Introduction
De toepassing van elektrische stroom aan een cel leidt tot de vorming van poriën in het celmembraan, een werkwijze genoemd elektroporatie. De poriën laten de passage van verschillende nonpermeant moleculen door het membraan. Het elektrische veld kan nauwkeurig worden geregeld, zodat de poriën gevormd zijn erg klein en hersluiten snel, met minimale verstoring van de cellulaire fysiologie. Interessant is dat hechtende cellen worden gekweekt op een glasplaatje gecoat met geleidend en transparant indium-tin oxide (ITO) en geëlektroporeerd in situ, dat op het oppervlak waar ze groeien, zonder los te geëlektroporeerd in suspensie. Cellen kunnen goed groeien op dit oppervlak, en als deze zijn bevestigd en uitgebreid, gedetailleerde microscopische waarneming mogelijk. Met deze techniek kunnen kleine nonpermeant moleculen direct worden ingevoerd en in wezen 100% van de cellen, dat deze techniek bijzonder geschikt voor studies op de activatie van beeld metonents van een traject na ligand stimulatie van een receptor (beoordeeld in 1).
Elektroporatie wordt meestal gebruikt voor de introductie van DNA (ook wel electrotransfection). Echter, elektroporatie in situ waardevol voor de invoering van een grote verscheidenheid van moleculen, zoals peptiden 2-4, oligonucleotiden zoals antisense RNA, dubbelstrengs DNA decoy-oligonucleotiden kunnen remmen transcriptiefactor binding of siRNA 3,5, 6, radioactieve nucleotiden 7-10, eiwitten 11 12 of pro-drugs 13. Na elektroporatie, kunnen cellen worden gelyseerd voor biochemische analyses en gefixeerd en gekleurd met antilichamen.
De geleidende ITO coating is zeer dun, 800-1,000Å, waardoor celgroei niet wordt verstoord door het hoogteverschil van de twee oppervlakken, als de cellen groeien over de rand van de geleidende coating. Dit biedt het voordeel dat niet-electroporated cellen kunnen worden gekweekt zij aan zij met geëlectroporeerd degenen, om te dienen als controle. Dezelfde benadering kan worden gebruikt voor het onderzoek van spleetovergangen, intercellulaire communicatie (GJIC), zoals beschreven in de Video.
Gapjuncties zijn kanalen verbinden het interieur van aangrenzende cellen 14. Spleetovergangen, intercellulaire communicatie speelt een belangrijke rol in tumorvorming en metastase, terwijl oncogenen zoals Src onderdrukken GJIC 15,16. Om GJIC onderzoeken van een fluorescente kleurstof zoals Lucifer geel (LY) wordt vaak geïntroduceerd in gekweekte cellen door micro-injectie of schrapen laden 17 en de diffusie van de kleurstof in naburige cellen microscopisch waargenomen onder fluorescentieverlichting. Deze technieken echter steeds celbeschadiging veroorzaken. We beschrijven nu een techniek waarbij cellen worden gekweekt op een glasplaatje dat gedeeltelijk bedekt met ITO 18. Een elektrische puls wordt toegepast in aanwezigheid van LY (of andere kleurstoffen) camet de penetratie in de cellen groeien op het geleidende deel van de schuif, terwijl kleurstofmigratie van de aangrenzende, niet-geëlektroporeerde cellen microscopisch waargenomen door fluorescentieverlichting. Om storende gevoelige cellen die de neiging hebben los te maken van de monolaag te voorkomen, een samenstel is gemaakt dat geen elektrode nodig was om bovenop de cellen voor toepassing van de elektrische stroom 19 worden geplaatst. Deze benadering biedt de mogelijkheid om GJIC kwantificeren in een groot aantal cellen, zonder meetbare verstoring van cellulair metabolisme, zoals aangegeven door de afwezigheid van een effect op de lengte van de G1 fase na stimulatie serum 12, verhoging in de niveaus van de fos protooncogen eiwit (Raptis, ongepubliceerd) of twee kinasen geassocieerd met cellulaire stress, de p38 varken of JNK / SAPK kinase 1. Deze aanpak kan het onderzoek van het verband tussen de niveaus van oncogene expressie, transformatie en GJ gemaaktIC 18, en het effect van Src en Stat3 op GJIC in verschillende celtypen, waaronder vers gekweekte cellen van long tumor specimens 20-23. Bovendien, in situ elektroporatie met de instellingen beschreven die een bovenste elektrode is met succes toegepast voor het aantonen van gap junction sluiting tijdens adipocytic differentiatie mist, hoewel cellulaire hechting aan het substraat wordt verkleind dat stadium 19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Plating de cellen in de Electroporatie Chambers
- In een laminaire stroming kap, trypsinize de cellen met behulp van steriele techniek gebruikelijk.
