. Disse metoder kan skræddersys til at passe en bred vifte af videnskabelige spørgsmål vedrørende funktionelle egenskaber af forskellige typer af corticale neuroner.
Introduction
Hippocampus neuronale kredsløb har længe været genstand for intens kontrol, både med hensyn til anatomi og fysiologi, på grund af deres afgørende rolle i indlæring og hukommelse samt rumlig navigation i både mennesker og gnavere. Ligeledes er fremtrædende, men simpelt laminar organisering af hippocampus gør denne region et yndet genstand for undersøgelser vedrørende strukturelle og funktionelle egenskaber af kortikale netværk.
Hippocampus kredsløb består af excitatoriske vigtigste celler (> 80%) og en mindre (10-20%), men meget forskelligartede kohorte af hæmmende interneuroner 1-3. Interneuroner frigive γ-aminosmørsyre (GABA) fra deres axonterminaler som virker ved hurtigt ionotropiske GABAA-receptorer (GABAA R'er) og langsomme metabotrope GABAB receptorer (GABAB Rs) 4. Disse inhibitoriske mekanismer modvægt excitation og regulere ophidselse af primære celler og dermedIR timing og mønster af decharge. Men GABA frigives fra interneuroner ikke kun fungerer på vigtigste celler, men også på interneuroner selv 5,6. Pre og postsynaptiske receptorer medierer feedback regulering og hæmmende gensidige interaktioner mellem de forskellige typer af interneuron. Disse hæmmende mekanismer i Interneuron netværk menes at være centrale for generering og udformningen af befolkningens aktivitet mønstre, navnlig svingninger på forskellige frekvenser 7.
Whole-celle patch-clamp optagelse er en veletableret metode til undersøgelse af iboende egenskaber og synaptiske interaktioner af neuroner. Men på grund af den høje mangfoldighed Interneuron typer undersøgelse af inhibitoriske interneuroner kræver streng identifikation af de optagede celler. Som hippocampus Interneuron typer er kendetegnet ved distinkte morfologiske træk og neurokemiske markør udtryk, kombineret anatomiske og immunocytokemisk examination kan være et middel til at bestemme præcis interneuron identitet 6,8,9.
I denne artikel beskriver vi en eksperimenterende tilgang, hvor hel-celle patch-clamp optagelser fra enkelte neuroner eller synaptisk koblede par er kombineret med intracellulær mærkning, efterfulgt af post-hoc morfologiske og immuncytokemiske analyse, der giver mulighed for karakterisering af langsom GABA B receptormedieret hæmmende effekt på identificerede interneuroner. Som et eksempel, har vi fokus på en større type interneuron, en delmængde af de såkaldte "basket celler" (BC), som innerverer Soma og proksimale dendritter sine postsynaptiske mål og er kendetegnet ved en "hurtig spiking" (FS) aflade mønster, en Axon tæt dækker cellen hovedlaget, og ekspression af calcium-bindende protein parvalbumin (PV) 10,11. Disse interneuroner vise store postsynaptiske hæmmende strømme, såvel som fremtrædende præsynaptisk modulering af deres synaptisk produktion som reaktion på GABA B R aktivering 12. Kombinationen af teknikker beskrevet her kan anvendes lige godt til at undersøge iboende eller synaptiske mekanismer i en række andre identificerede neuron.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metode, som kombinerer elektrofysiologiske og neuroanatomiske teknikker til at funktionelt karakterisere morphologically- og neurochemically identificerede neuroner in vitro; især de forskellige typer af kortikale hæmmende ins. Vigtige aspekter af proceduren er: (1) forudgående udvælgelse af potentielle INs; (2) intracellulære optagelse og neuron visualisering; og endelig (3) morfologisk og immuncytokemisk analyse af optagne ins. Selv om denne undersøgelse har behandlet PV-Ins i særdeleshed, kan d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at takke Ina Wolter for hendes fremragende teknisk bistand. VGAT-Venus transgene rotter blev genereret af Drs. Y. Yanagawa M. Hirabayashi og Y. Kawaguchi i nationale institut for Fysiologiske Sciences, Okazaki, Japan, ved hjælp pCS2-Venus leveret af Dr. A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
