Deze presentatie demonstreert een methode waarbij elektroporatie van adherante, gekweekte cellen wordt gebruikt voor het bestuderen van intercellulaire, junctionele communicatie, terwijl de cellen groeien op een plaatje dat bedekt is met geleidend en transparant indium-tinoxide.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een functionele test voor Gap Junctionele Onderzoek; Elektroporatie van hechtende cellen op indiumtinoxide
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bij deze techniek worden cellen gekweekt op een glasplaat die gedeeltelijk bedekt is met indium-tinoxide (ITO), een transparant, elektrisch geleidend materiaal. Een verscheidenheid aan moleculen, zoals peptiden of oligonucleotiden, kan op een niet-traumatische manier in wezen 100% van de cellen worden geïntroduceerd. Hier beschrijven we hoe het kan worden gebruikt om intercellulaire, gap junctionele communicatie te bestuderen. Lucifer geel dringt de cellen binnen wanneer een elektrische puls, toegepast op het geleidende oppervlak waarop ze groeien, ervoor zorgt dat er poriën door het celmembraan worden gevormd. Dit is elektroporatie. Cellen die groeien op het niet-geleidende glasoppervlak onmiddellijk naast het geëlektropoteerde gebied nemen Lucifer geel niet op door elektroporatie, maar verwerven de fluorescerende kleurstof als deze wordt doorgegeven via gap junctions die hen verbinden met de geëlektropoteerde cellen. De resultaten van de overdracht van kleurstof van cel naar cel kunnen onder microscopisch zichtbaar worden waargenomen bij fluorescentie-verlichting. Deze techniek maakt een nauwkeurige kwantificering van gap junctionele communicatie mogelijk. Bovendien kan het worden gebruikt voor de introductie van peptiden of andere niet-doorlaatbare moleculen, en de overdracht van kleine geëlektropoteerde peptiden via gap junctions om het signaal in de aangrenzende, niet-geëlektropoteerde cellen te remmen, is een krachtige demonstratie van signaalremming.
Inleiding
De toepassing van elektrische stroom aan een cel leidt tot de vorming van poriën in het celmembraan, een werkwijze genoemd elektroporatie. De poriën laten de passage van verschillende nonpermeant moleculen door het membraan. Het elektrische veld kan nauwkeurig worden geregeld, zodat de poriën gevormd zijn erg klein en hersluiten snel, met minimale verstoring van de cellulaire fysiologie. Interessant is dat hechtende cellen worden gekweekt op een glasplaatje gecoat met geleidend en transparant indium-tin oxide (ITO) en geëlektroporeerd in situ, dat op het oppervlak waar ze groeien, zonder los te geëlektroporeerd in suspensie. Cellen kunnen goed groeien op dit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1 Plating de cellen in de Electroporatie Chambers
- In een laminaire stroming kap, trypsinize de cellen met behulp van steriele techniek gebruikelijk.
Opmerking: Het is belangrijk te elimineren door centrifugeren alle sporen van trypsine, deze kunnen belemmeren spreiding van de cellen op het glas, waardoor de vorming van adherens en gap junctions. - Pipetteer 1 ml van de celsuspensie in de steriele elektroporatie kamers voorzien van de in situ electroporator (figuur 1), en in een 37 ° C, CO2 incubator.
OPMERKING: Cel adhesie kunnen worden verbeterd door uitplaten op fibronectine, collageen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 2 toont rattenleverepitheliale T51B cellen 22 geëlektroporeerde LY en gefotografeerd onder fluorescentie (paneel A en B), of fase-contrast (C) belichting, na fixatie en wassen. In paneel A, wordt de rand van de geëlectroporeerd gebied gemarkeerd in het rood. De helling van fluorescentie aan de rechterkant van de rode lijn geeft de overdracht via gap junctions. In figuur 3A en 3B, is de kwantificering van gap junctions communicatie getoond: De cellen aa.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen in het protocol
Geëlektroporeerde materiaal
De zuiverheid van het materiaal dat moet worden geëlektroporeerd is heel belangrijk. Als de cellen zeer vlak, moet dan hogere concentraties van de tracking kleurstof worden (tot 20 mg / ml voor LY) en in dergelijke gevallen zuiverheid nog belangrijker dan in cellen met een bolvorm 1. Naast LY een grote verscheidenheid aan andere kleurstoffen of nonpermeant moleculen zijn gebruikt, zoals een reeks v.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De corresponderende auteur is de uitvinder in een patent dat wordt beheerd door Queen’s University en dat is gelicentieerd aan Cell Projects Inc. Het bedrijf of de universiteit had geen invloed op de inhoud van het artikel.
Dankbetuigingen
We danken Lowell Cochran voor deskundige video-assistentie. De financiële steun van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Breast Cancer Research Alliance, de Ontario Centers of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston en het Clare Nelson beursfonds door middel van subsidies aan LR wordt dankbaar erkend. SG was de ontvanger van een NSERC-beurs. MG werd ondersteund door een postdoctorale beurs van het US Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en het Advies....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM zonder Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetaal bovien serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporatieapparaat | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Kammers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Kammers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | Hoge zuiverheid |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cel en weefselkleefstof |
| Fibronectine | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collageen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Referenties
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