Opmerking: Het is belangrijk te elimineren door centrifugeren alle sporen van trypsine, deze kunnen belemmeren spreiding van de cellen op het glas, waardoor de vorming van adherens en gap junctions. - Pipetteer 1 ml van de celsuspensie in de steriele elektroporatie kamers voorzien van de in situ electroporator (figuur 1), en in een 37 ° C, CO2 incubator.
OPMERKING: Cel adhesie kunnen worden verbeterd door uitplaten op fibronectine, collageen, poly-lysine of cellen en weefsel lijm (zie Materialen tabel). - Wanneer de cellen een confluente laag gevormd zijn, klaar voor GJIC onderzoek.
2 elektroporatieprocedure
Elektroporatie voor GJIC onderzoek kan worden uitgevoerd buiten een laminaire stroming kap,want het duurt slechts een paar minuten. Indien langere incubatietijden vereist voor een bepaald experiment, dan kan geheel worden uitgevoerd in een laminaire stroming kap. In alle gevallen moet de kamers waarin de cellen worden gekweekt steriel zijn.
- Bereid een 5 mg / ml Lucifer gele oplossing: Los 10 mg poeder LY (voorzien van de electroporator) in 2 ml-Calcium gratis groeimedium. Voor experimenten die langere incubatietijd nodig, filter-steriliseren van de oplossing en bewaar bij 4 ° C.
- Zuig het groeimedium en was de cellen met calcium vrij medium, en let niet te krassen op de monolaag of drogen de cellen. Als de cellen worden gedroogd ze hebben meestal donkerder kernen en pick-up LY zonder elektroporatie. Het effect is meer uitgesproken in het midden van de schuif die meer is blootgesteld aan luchtstromen (Figuur 4F).
- Met een Eppendorf pipet, pipet de kleurstofoplossing aan de cellen (400 ul voor de gehele kamer), aan de rand van de kamer, bAanspreekbaar voorzichtig dat u de cellaag raken.
- Plaats de kamer in de met de electroporator meegeleverde houder en een puls van de juiste sterkte (zie Discussie) van toepassing.
- Zuig voorzichtig enkele LY oplossing. Het kan worden hergebruikt nogmaals minder belangrijke experimenten.
- Add-Calcium DMEM dat 10% gedialyseerd serum.
- Incubeer de cellen gedurende 3-5 min in de incubator kleurstofoverdracht via gap juncties laten.
OPMERKING: De opname van gedialyseerd serum op dit moment helpt de poriën sluiten. - Was het niet opgenomen kleurstof met Calcium DMEM voor live cell observatie. Alternatief kunnen cellen worden vastgesteld in dit stadium, door toevoeging van 4% formaldehyde aan het goed, dan gewassen met PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing). In alle gevallen moet het wassen alle achtergrond te verwijderen.
Opmerking: In preliminaire experimenten om de optimale omstandigheden te bepalen, of de spanning te laag is, dan is het mogelijk om de cellen te laten herstellen de incubator voor een paar minuten en electroporate dezelfde dia een tweede keer, om te besparen op de kosten van de dia's.
3 microscopisch onderzoek
- Let op de cellen onder fluorescentieverlichting, met een omgekeerde microscoop uitgerust met de geschikte filter voor de kleurstof wordt gebruikt. Voor Lucifer geel, excitatie is 423nm, 555nm emissie, WBV-filter voor een Nikon IX70 microscoop.
