Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Et funktionelt assay til Gap forbindelsesepitop Undersøgelse; Elektroporation af adhærerende celler på indium-tin-oxid

Published: October 18, 2014 doi: 10.3791/51710
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Microbiology and Immunology and Department of Pathology, Queen's University, 2Ask Science Products Inc.

Introduction

Anvendelsen af ​​elektrisk strøm til en celle bevirker dannelse af porer i cellemembranen ved en proces betegnet elektroporation. Porerne tillader passage af en række nonpermeant molekyler gennem membranen. Det elektriske felt kan styres præcist, således at de dannede porer er meget lille og genlukke hurtigt med minimal forstyrrelse af cellulær fysiologi. Interessant, adhærente celler dyrkes på et objektglas belagt med ledende og transparent indium-tin-oxid (ITO) og elektroporeret i situ, der er på overfladen, hvor de vokser, uden at blive udsendt til elektroporeres i suspension. Celler kan vokse godt på denne overflade, og som de er bundet og udvides, detaljeret mikroskopisk observation er mulig. Ved hjælp af denne teknik, kan små nonpermeant molekyler indføres øjeblikkeligt og i det væsentlige 100% af cellerne, hvilket gør denne teknik specielt velegnet til undersøgelser på aktivering af components af en vej efter ligandstimulering af en receptor (revideret i 1).

Elektroporation mest har været brugt til at indføre DNA (også kaldet electrotransfection). Imidlertid kan elektroporering i stedet være værdifuldt for at indføre en lang række molekyler, såsom peptider 2-4, oligonukleotider, såsom antisense-RNA, dobbeltstrengede DNA-lokkefløjter oligonucleotider til at inhibere transkriptionsfaktorbindende eller siRNA 3,5, 6, radioaktive nukleotider 7-10, proteiner 11 12 eller pro-drugs 13. Efter elektroporering kan celler lyseres til biokemiske analyser eller fikseret og farvet med antistoffer.

Den ledende ITO belægning er meget tynd, 800-1,000Å, således at cellevækst ikke forstyrres af forskellen i højden af ​​de to overflader, som cellerne vokser over kanten af ​​det ledende overtræk. Dette giver den fordel, at ikke-electroporated celler kan dyrkes side om side med elektroporerede dem, for at tjene som kontroller. Samme fremgangsmåde kan bruges til undersøgelse af kløften forbindelsesepitop, intercellulære kommunikation (GJIC), som beskrevet i videoen.

Gap junctions er kanaler, der forbinder det indvendige af tilstødende celler 14. Gap forbindelsesepitop, intercellulære kommunikation spiller en vigtig rolle for dannelse af tumorer og metastaser, mens onkogener såsom Src undertrykke GJIC 15,16. At undersøge GJIC et fluorescerende farvestof, såsom Lucifer gul (LY) ofte indføres i dyrkede celler gennem mikroinjektion eller skrabe-loading 17 og udbredelse af farvestoffet ind i de omkringliggende celler mikroskopisk observeret under fluorescensbelysning. Disse teknikker imidlertid uvægerligt forårsage cellebeskadigelse. Vi beskriver nu en teknik, hvor celler dyrkes på et objektglas, der er delvis belagt med ITO 18. En elektrisk impuls blev anvendt i nærværelse af LY (eller andre farvestoffer) FBbruge sin indtrængen i celler, der vokser på den ledende del af dias, mens farvestof migration til de tilstødende, ikke-elektroporerede celler mikroskopisk blev observeret gennem fluorescensbelysning. For at undgå at forstyrre følsomme celler, der kan have tendens til at løsne sig fra monolaget, til en samling er designet, der ikke kræver en elektrode placeret på toppen af cellerne til at anvende elektrisk strøm 19.. Denne fremgangsmåde giver mulighed for at kvantificere GJIC i et stort antal celler, uden nogen påviselig forstyrrelse cellulær metabolisme, som indikeret ved fravær af en virkning på varigheden af G1-fase efter serumstimulering 12, stigning i niveauerne af fos protoonkogenet protein (Raptis, upubliceret) eller to kinaser, der er forbundet med cellulær stress, p38 gris eller JNK / SAPK kinase 1. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at undersøgelsen af sammenhængen mellem niveauer af onkogen ekspression, transformation og GJIC'en 18, såvel som virkningen af Src og Stat3 på GJIC i en række forskellige celletyper, herunder celler frisk dyrket fra lunge tumorprøver 20-23. Desuden in situ elektroporation med opsætningen beskrevet som mangler en øverste elektrode er blevet anvendt til påvisning af gap junction lukning ved adipocytiske differentiering, selv om cellulær vedhæftning til substratet reduceres på dette tidspunkt 19,24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plating cellerne i Elektroporation Chambers

