Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner
Summary
Kortikala nätverk styrs av en liten, men mångfald av hämmande intern. Funktionell undersökning av intern kräver därför riktade inspelning och rigorös identifiering. Beskrivs här är en kombinerad strategi som omfattar hela-cell inspelningar från enkla eller synaptically kopplade par av nervceller med intracellulär märkning, post-hoc morfologisk och immunocytokemisk analys.
Abstract
GABAergic hämmande intern spelar en central roll inom neuronala kretsar i hjärnan. Intern utgör en liten delmängd av det neuronala befolkningen (10-20%), men visar en hög grad av fysiologiska, morfologiska och neurokemiska heterogenitet, vilket återspeglar deras olika funktioner. Därför undersökning av intern ger viktiga insikter i organisationsprinciper och funktion av neuronala kretsar. Detta kräver dock en integrerad fysiologiska och neuroanatomiska strategi för urval och identifiering av enskilda Interntyper. Hel-cell patch-clamp inspelning från akut hjärnan skivor av transgena djur, som uttrycker fluorescerande proteiner enligt initiativtagarna till Internspecifika markörer, ger en effektiv metod för att rikta och elektrofysiologiskt karakterisera inneboende och synaptiska egenskaper specifika Interntyper. I kombination med intracellulär färgämnes märkning, kan detta tillvägagångssätt utökas med post-hoc morphological och immunocytokemisk analys, som möjliggör systematisk identifiering av inspelade nervceller. Dessa metoder kan skräddarsys för att passa ett brett spektrum av vetenskapliga frågor rörande funktionella egenskaper hos olika typer av kortikala neuroner.
Introduction
Hippocampus neuronala kretsar har länge varit föremål för intensiv granskning, med avseende på både anatomi och fysiologi, på grund av deras viktiga roll i inlärning och minne samt spatial navigering i både människor och gnagare. Likaså den framstående, men enkel laminära organisation av hippocampus gör denna region en gynnad föremål för studier som behandlar strukturella och funktionella egenskaper hos kortikala nätverk.
Hippocampus kretsar består av excitatoriska huvudsakliga celler (> 80%) och en mindre (10-20%), men mycket skiftande kohort av hämmande intern 1-3. Interneuroner frigöra γ-aminosmörsyra (GABA) från sina axon-terminaler som fungerar vid snabb jonotropa GABA A-receptorer (GABA A Rs) och långsamma metabotropa GABA B-receptorer (GABAB skivor) 4. Dessa hämmande mekanismer motvikt excitation och reglera retbarhet av huvudceller, och således denir timing och mönster av ansvarsfrihet. Emellertid GABA frisätts från intemeuroner fungerar inte bara på huvud celler, utan också på de intemeuroner själva 5,6. Pre-och postsynaptiska receptorer förmedlar återkoppling reglering och hämmande ömsesidiga samspelet mellan de olika typerna av interneuronen. Dessa hämmande mekanismer Intern nätverk tros vara central för generering och formning av befolkningen aktivitetsmönster, särskilt svängningar vid olika frekvenser 7.
Hel-cell patch-clamp inspelning är en väletablerad metod för undersökning av inneboende egenskaper och synaptiska interaktioner av nervceller. Men på grund av den stora mångfalden av Interntyper, utredning av hämmande intern kräver rigorös identifiering av de registrerade cellerna. Som hippocampus Interntyper kännetecknas av distinkta morfologiska egenskaper och neurokemiska markör uttryck, kombinerat anatomiska och immunocytokemisk eENOMGÅNG kan vara ett sätt att avgöra exakt Internidentitets 6,8,9.
I föreliggande dokument beskriver vi en experimentell metod där hel-cell patch-clamp inspelningar från enskilda nervceller eller synaptically kopplade paren kombineras med intracellulära märkning, följt av post-hoc morfologiska och immuncytokemiska analyser, vilket möjliggör karakterisering av långsam GABA B receptormedierade hämmande effekter på enskilda intern. Som ett exempel, fokuserar vi på en viktig typ av Intern, en delmängd av de så kallade "korg celler" (BC), som innerverar de soma och proximala dendriter sina postsynaptiska mål och kännetecknas av ett "fast spetsning" (FS) ansvarsfrihet mönster, en axon tätt täcker cellkroppen lagret, och uttryck av kalciumbindande protein parvalbumin (PV) 10,11. Dessa intern visa stora postsynaptiska hämmande strömmar, samt framstående presynaptisk modulering av deras synaptiska utgång, som svar på GABA B R aktivering 12. Kombinationen av tekniker som beskrivs här kan användas lika bra för att undersöka inneboende eller synaptiska mekanismerna i en mängd andra identifierade neuron typer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metod som kombinerar elektrofysiologiska och neuroanatomiska tekniker för att funktionellt karakterisera morphologically- och neurokemiskt identifierade nervceller in vitro; särskilt de olika typerna av kortikala hämmande ins. Viktiga aspekter av förfarandet är: (1) förval av potentiella INs; (2) intracellulära inspelning och neuron visualisering; och slutligen (3) morfologiska och immunocytokemisk analys av inspelade ins. Även om denna studie har riktat PV-ins i synnerhet, kan den beskrivna prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Ina Wolter för hennes utmärkta tekniskt stöd. VGAT-Venus transgena råttor genereras av Drs. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi och Y. Kawaguchi i Institutet för Fysiologiska Vetenskaper, Okazaki, Japan, med hjälp pCS2-Venus från dr A. Miyawaki.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transgenic vGAT-venus rats | – | – | see Uematsu et al., 2008 |