- Elimineer meniscus effecten door een glazen deksel-slip bovenop de plastic goed, na het vullen aan de top met vloeistof, zodat celmorfologie onder fasecontrast onderzoeken. Voor betere beelden, kan het goed worden losgemaakt van de glijbaan en het dekglaasje geplaatst op het frame. Voor vaste cellen, kan de put gevuld met glycerol voor microscopische waarneming, terwijl levende cellen moet worden gevuld met groeimedium.
OPMERKING: Wassen en fotograferen is gemakkelijker als de cellen gefixeerd met formaldehyde na de overdracht van de kleurstof (stap 2.7). Als de cellen niett vastgesteld fluorescentie wordt uit de cellen in ongeveer 60 minuten, afhankelijk van het celtype, spanning en hoeveelheid LY geïntroduceerd terwijl gefixeerde cellen fluorescentie wordt gehandhaafd gedurende verscheidene uren. Echter, fluorescentie vervaagt of verdwijnt na O / N incubatie, zelfs in gefixeerde cellen. Daarom, foto's moeten worden snel na elektroporatie (figuur 2) genomen.
4 Kwantificering van intercellulaire communicatie
- 's De cellen met een 20x objectief onder fluorescentie en fasecontrast (figuur 3).
- Identificeren en markeren met een ster de geëlektroporeerde cellen op de grens met de niet-geëlektroporeerde gebied (figuur 2, pijl, elektroporatie rand).
- Identificeren en markeren met een stip fluorescerende cellen bij de niet-geëlektroporeerde kant, waar de kleurstof overgedragen via gap junctions (Figuren 3A en 3B).
- Verdeel het totaal aantalfluorescerende cellen op de niet geëlektroporeerd gebied door het aantal geëlektroporeerde cellen langs de rand (figuren 3A en 3B).
Opmerking: De transfer van ten minste 200 aaneengesloten geëlektroporeerde cellen rand wordt berekend voor elk experiment. Het aantal verkregen is de GJIC waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont rattenleverepitheliale T51B cellen 22 geëlektroporeerde LY en gefotografeerd onder fluorescentie (paneel A en B), of fase-contrast (C) belichting, na fixatie en wassen. In paneel A, wordt de rand van de geëlectroporeerd gebied gemarkeerd in het rood. De helling van fluorescentie aan de rechterkant van de rode lijn geeft de overdracht via gap junctions. In figuur 3A en 3B, is de kwantificering van gap junctions communicatie getoond: De cellen aan de rand van het geëlektroporeerde gebied werden geïdentificeerd en gemarkeerd met een ster, terwijl cellen waarin de kleurstof had overgedragen werden gemerkt met een stip. De verhouding geeft het gemiddelde aantal cellen dat de kleurstof overgebracht in, per geëlektroporeerd rand cel. In dit voorbeeld zijn er 57 punten en 10 sterren, dwz GJIC = 5.7.
In C en D, de Signal Transducer en Activator van de transcriptie-3 (Stat3) is downregulated in T51B cellehrough siRNA stabiele expressie met een lentivirale vector, en dit veroorzaakt een vermindering van GJIC, zoals blijkt uit de afwezigheid van overdracht 22.