  1. I en laminar flow hætte, Trypsinisér cellerne ved hjælp af steril teknik som sædvanlig.
    BEMÆRK: Det er meget vigtigt at fjerne ved centrifugering alle spor af trypsin, fordi de kan hindre spredning af cellerne på glasset, og dermed dannelsen af ​​adherens og gap junctions.
  2. 1 ml af cellesuspensionen i det sterile elektroporation kamre forsynet med in situ elektroporator (figur 1), og anbringes i en 37 ° C, CO 2 inkubator.
    BEMÆRK: Celleadhæsion kan forbedres ved udpladning på fibronectin, collagen, polylysin eller celler og væv klæbemiddel (se Materialer tabel).
  3. Når cellerne har dannet en sammenflydende lag de er klar til GJIC undersøgelse.

2. Elektroporation Procedure

Kan gennemføres Elektroporering for GJIC undersøgelse uden for en laminar flow hætte,da det tager kun et par minutter. Hvis længere inkubationstider er nødvendige for et bestemt eksperiment, så det kan være helt udføres i en laminar strømningshætte. I alle tilfælde skal de kamre, hvor cellerne dyrkes være steril.

  1. Forbered en 5 mg / ml Lucifer gul opløsning: Opløs 10 mg LY pulver (leveres med elektroporator) i 2 ml Calcium-fri vækstmedium. Til eksperimenter, der kræver længere inkubationstider, filter-sterilisere opløsningen og opbevares ved 4 ° C.
  2. Aspirer vækstmediet og vaske cellerne med calcium-frit medium, være omhyggelig med ikke at ridse monolag eller tørre cellerne. Hvis cellerne tørres de normalt har mørkere kerner og afhente LY uden elektroporation. Effekten er mere udtalt i midten af dias, som er mere udsat for luft udkast (Figur 4F).
  3. Med en Eppendorf pipette, pipette farveopløsningen til cellerne (400 ul for hele kammer), på kanten af ​​kammeret, Being Pas på ikke at røre ved cellelag.
  4. Placer kammer i holderen leveres med elektroporator og anvende en puls af en passende styrke (se Diskussion).
  5. Aspireres forsigtigt nogle af LY opløsning. Det kan genbruges en anden gang for mindre vigtige eksperimenter.
  6. Tilføj Calcium-fri DMEM indeholdende 10% dialyseret serum.
  7. Inkubér cellerne i 3-5 minutter i inkubatoren for at tillade farvestoffet overførsel via gap junctions.
    BEMÆRK: Optagelsen af ​​dialyserede serum på dette tidspunkt hjælper pore lukning.
  8. Vask det personlige farvestof med calcium-DMEM for levende celle observation. Alternativt kan celler fastsættes på dette tidspunkt ved tilsætning af 4% formaldehyd til brønden, og derefter vasket med PBS (phosphatbufret saltvand). I alle tilfælde vask skal fjerne alle baggrund.
    BEMÆRK: I indledende forsøg for at bestemme de optimale betingelser, hvis spændingen er for lav, så er det muligt at lade cellerne komme i incubator for et par minutter og elektroporere samme dias en anden gang, for at spare på udgifterne til dias.