| Venus (515 nm) goggles | BLS Ltd., Hungary | – | – |
| Dissection tools | i.e. FST | – | For brain removal |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation |
| Slice holding chambers | – | – | Custom-made in lab |
| Upright IR-DIC microscope | Olympus, Japan | BX50WI | With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc. |
| CCD camera | Till Photonics | VX55 | |
| 505 nm LED system | Cairn Research | OptiLED system | Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED. |
| Multiclamp 700B | Axon Instruments | Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers | |
| WinWCP acquisition software | John Dempster, Strathclyde University | – | Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc. |
| Electrode Puller | Sutter | P-97 | Used with box-filament |
| Borosilicate pipette glass | Hilgenberg, Germany | 1405020 | 2 mm outer, 1 mm inner diameter, no filament |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls | Other pumps or gravity feed could be used instead |
| Digital Thermometer | – | – | Custom made |
| Digital Manometer | Supertech, Hungary | – | |
| Isolated constant voltage stimulator | Digitimer, Cambridge | DS-2A | – |
| Biocytin | Invitrogen | B1592 | Otherwise known as ε-Biotinoyl-L-Lysine |
| DL-AP5(V) disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120271 | |
| DNQX disodium salt | Abcam Biochemicals | ab120169 | Alternatively NBQX or CNQX |
| Gabazine (SR95531) | Abcam Biochemicals | ab120042 | Alternatively bicuculline methiodide |
| R-Baclofen | Abcam Biochemicals | ab120325 | |
| CGP-55,845 hydrochloride | Tocris | 1248 | |
| Streptavidin 647 | Invitrogen | S32357 | |
| anti-PV mouse monoclonal antibody | Swant, Switzerland | 235 | Working concentration 1:5000-1:10,000 |
| anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A11030 | If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable. |
| Normal Goat Serum | Vector Labs | S-1000 | |
| Microscopy slides | – | – | Any high quality brand |
| Glass coverslips | – | – | Usually 22 x 22 mm |
| Agar spacers | – | – | Agar block, cut on vibratome to 300 μm |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus, Japan | Fluoview FV1000 | Or other comparable system |
| Fiji (Fiji is just ImageJ) | http://fiji.sc/Fiji | – | See Schindelin et al., 2012 |
References
- Freund, T. F., Buzsáki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347-470 (1996).
- Meyer, A. H., Katona, I., Blatow, M., Rozov, A., Monyer, H. In vivo labeling of parvalbumin-positive interneurons and analysis of electrical coupling in identified neurons. Journal of Neuroscience. 22, 7055-7064 (2002).
- Vida, I., Halasy, K., Szinyei, C., Somogyi, P., Buhl, E. H. Unitary IPSPs evoked by interneurons at the stratum radiatum-stratum lacunosum-moleculare border in the CA1 area of the rat hippocampus in vitro. Journal of Physiolology. 506, 755-773 (1998).
- Mody, I., De Koninck, Y., Otis, T. S., Soltesz, I. Bridging the cleft at GABA synapses in the brain. Trends Neurosci. 17 (12), 517-525 (1994).
- Bartos, M., et al. Fast synaptic inhibition promotes synchronized gamma oscillations in hippocampal interneuron networks. PNAS. 99, 13222-13227 (2002).
- Cobb, S. R., et al. Synaptic effects of identified interneurons innervating both interneurons and pyramidal cells in the rat hippocampus. Neuroscience. 79 (3), 629-648 (1997).
- Bartos, M., Vida, I., Jonas, P. Synaptic mechanisms of synchronized gamma oscillations in inhibitory interneuron networks. Nature Review Neurosci. 8, 45-56 (2007).
- Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Review Neurosci. 9, 557-568 (2008).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
- Buhl, E. H., Szilágyi, T., Halasy, K., Somogyi, P. Physiological properties of anatomically identified basket and bistratified cells in the CA1 areas of the rat hippocampus in vitro. Hippocampus. 6, 294-305 (1996).
- Kawaguchi, Y., Katsumara, H., Kosaka, T., Heizmann, C. W., Hama, K. Fast spiking cells in rat hippocampus (CA1 region) contain the calcium- binding protein parvalbumin. Brain Res. 416 (2), 369-374 (1987).
- Booker, S. A., et al. Differential GABAB-Receptor-Mediated Effects in Perisomatic- and Dendrite-Targeting Parvalbumin Interneurons. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7961-7974 (2013).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical GABAergic neurons revealed in transgenic Venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R. P., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Houston, C. M., Bright, D. P., Sivilotti, L. G., Beato, M., Smart, T. G. Intracellular Chloride Ions Regulate the Time Course of GABA-Mediated Inhibitory Synaptic Transmission. Journal of Neuroscience. 29 (33), 10416-10423 (2009).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Schindelin, J., et al. Fiji an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Geiger, J. R., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflugers Archives. 443, 491-501 (2002).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates. Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).
- Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus. Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).
- Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus. Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).