Figuur 1 Electroporatie elektrode en dia montage. (A) Bovenaanzicht: Cellen worden gekweekt op een glasplaatje, bekleed met geleidende en transparante indium-tin oxide (ITO). Een plastic kamer wordt gebonden op de glijbaan, een container voor de cellen en LY vormen. De coating is laser geëtst in een rechte lijn in het midden wezen die twee elektroden. Een dam wordt gebruikt om de huidige opwaarts leiden, waardoor een scherpe overgang elektrische veldsterkte maken. Naar niet-geleidende gebieden bieden, wordt de ITO ook geëtst in twee rechthoeken. Huidige (rode pijlen) van de pulsgenerator stroomt uit elk contactpunt met de andere, via een geleidende weg tussen de rechthoeken, uitspreiden in een directeion evenwijdig aan het midden barrière vervolgens via dam door het medium aan de andere kant, electroporating de cellen in gebieden evenwijdig aan de dam. Voor de duidelijkheid, wordt het voorste deel van de kamer verwijderd (B) Zijaanzicht.: De dia met de cellen groeien op de ITO coating (lichtgroen) en geëtst, kale glas gebieden worden getoond. Wanneer de elektroporatie medium dat LY de kamer wordt toegevoegd tot een niveau boven de hoogte van de dam dan een elektrische baan tussen de elektroden (+) en (-), en de cellen groeien in dit gebied wordt gevormd. Merk op dat de ITO laag wordt getoond met overdreven dikte duidelijkheid hoewel het feitelijke dikte (800 A) is veel kleiner dan de dikte van de cellen. (C) Het gebied van geëlektroporeerd en niet geëlektroporeerde cellen wordt vergroot getoond. De kleurstof is dicht bij de dam waarin alle cellen geëlektroporeerd en verdwijnt in de geëlektroporeerd rand als de concentratie verzwakt door meerdere gap junction transfers. Grote pijlen geven de richting van de kleurstof overdracht via gap junctions. Merk op dat de grootte en de dikte van de cellen worden overdreven voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 Elektroporatie van T51B, rattenleverepitheliale cellen. LY werd geëlektroporeerd in T51B rattenleverepitheliale cellen (mild, 12 volt). Na een 5 minuten. incubatie werden de cellen gefotografeerd onder fluorescentie (A, B) of fasecontrast (C) verlichting. Opmerking uitgebreide doorvoersnelheid gap junctions, blijkt uit het verloop van de fluorescentie, die zich vanaf de rand van het geëlektroporeerde gebied (pijlen, rode lijn A). Op hetzelfde moment is er geen zichtbare schade aan de cellen een s gezien onder fase-contrast (C). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Kwantificering van gap junction overdracht. De cellen aan de rand van het geëlektroporeerde gebied dat opgepikt LY door elektroporatie (donors van LY met de niet geëlektroporeerde cellen) werden gemarkeerd met een ster. Cellen waar LY overgebracht naar door gap junctions werden gemerkt met een stip. In (A) en (B), zijn er 57 punten en 10 sterren, dwz GJIC = 5.7. Cellen van (C) en (D) geen gap junctions, zoals blijkt uit de afwezigheid van een gradiënt van fluorescentie. Pijlen wijzen naar de rand van het gebied geëlektroporeerd. Bar = 100 urn.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 (A) T51B cellen die zijn beschadigd door schrapen tijdens manipulatie. Deze cellen kunnen ophalen LY zelfs zonder elektroporatie en kunnen deze naar hun buren via gap junctions. (B) en (C) cellen beschadigd door een puls die te sterk. (B) T51B rattenleverepitheliale cellen werden geëlektroporeerd onder milde instelling , 20 volt. De cellen links van de geëtste lijn (pijl) zijn aangetast door de elektroporatie. In dit geval hebben de cellen niet los, maar een blik op de fasecontrast foto (middenpaneel, witte pijl) toont de cellen donkere kernen, terwijl ze fluoresceren zeer zwak of helemaal niet (bovenste paneel). Echter, de overdracht van eruwe gap junctions blijkt, om de cellen aan de rechterkant die niet geëlektroporeerd. De onderste foto werd gemaakt door het combineren UV en fasecontrast verlichting, om het bekijken van de rand van elektroporatie vergemakkelijken. (C) T51B rattenleverepitheliale cellen geëlektroporeerd bij gemiddelde instelling 30 volt. De cellen links van de geëtste lijn zijn ernstig beschadigd door de puls. Merk op hoe de cellen los komen en niet fluoresceren. Sommige overlevenden rond de rand opgepikt LY en lijken te doorgeven aan