3. Mikroskopisk Undersøgelse

  1. Følg cellerne under fluorescensbelysning anvendelse af et inverteret mikroskop udstyret med et passende filter for farvestoffet, der anvendes. For Lucifer gul, magnetisering er 423nm, emission 555nm, WBV filter til et Nikon IX70 mikroskop.
  2. Eliminer menisk effekter ved at placere et glas cover-slip på toppen af ​​plast godt, efter at udfylde det til toppen med væske, for at undersøge celle morfologi under fase kontrast. For bedre billeder, kan det meget vel blive løsrevet fra dias og dækglasset placeres på rammen. For fikserede celler, kan det godt være fyldt med glycerol til mikroskopisk observation, mens for levende celler, det skal fyldes med vækstmedium.
    BEMÆRK: Vask og fotografere er nemmere hvis cellerne fikseret med formaldehyd efter overførsel af farvestoffet (trin 2.7 ovenfor). Hvis cellerne ikket fast fluorescens fjernes fra cellerne inden for ca 60 minutter afhængigt af den celletype, spænding og mængden af ​​LY indført mens fikserede celler fluorescens opbevares i flere timer. Men fluorescens svinder eller forsvinder efter O / N-inkubation, selv i faste celler. Af denne grund skal fotografier tages hurtigt efter elektroporation (figur 2).

4. Kvantificering af intercellulær kommunikation

  1. Fotografere cellerne med et 20x objektiv under fluorescens og fasekontrast (Figur 3).
  2. Identificere og markere med en stjerne de elektroporerede celler ved grænsen med den ikke-elektroporerede område (figur 2, pil, elektroporation kant).
  3. Identificere og markere med en prik fluorescerende celler på den ikke-elektroporerede side, hvor farvestoffet har overført gennem gap junctions (figur 3A og 3B).
  4. Divider det samlede antalfluorescerende celler på ikke-elektroporerede område med antallet af elektroporerede celler langs kanten (figur 3A og 3B).
    BEMÆRK: Overførslen fra mindst 200 sammenhængende elektroporerede grænsekontrol celler beregnes for hvert forsøg. Den fremkomne er GJIC værdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 viser rottelever epitelial T51B celler 22, elektroporeret med LY og fotograferet under fluorescens (panel A og B) eller fasekontrast (C) belysning, efter fiksering og vask. I panel A er kanten af ​​den elektroporerede område markeret med rødt. Gradienten af ​​fluorescens til højre for den røde linje betegner overførsel via gap junctions. I figur 3A og 3B er kvantificering af kløften forbindelsesepitop kommunikation er vist: Cellerne på kanten af den elektroporerede område blev identificeret og markeret med en stjerne, mens celler, hvor farvestoffet havde overført blev markeret med en prik. Forholdet viser det gennemsnitlige antal af celler, som farvestoffet overført til pr elektroporeret kant celle. I dette eksempel er der 57 prikker og 10 stjerner, dvs GJIC = 5,7.

I C og D, den signaltransducer og transkriptionsaktivator-3 (Stat3) er blevet nedreguleret i T51B celler through stabil siRNA udtryk med en lentiviral vektor, og dette medfører en reduktion i GJIC, som vist ved fravær af overførsel 22.