hun buren rechts via gap junctions. (D) T51B cellen geëlektroporeerd met 10 ug / ml propidiumjodide. Let op de intense kleuring van de kernen. (E) koepels van epitheelcellen. T51B cellen geëlektroporeerd onder milde instelling 15 Volt. Merk ook de elektroporatie van cellen links. Echter, wanneer confluent, T51B cellen vormen koepels die uit kunnen komen tijdens manipulatie en wassen, en de omringende cellen kan take up LY. Opmerking uitgebreide kleurstofoverdracht. (F) Cellen die droog kan opvangen zonder LY electroporation.The groeimedium werd verwijderd uit T51B cellen en cellen bleven in een laminaire stroming kap 30 minuten. LY werd vervolgens toegevoegd aan de cellen gedurende 1 minuut en cellen werden vervolgens vast, gewassen en gefotografeerd onder fluorescentie (bovenste paneel) of fase-contrast (onderste paneel) verlichting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 De Grb2-SH2 blokkerende peptide remt EGF gemedieerde Erk activatie in intacte levende cellen. Combinatie van GJIC en signaaltransductie studies. Na ligand binding, een aantal groeifactor receptoren zoals epidermale groeifactor Receptor (EGFR) trans-gefosforyleerd op tyrosine residuen. Deze vormen docking plaatsen voor de Src-homologie 2-domeinen signaal transducers zoals Grb2, die gebonden is aan de GTP / GDP exchange factor sos, die aldus het membraan gebracht en geactiveerd Ras. Dit resulteert in de activering van de Raf / Mek / Erk cascade en fosforylering van Erk op een P TE P Y volgorde. Daarom probing specifieke fosfo-Erk antilichamen kunnen een mate van activering van de EGF receptor. Na fixatie worden cellen gemerkt met een anti-perk antilichaam (Cell Signalling), gevolgd door een biotine-gekoppelde secundaire antilichaam, streptavidine-paard-raddish peroxidase en het substraat diaminobenzidine, dat een bruine kleur geeft 29. In dit experiment werd een fosfopeptide blokkeert het Grb2-SH2 domein (PVPE p Y INQS) werd geïntroduceerd door elektroporatie in situ into NIH 3T3-cellen groeien in elektroporatie kamers en groei-gearresteerd in doorgebracht medium. 5 min na pulse toepassing, werden de cellen gestimuleerd met EGF voor 5 min, vastgesteld gesondeerd voor geactiveerde fosfo-Erk1 / 2 door immunoperoxidase stainingand cellen van hetzelfde veld gefotografeerd onder helderveld (boven) of fasecontrast (onder) verlichting. Merk op dat de Grb2-SH2 blokkeren peptide drastisch het EFG signaal verminderd, dat wil zeggen, Erk fosforylering (gebied A). De inhibitie van het signaal zich in ~ 3-4 rijen aangrenzende cellen in de niet-geëlektroporeerde stippellijn (squiggly bracket) waarschijnlijk door beweging van het 1123 Da peptide via gap junctions. Deze bevinding vormt overtuigend bewijs dat de waargenomen remming moet door het peptide, eerder dan een artefact van elektroporatie, aangezien cellen zich ontving geen stroom, maar het peptide van hun buren overgenomen. Op hetzelfde moment is er geen detecteerbaar effect op cel morfologiegetoond door fasecontrast. Pijl wijst naar de rand van het gebied geëlektroporeerd. Vergroting: 240x. Meer details en de besturingselementen te zien voor referentie 29. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen in het protocol
Geëlektroporeerde materiaal
De zuiverheid van het materiaal dat moet worden geëlektroporeerd is heel belangrijk. Als de cellen zeer vlak, moet dan hogere concentraties van de tracking kleurstof worden (tot 20 mg / ml voor LY) en in dergelijke gevallen zuiverheid nog belangrijker dan in cellen met een bolvorm 1. Naast LY een grote verscheidenheid aan andere kleurstoffen of nonpermeant moleculen zijn gebruikt, zoals een reeks van Alexa kleurstoffen te gebruiken als probes voor kanalen uit verschillende connexines 25. Echter, kleurstoffen zoals ethidiumbromide of propidiumjodide worden ingelast in het DNA zodat de kernen fluoresceren sterk, dat de kwantificering van kleurstofoverdracht moeilijker (figuur 4D) maakt. De tracking kleurstoffen worden bereid en wassingen uitgevoerd in calciumvrij groeimedium, omdat calcium influx junctions communicatie kan onderbreken, evenals vermindering cell levensvatbaarheid. Alle oplossingen moeten bij 37 ° C gehouden voorafgaand aan elektroporatie, welke poriën sluiting en levensvatbaarheid 1 vergemakkelijkt.
Bepaling van de optimale spanning en capaciteit
Elektrische veldsterkte is een kritische parameter voor cel permeatie, en levensvatbaarheid. De toepassing van meervoudige pulsen is aangetoond dat betere resultaten in termen van permeatie en cellevensvatbaarheid dan een enkele puls bieden. De Insitu Porator apparaat van de Cel Projecten heeft drie instellingen voor de capaciteit en het aantal impulsen: Mild (10 pulsen, 10 microseconden uit elkaar, 0,1 sec tussen de pulsen), Medium (20 pulsen, 80 microseconden uit elkaar, 0,2 sec tussen de pulsen) en Sterk (50 pulsen , 120 ps apart, 0,5 sec tussen de pulsen), terwijl de spanning kan onafhankelijk nauwkeurig (2-45V gecontroleerd). In feite, platte cellen vereisen een lagere voltages dan die getransformeerde cellen in een massa of cellen met een kleine hechting vlak voor het substraat (bv, insectencellen Sf9-cellen), Mogelijk als gevolg van de grotere hoeveelheid stroom die door een uitgebreide cel die in contact met een grotere geleidende gebied. Voor meer informatie over dit onderwerp, zie punt 1.
Potentiële problemen en het oplossen van problemen
Als de cellen werden geschraapt tijdens de manipulaties kunnen ze halen de fluorescerende kleurstof en zonder elektroporatie (Figuur 4A). De hoeveelheid energie die aan de cellen invloed op de efficiëntie van elektroporatie. Als de puls te zwak is (dat wil zeggen, een te lage spanning en puls-instellingen), vervolgens de cellen normaal lijken onder fase-contrast-maar ze fluoresceren niet, behalve misschien voor bepaalde cellen die dood kunnen zijn of zijn geschraapt tijdens manipulatie (Figuur 4A) . Als de puls te sterk, onder fasecontrast cellen blijken zeer donkere kernen (figuur 4B), maar sommige LY behouden en zelfs sommige kleurstofoverdracht naar naburige cellen mogelijk. Bij even hogere pulsen de cellen vernietigd (Figuur 4C). Dergelijke cellen zijn gelyseerd daarom geen behouden LY en fluoresceren zeer zwak, of helemaal niet. Bepaalde epitheliale cellijnen zoals T51B dome- structuren die uit zouden kunnen komen mediumveranderingen. De omringende cellen kan dan fluoresceren als de kleurstof kan worden overgedragen via gap junctions (Figuur 4E). Voorbeelden van optimale elektroporatie voorwaarden representatieve lijnen worden weergegeven in tabel 1.
Voordelen ten opzichte van andere technieken en betekenis
DNA introductie
Er is een groot aantal transfectie protocollen, zoals calcium-fosfaat co-precipitatie 26 en verschillende soorten liposomen. Ze kunnen echter wel de cel in subtiele manieren die zeer belangrijk kan zijn, vooral voor signaaltransductie studies beïnvloeden. Bijvoorbeeld, de tyr-705 fosforylering van het signaal transducer en activator van transcriptieion-3 (Stat3) correleert met de transcriptionele activiteit drastisch verhoogd met de werkwijze van calciumfosfaat transfectie zelfs in afwezigheid van DNA. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat de neerslag verandert cel naar cel adhesie en cadherine overeenkomst, een bekende activator Stat3 27. Sommige liposomen hadden een vergelijkbare, maar minder uitgesproken effect, terwijl elektroporatie of retrovirale infectie geen invloed Stat3 niveau 6.