Figur 1
Figur 1. Elektroporation elektrode og dias samling. (A) oven: Celler dyrkes på et objektglas belagt med ledende og transparent indium-tin-oxid (ITO). En plastik kammer er bundet på slæden, til dannelse af en beholder til cellerne og LY. Belægningen er laser-ætset i en lige linje i midten, i det væsentlige danner to elektroder. En dæmning bruges til at aflede de nuværende opad, således at der skabes en skarp overgang i elektriske felt intensitet. At give ikke-ledende områder er ITO også ætset i to rektangler. Aktuelle (røde pile) fra impulsgeneratoren flyder fra hvert kontaktpunkt til den anden, via en ledende hovedvej mellem rektanglerne, breder sig i et direkteion parallelt med den midterste barriere, derefter over dæmningen gennem mediet til den anden side, elektroporering cellerne i områder parallelt med dæmningen. For overskuelighedens skyld er den forreste del af kammeret fjernes (B) Side view.: Slæden med cellerne vokser på ITO-overtrukket (lys grøn) og ætset, nøgne glas regioner er vist. Når elektroporation medium indeholdende LY tilsættes til kammer til et niveau over højden af ​​dæmningen derefter en elektrisk bane mellem elektroderne (+) og (-), og de celler, der vokser i dette område, er dannet. Bemærk, at ITO lag er vist med overdreven tykkelse for klarhed, selv om den faktiske tykkelse (800 A) er meget mindre end tykkelsen af cellerne. (C) Arealet af elektroporerede og ikke elektroporerede celler er vist forstørret. Farvestoffet er tæt nær dæmningen, hvor alle celler blev elektroporeret og svinder hen over elektroporerede kant som koncentrationen svækkes gennem flere gap junction Transfter. Store pile viser retningen af ​​farvestof overførsel via gap junctions. Bemærk, at størrelsen og tykkelsen af cellerne overdrevet for klarhed. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Elektroporation af T51B, rottelever epitelceller. LY blev elektroporeret ind T51B rottelever epithelceller (mild, 12 volt). Efter 5 min. inkubation blev cellerne fotograferet under fluorescens (A, B) eller fasekontrast (C) belysning. Bemærk omfattende overførsel via gap junctions, vist ved gradienten af fluorescens, der strækker sig fra kanten af den elektroporerede område (pile, rød linje A). På samme tid, er der ingen synlige skader på celler er en s ses under fasekontrast (C). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Kvantificering af gap junction-overførsel. Cellerne på kanten af ​​den elektroporerede område, der hentede LY ved elektroporation (donorer af LY til den ikke-elektroporerede celler) blev markeret med en stjerne. Celler, hvor LY overført til gennem gap junctions blev markeret med en prik. I (A) og (B), der er 57 prikker og 10 stjerner, dvs GJIC = 5,7. Celler i (C) og (D) ikke har gap junctions, som vist ved fraværet af en gradient af fluorescens. Pile peger på kanten af ​​det elektroporerede område. Bar = 100 um.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. (A) T51B celler, der er blevet beskadiget ved skrabning under manipulation. Disse celler kan afhente LY selv uden elektroporation og kan overføre det til deres naboer gennem gap junctions. (B) og (C) Celler beskadiget af en puls, der er for stærk. (B) T51B rottelever epitelceller blev elektroporeret ved mild indstilling , 20 volt. Cellerne på den venstre side af den ætsede linje (pil) er blevet beskadiget af elektroporation. I dette tilfælde cellerne ikke løsnes, men et nærmere blik på fotografiet fasekontrast (midterste panel, hvid pil) viser, at cellerne har mørke kerner, mens de fluorescerer meget svagt, om overhovedet (øverste panel). Dog overføres thru gap junctions er indlysende, at cellerne på den højre side, der ikke er elektroporeret. Den nederste fotografi blev fremstillet ved at kombinere UV og fasekontrastbelysning at lette visning af kanten af elektroporation. (C) T51B rottelever epitelceller elektroporeret ved middel indstilling, 30 volt. Cellerne på den venstre side af den ætsede linje er blevet alvorligt beskadiget af pulsen. Bemærk, hvordan cellerne er kommet ud og fluorescerer ikke. Nogle overlevende omkring kanten har samlet op LY og synes at være at overføre det til deres naboer til højre via gap junctions. (D) T51B celler elektroporeret med 10 ug / ml Propidiumiodid. Bemærk den intense farvning af kerner. (E) kupler af epitelceller. T51B celler elektroporeret ved mild indstilling, 15 volt. Bemærk selv elektroporering af celler til venstre. Men når sammenflydende, T51B celler danner kupler, der kan komme ud under manipulation og vask, og de omkringliggende celler kan take op LY. Bemærk omfattende farveafsmitning. (F) Celler, der har tørret kan afhente LY uden electroporation.The Vækstmediet blev fjernet fra T51B og celler blev efterladt i et laminar flow hætte i 30 minutter. LY blev efterfølgende tilsat til cellerne i 1 minut, og cellerne blev efterfølgende fast, vasket og fotograferet under fluorescens (øverste panel) eller fase-kontrast (nederste panel) belysning. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Grb2-SH2 blokering peptid inhiberer EGF-medieret Erk aktivering i intakte, levende celler. Kombination af GJIC og signaltransduktion studier. Efter ligandbinding, et antal vækstfaktorreceptorer, såsom epidermal vækstfaktor Receptor (EGFR) er trans-phosphorylerede på specifikke tyrosinrester. Disse udgør docking sites for Src-homologi-2 domæner af signaltransducere såsom Grb2, som er bundet til GTP / GDP udveksling faktor sos, som dermed er bragt til membranen og aktiverer Ras. Dette resulterer i aktivering af Raf / Mek / Erk kaskade og phosphorylering af Erk til en P TE P Y sekvens. Derfor kan sondering med specifikke phospho-Erk antistoffer være et mål for aktivering af EGF-receptoren. Efter fiksering cellerne probet med et anti-Perk antistof (cellesignalering), efterfulgt af en biotin-koblede sekundære antistof, streptavidin-hest-raddish peroxidase og diaminobenzidin-substrat, hvilket giver en brun farve 29. I dette forsøg blev en phosphopeptid blokerer Grb2-SH2-domænet (PVPE s Y INQS) indført ved in situ elektroporation into NIH 3T3 celler, der vokser i elektroporation kamre og vækst-anholdt i brugt medium. 5 min efter pulsen ansøgning blev celler stimuleret med EGF i 5 min, faste, probet for aktiveret phospho-Erk1 / 2 ved immunperoxidase stainingand celler fra samme område fotograferet under lysfelt (øverst) eller fasekontrast (nederst) belysning. Bemærk, at Grb2-SH2 blokerende peptid dramatisk reduceret signal EGF, dvs Erk phosphorylering (område a). Inhiberingen af ​​signalet strækker til ~ 3-4 rækker af tilstødende celler i den ikke-elektroporerede område (bølgede beslag), sandsynligvis på grund af bevægelse af 1123 Da peptidet via gap junctions. Denne konstatering udgør overbevisende dokumentation for, at den observerede hæmning må skyldes peptidet, snarere end en artefakt af elektroporation, da celler i dette område ikke modtog nogen strøm, men erhvervede peptidet fra deres naboer. På samme tid, er der ingen påviselig virkning på cellemorfologi somvist ved fasekontrast. Pil peger på kanten af ​​det elektroporerede område. Forstørrelse: 240x. For flere detaljer og kontroller se reference 29. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Elektroporerede materiale
Renheden af ​​det materiale, der skal elektroporeres er meget vigtigt. Hvis cellerne er meget flade, skal anvendes derefter højere koncentrationer af sporingsfarve (op til 20 mg / ml LY), og i sådanne tilfælde, renhed er endnu vigtigere end i celler med en mere sfærisk form 1. Udover LY en lang række andre farvestoffer eller nonpermeant molekyler er blevet anvendt, såsom en række af Alexa farvestoffer til brug som prober til kanaler, der består af forskellige connexins 25. Imidlertid er farvestoffer, såsom ethidiumbromid eller propidiumiodid indskudt i DNA, således at kerner fluorescerer kraftigt, hvilket gør kvantificering af farveoverførsel vanskeligere (figur 4D). Tracking farvestoffer skal udarbejdes og vasker gennemført i Calcium-frit vækstmedium, fordi en calciumindstrømningen kan afbryde forbindelsesepitop kommunikation, samt reducere cell levedygtighed. Alle opløsninger skal opbevares ved 37 ° C før elektroporering, hvilket letter pore lukning og levedygtighed 1.