De introductie van peptiden
Een gebruikelijke werkwijze is de constructie van een fusie met peptide sequenties die de celmembraan passeren, zoals afgeleid van het HIV-tat-gen. De overdracht door het membraan is een relatief langzaam proces en signaal remming niet zo efficiënt. Voor de studie van de volgorde van de gebeurtenissen volgende receptor activatie door een ligand, de mogelijkheid voor het direct invoeren van een peptide, peptidomimetisch of andere verbinding heeft een belangrijke advantage. Elektroporatie van een cel-permeabele peptide om haar opname versnellen niet mogelijk, waarschijnlijk omdat de lipofiele peptide is ingebed in het celmembraan, zoals blijkt met FITC-gekoppelde peptiden (Raptis, niet gepubliceerd). Het is interessant dat de remming van Erk activatie van EGF met behulp van een cel permeabele peptide blokkeert het Grb2-SH2 domein bijvoorbeeld slechts gedeeltelijk 28, terwijl elektroporatie van hetzelfde peptide bereikte een volledige remming van het signaal 29 ( Figuur 5). Andere technieken, gebaseerd op liposomen ook bestaan. Echter, ze niet toestaan dat de behandeling van onbehandelde cellen aan de zijde van degenen behandeld, in combinatie met een gap junction studies, waarin de sterkst mogelijke bewijs dat het signaal remming door moet kunnen bieden aan het materiaal dat wordt ingebracht (figuur 5, kronkelende beugel , c).
Gap junction studies
Micro-injectievan kleurstoffen of schrapen-laden worden vaak gebruikt, maar ze steevast introduceren cellulaire schade. Een andere techniek, fluorescentieherstel na fotobleken is niet invasief maar dure apparatuur vereist en weinig cellen kunnen worden onderzocht op een tijdstip, terwijl de vorming van fototoxische stoffen een probleem zijn. De parachute assay bestaat uit voorbelasting cellen met de kleurstof calceïne AM (groen), dan laten de cellen hechten aan een cellaag, gap junctions vormen binnen 15 minuten-3 uur. Een groot aantal cellen kunnen op deze wijze behandeld, maar het vermogen van de cellen om gap junctions vormen in dit assay varieert enorm met het celtype 30.
Beperkingen
De benodigde spanning is hoger voor de introductie van moleculen van groter formaat en elektrische ladingen. Voor deze hoge spanningen vereist zijn om grote plasmiden kan er enige celdood. De relatieve voltages vereist verschillende moleculenzijn eerder beschreven 9,12. Hoewel we beschrijven elektroporatie met een specifiek elektroporatie apparaat, is het mogelijk voor iemand ervaren met elektrische apparaten te maken met behulp van de gedetailleerde beschrijving in 19, of een eenvoudiger opstelling met een bovenste elektrode boven de cellen en etsen met zuur 1.
Toekomstige richtingen
Software ontwikkeld precies te bepalen GJIC 31. Een verdere verbetering is de ontwikkeling van quantum dots die fluoresceren maar zodra ze in de cel, zodat er geen noodzaak om de niet opgenomen kleurstof wassen. Dit voorkomt de spanning wassen, terwijl het proces kan worden waargenomen in levende, niet gefixeerde cellen in real time. De introductie van peptiden aan signaalwegen onderbreken is een krachtige aanpak voor de in vivo beoordeling van de relevantie van de interacties die met gezuiverde componenten. Het onderzoek van de pottiële verschillende peptiden een bepaalde route remmen is de eerste belangrijke stap in de ontwikkeling van peptidomimetische geneesmiddelen voor rationele behandeling van neoplasie.
Andere opmerkingen
De objectglaasjes kunnen worden gewassen met Extran-1000 oplossing met een kleine verfkwast de ITO oppervlak in de put bereikt, en gespoeld met water. Indien de cellen zijn gefixeerd op de dia, kan het nodig zijn om sporen van eiwit eerst verwijderen met trypsine of andere proteolytische enzymen. Natriumdodecylsulfaat wasmiddelen moet worden vermeden. Gewassen dia's kunnen worden gesteriliseerd met peroxide gas. Het is echter belangrijk te voorkomen dat de afdichting van de goed breken op de dia omdat eventuele LY oplossing lekkage in de houder kan een kortsluiting veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