Bestemmelse af den optimale spænding og kapacitans
Elektrisk feltstyrke er en kritisk parameter for celle gennemtrængning samt levedygtighed. Anvendelsen af ​​multiple pulser har vist sig at give bedre resultater med hensyn til gennemtrængning og cellelevedygtighed end en enkelt impuls. Den Insitu Porator apparater Cell Projekter har tre indstillinger for kapacitans og puls nummer: Mild (10 pulser, 10 mikrosekunder hinanden, 0,1 sek mellem pulser), Medium (20 pulser, 80 mikrosekunder hinanden, 0,2 sek mellem pulser) og stærk (50 puls , 120 mikrosekunder hinanden, 0,5 sek mellem impulser), mens spænding kan fint styres uafhængigt (2-45V). Faktisk flade celler kræver lavere spændinger end transformerede dem, celler i en klump eller celler med et lille vedhæftning område til underlaget (f.eks insekt Sf9-celler), Muligvis på grund af de større mængder af strøm, som passerer gennem en udvidet celle, der er i kontakt med en større ledende område. For yderligere oplysninger om dette emne, se 1.

Potentielle problemer og fejlfinding

Hvis cellerne er blevet skrabet under manipulationer kan de opfanger farvestoffet og fluorescerer uden elektroporering (figur 4A). Den mængde energi, der leveres til cellerne påvirker effektiviteten af ​​elektroporation. Hvis pulsen er for svag (dvs. for lav spænding og pulsindstillinger), hvorefter cellerne synes normal under fasekontrast, men de fluorescerer ikke, måske med undtagelse af visse celler, der kan være døde eller er blevet skrabet under manipulation (figur 4A) . Hvis pulsen er for stærk, under fasekontrast-celler synes at have meget mørke kerner (figur 4B), men kan bevare en vis LY, og tillader endda nogle farveoverførsel til naboceller. På tærsklenn højere impulser cellerne er ødelagt (Figur 4C). Sådanne celler lyseres, derfor har de ikke beholde LY og fluorescerer meget svagt, om overhovedet. Visse epitelcellelinier såsom T51B formular dome strukturer, som kan komme ud i løbet mellemstore ændringer. De omgivende celler kan derefter fluorescerer som farvestof kan overføres via gap junctions (Figur 4E). Eksempler på optimale elektroporation betingelser for repræsentative linier er vist i tabel 1.

Fordele i forhold til andre teknikker og betydning

DNA-introduktion
Der er et stort antal transfektionsprotokoller, såsom calcium-phosphat-co-udfældning 26 eller flere forskellige typer af liposomer. De kan imidlertid påvirke celle i subtile måder, der kan være meget vigtigt, især for signaltransduktion studier. For eksempel, Tyr-705-phosphorylering af signaltransducer og aktivator for udskriftion-3 (Stat3), som korrelerer med dets transkriptionsaktivitet forøges dramatisk ved proceduren af ​​calcium-fosfat transfektion selv i fravær af DNA. Dette kan skyldes det faktum, at bundfaldet ændrer celle til celle adhæsion og cadherin indgreb, en kendt Stat3 aktivator 27. Visse liposomer havde en lignende, men mindre udtalt effekt, mens elektroporation eller retroviral infektion ikke påvirker STAT3 niveauer 6.

Indførelsen af peptider
En almindelig fremgangsmåde er opbygningen af ​​et fusionspeptid med sekvenser, der krydser cellemembranen, som er afledt af HIV-tat-genet. Men overførsel gennem membranen er en forholdsvis langsom proces, og signalet hæmning ikke er så effektiv. Til undersøgelse af sekvensen af ​​begivenheder følgende receptor-aktivering af en ligand, evne til øjeblikkelig indførelse af et peptid, peptidmimetisk eller anden forbindelse er en vigtig advantage. Elektroporation af en celle-permeabel peptid at fremskynde optagelsen ikke er muligt, sandsynligvis fordi den lipofile peptid er indlejret i cellemembranen, som afsløret med FITC-koblede peptider (Raptis, upubliceret). Det er interessant at bemærke, at inhibering af Erk aktivering af EGF ved anvendelse af en celle-permeable peptid blokerer Grb2-SH2-domænet for eksempel, var kun delvis 28, medens elektroporering af det samme peptid opnået en fuldstændig inhibering af signalet 29 ( figur 5). Andre teknikker, der er baseret på liposomer er også eksisterer. Men de ikke mulighed for at undersøge ubehandlede celler ved siden af hinanden med behandlede dem, sammenholdt med gap junction undersøgelser, som kan tilbyde den stærkest mulige påvisning af, at signalet hæmning må skyldes det materiale, der blev indført (figur 5, bølgede beslag c).

Gap junction undersøgelser
Mikroinjektionaf farvestoffer eller skrab-loading er almindeligt anvendt, men de uvægerligt indføre cellulære skader. En anden teknik, fluorescens bedring efter fotoblegning er ikke invasive men det kræver dyrt udstyr, og få celler kan undersøges på et tidspunkt, mens dannelsen af ​​fototoksiske stoffer kan være et problem. Faldskærmen assayet består af forbelastning celler med farvestoffet calcein AM (grøn), og derefter at lade cellerne klæber på et cellelag, som mellemrumsforbindelser dannes inden for 15 min-3 timer. Et stort antal celler kan behandles på denne måde, men cellernes evne til at danne gap junctions i dette assay varierer enormt med celletypen 30.

Begrænsninger

Den krævede spænding er højere for indførelse af molekyler af større størrelse og elektriske ladninger. Ved de høje spændinger, der er nødvendige for at indføre store plasmider, kan der være nogle celledød. De relative spændinger nødvendige for forskellige molekylerer blevet beskrevet tidligere 9,12. Selvom vi beskrive elektroporering under anvendelse af en specifik elektroporeringsapparat, er det muligt for en person med erfaring med elektriske apparater til at gøre det ved hjælp af den detaljerede beskrivelse i 19, eller lave en enklere opbygning med en øverste elektrode over cellerne, og ætse med syre 1.

Fremtidige retninger

Software er blevet udviklet til præcist at kvantificere GJIC 31. En yderligere forbedring er udviklingen af ​​kvanteprikker der fluorescerer kun når de er i cellen, således at der ikke er behov for at vaske ikke-inkorporeret farvestof. Dette undgår stress af vask, mens processen kan iagttages i levende, ikke fikserede celler i realtid. Indførelsen af peptider for at afbryde signalveje er en kraftfuld metode til in vivo-vurdering af relevansen af interaktioner identificeret ved anvendelse af oprensede komponenter. Undersøgelsen af ​​pottendifferens- af forskellige peptider til at hæmme en bestemt vej er det første vigtige skridt i udviklingen af ​​peptidomimetiske stoffer, for rationel behandling af neoplasi.

Andre bemærkninger

Objektglassene kan vaskes med Extran-1000 opløsning med en lille pensel nå ITO overflade i brønden, og skylles med vand. Hvis cellerne er blevet fastsat på dias, kan det være nødvendigt at fjerne spor af protein med trypsin eller andre proteolytiske enzymer først. Natriumdodecylsulfat indeholdende rengøringsmidler bør undgås. Vaskede dias kan steriliseres med peroxid gas. Men det er meget vigtigt at undgå at bryde forseglingen af ​​brønden på dias, fordi hvis nogen LY løsning lækager i holderen, kan det forårsage en kortslutning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro http://www.cellgro.com/ 50-013-PB
DMEM without Calcium Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) SH30319-01
Donor Calf Serum  PAA: http://www.paa.com/ Cat.# B15-008
Fetal Bovine Serum PAA: http://www.paa.com/ Cat.# A15-751
Electroporation apparatus Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ ACE-100
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-04-CC 4-wells
Chambers Cell Projects Ltd UK ACE-08-CC 8-wells
Lucifer Yellow Cell Projects Ltd UK ACE-25-LY High purity
CelTak BD Biosciences 354240 Cell and tissue adhesive
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Collagen BD Biosciences 354236
Poly-Lysine Sigma Aldrich P8920

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
  2. Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
  3. Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
  4. Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
  5. Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. Ets up-regulates met transcription. Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).
  6. Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
  7. Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
  8. Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
  9. Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
  10. Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
  11. Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
  12. Raptis, L., Firth, K. L. Electroporation of adherent cells in situ. DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).
  13. Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
  14. Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. Gap junctions. Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  15. Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
  16. Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  17. Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
  18. Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
  19. Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
  20. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
  21. Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
  22. Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
  23. Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
  24. Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
  25. Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
  26. Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
  27. Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
  28. Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
  29. Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
  30. Meda, P. Assaying the molecular permeability of connexin channels. Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).
  31. Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
  32. Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
  33. Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
  34. Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
  35. Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).

Tags

Molekylær Biologi elektroporering Indium-tin-oxid signaltransduktion kløften forbindelsesepitop kommunikation peptider STAT3
Et funktionelt assay til Gap forbindelsesepitop Undersøgelse; Elektroporation af adhærerende celler på indium-tin-oxid
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geletu, M., Guy, S., Firth, K.,… More

Geletu, M., Guy, S., Firth, K., Raptis, L. A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide. J. Vis. Exp. (92), e51710, doi:10.3791/51710 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter