Introduction
L'applicazione di corrente elettrica a una cella provoca la formazione di pori nella membrana cellulare, da un processo chiamato elettroporazione. I pori permettono il passaggio di una varietà di molecole nonpermeant attraverso la membrana. Il campo elettrico può essere controllata con precisione, in modo che i pori formati sono molto piccole e richiudersi rapidamente, con il minimo disturbo per la fisiologia cellulare. È interessante notare, cellule aderenti possono essere coltivate su un vetrino rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente (ITO) e elettroporate in situ, che si trova sulla superficie dove crescono, senza essere distaccato per essere elettroporate in sospensione. Le cellule possono crescere molto bene su questa superficie, e come sono collegati ed estese, osservazione microscopica dettagliata è possibile. Usando questa tecnica, piccole molecole nonpermeant possono essere introdotti istantaneamente e in sostanza il 100% delle cellule, che rende questa tecnica particolarmente adatto per studi sull'attivazione di components di un percorso seguito stimolazione ligando di un recettore (recensito in 1).
L'elettroporazione è stata utilizzata principalmente per l'introduzione di DNA (chiamato anche electrotransfection). Tuttavia, elettroporazione in situ può essere utile per l'introduzione di una grande varietà di molecole, come peptidi 2-4, oligonucleotidi antisenso, come RNA, oligonucleotidi a doppio filamento di DNA esca per inibire fattore di trascrizione vincolante, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleotidi radioattivi, proteine 11 12 o pro-farmaci 13. A seguito di elettroporazione, le cellule possono essere lisate per analisi biochimiche o fissate e colorate con anticorpi.
Il rivestimento conduttivo ITO è molto sottile, 800-1,000Å, in modo che la crescita cellulare non è disturbato dalla differenza di altezza delle due superfici, come le cellule crescono lungo il bordo del rivestimento conduttivo. Questo offre il vantaggio che non electropciente cellule possono essere coltivate fianco a fianco con quelli elettroporate, per servire come controlli. Lo stesso approccio può essere utilizzato per l'esame di spazi di giunzione, la comunicazione intercellulare (GJIC), come descritto nel video.
Giunzioni sono canali che collegano gli interni di celle adiacenti 14. Gap giunzionale, comunicazione intercellulare svolge un ruolo importante nella formazione del tumore e metastasi, mentre oncogeni quali Src sopprimono GJIC 15,16. Per esaminare GJIC un colorante fluorescente, come Lucifero giallo (LY) è spesso introdotto in cellule in coltura tramite microiniezione o raschiare carico 17 e la diffusione del colorante nelle cellule vicine all 'osservazione microscopica sotto illuminazione a fluorescenza. Queste tecniche però invariabilmente causano danni alle cellule. Descriviamo ora una tecnica in cui le cellule sono coltivate su un vetrino che è parzialmente ricoperto di ITO 18. Un impulso elettrico è stato applicato in presenza di LY (o altri coloranti) cautilizzando la sua penetrazione nelle cellule in crescita da parte conduttiva della diapositiva, mentre la migrazione colorante per le adiacenti, cellule non elettroporate è stata osservata al microscopio con illuminazione a fluorescenza. Per evitare di cellule sensibili inquietanti che possono tendere a staccarsi dalla monostrato, un'assemblea è stato progettato che non richiedono un elettrodo per essere posizionato sulla parte superiore delle cellule di applicare la corrente elettrica 19. Questo approccio offre la possibilità di quantificare GJIC in un gran numero di cellule, senza alcun disturbo rilevabile al metabolismo cellulare, come indicato dall'assenza di un effetto sulla durata della fase G1 seguente siero stimolazione 12, aumento dei livelli di FOS protooncogene proteine (Raptis, inedito) o due chinasi associate a stress cellulare, il maiale p38 o JNK / SAPK chinasi 1. Questo approccio ha reso possibile l'esame del legame tra i livelli di espressione dell'oncogene, trasformazione e GJIC 18, nonché l'effetto di Src e Stat3 su GJIC in una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule in coltura fresco da campioni di tumore del polmone 20-23. Inoltre, in elettroporazione situ con la configurazione descritta, che manca di un elettrodo superiore è stato impiegato con successo per la manifestazione di chiusura del gap junction sulla differenziazione adipocytic, anche se l'attaccamento cellulare al substrato è ridotto in quella fase 19,24.
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Protocol
1 placcatura le cellule del elettroporazione Chambers
- In una cappa a flusso laminare, trypsinize le celle utilizzando una tecnica sterile, come al solito.
NOTA: E 'molto importante eliminare mediante centrifugazione tutte le tracce di tripsina, perché possono ostacolare la diffusione delle cellule sul vetro, quindi la formazione di adherens e giunzioni. - Pipettare 1 ml di sospensione cellulare nelle camere di elettroporazione sterili forniti con il elettroporatore in situ (Figura 1), e posto a 37 ° C, CO 2 incubatore.
NOTA: l'adesione delle cellule può essere migliorata placcatura su fibronectina, collagene, poli-lisina o di cellule e tessuti adesivo (vedi Materiali Tabella). - Quando le cellule hanno formato uno strato confluente sono pronti per l'esame GJIC.
2 elettroporazione Procedura
Elettroporazione per l'esame GJIC può essere condotta al di fuori di una cappa a flusso laminare,dal momento che richiede solo pochi minuti. Se sono necessari tempi di incubazione più lunghi per un esperimento specifico, allora può essere condotta interamente in una cappa a flusso laminare. In tutti i casi, le sezioni dove si coltivano le cellule devono essere sterili.
- Preparare una / ml soluzione gialla Lucifero 5 mg: sciogliere 10 mg di polvere LY (fornito con il elettroporatore) in 2 ml di terreno di coltura privo di calcio. Per esperimenti che richiedono tempi di incubazione più lunghi, filtro-sterilizzare la soluzione e conservare a 4 ° C.
- Aspirare il terreno di crescita e lavare le cellule con terreno privo di calcio, facendo attenzione a non graffiare il monostrato o asciugare le cellule. Se le cellule sono asciugati solito hanno nuclei più scuri e raccogliere LY, senza elettroporazione. L'effetto è più pronunciato nel mezzo della slitta che è più esposto a correnti d'aria (Figura 4F).
- Con una pipetta Eppendorf, pipetta la soluzione colorante per le cellule (400 microlitri per tutta la camera), sul bordo della camera, being attenzione a non toccare lo strato di cellule.
- Posizionare la camera nel supporto fornito con il elettroporatore e applicare un impulso della forza appropriata (vedi discussione).
- Aspirare accuratamente alcuni della soluzione LY. Può essere riutilizzato una seconda volta per esperimenti meno importanti.
- Aggiungi DMEM privo di calcio contenente siero dializzato del 10%.
- Incubare le cellule per 3-5 minuti in incubatrice per consentire il trasferimento colorante attraverso giunzioni gap.
NOTA: L'inclusione di siero dializzato, a questo punto aiuta chiusura dei pori. - Lavare il colorante costituite in società con DMEM senza calcio per l'osservazione di cellule vive. In alternativa, le cellule possono essere fissate in questa fase, attraverso l'aggiunta di 4% di formaldeide al pozzo, poi lavate con PBS (soluzione salina tamponata con fosfato). In tutti i casi il lavaggio deve rimuovere tutta sfondo.
NOTA: In esperimenti preliminari per determinare le condizioni ottimali, se la tensione è troppo bassa, allora è possibile lasciare che le cellule recuperare nel incubator per alcuni minuti e l'elettroporazione stesso vetrino una seconda volta, per risparmiare nel costo di diapositive.
3 Esame microscopico
- Osservare le cellule sotto illuminazione a fluorescenza, utilizzando un microscopio invertito equipaggiato con il filtro appropriato per il colorante utilizzato. Per Lucifero giallo, eccitazione è 423nm, 555nm emissione, filtro WBV per un microscopio Nikon IX70.
- Eliminare effetti menisco mettendo un vetro di copertura antiscivolo sulla parte superiore della plastica e, dopo il riempimento al top con il liquido, per esaminare la morfologia delle cellule in contrasto di fase. Per le foto migliori, il pozzo può essere staccato dalla diapositiva, e il coprioggetto posto sul telaio. Per cellule fissate, il pozzo può essere riempito con glicerolo per l'osservazione microscopica, mentre per le cellule vive deve essere riempito con terreno di crescita.
Attenzione: Il lavaggio e la fotografia è più facile se le cellule vengono fissate con formaldeide a seguito del trasferimento del colorante (precedente punto 2.7). Se le cellule sonot fissato, la fluorescenza viene eliminata dalle cellule entro circa 60 minuti a seconda del tipo di cellula, la tensione e la quantità di LY introdotto mentre nelle cellule fissate fluorescenza viene mantenuta per diverse ore. Tuttavia, fluorescenza svanisce o si dissolve dopo O / N incubazione, anche in cellule fissate. Per questo motivo, illustrazioni, devono essere prese subito dopo l'elettroporazione (Figura 2).
4. quantificazione di comunicazione intercellulare
- Fotografa le cellule con un obiettivo 20x in fluorescenza e contrasto di fase (Figura 3).
- Identificare e contrassegnare con una stella le cellule elettroporate al confine con la zona non elettroporate (figura 2, freccia, bordo elettroporazione).
- Identificare e segnare con un punto le cellule fluorescenti sul lato non-elettroporate, in cui il colorante è trasferito attraverso giunzioni gap (Figure 3A e 3B).
- Dividere il numero totale dicellule fluorescenti sulla zona non elettroporate per il numero di cellule elettroporate lungo il bordo (Figure 3A e 3B).
NOTA: Il trasferimento di almeno 200 cellule elettroporate di frontiera contigue viene calcolato per ogni esperimento. Il numero ottenuto è il valore GJIC.
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Representative Results
La figura 2 mostra fegato di ratto cellule epiteliali T51B 22, elettroporate con LY e fotografati sotto fluorescenza (pannello A e B), o contrasto di fase (C) illuminazione, seguito fissaggio e lavaggio. Nel pannello A, il bordo dell'area elettroporate è indicato in rosso. Il gradiente di fluorescenza a destra della linea rossa indica il trasferimento attraverso giunzioni gap. Nella Figura 3A e 3B, viene mostrata la quantificazione di comunicazione gap giunzionale: Le celle al limite dell'area elettroporate sono stati identificati e contrassegnati da una stella, mentre le cellule in cui il colorante si era trasferito sono stati segnati con un punto. Il rapporto mostra il numero medio di cellule che il colorante trasferito in, per cella confine elettroporate. In questo esempio ci sono 57 punti e 10 stelle, cioè GJIC = 5.7.
In C e D, il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione-3 (Stat3) è stato downregulated in T51B cellule Tespressione siRNA stabile ttraverso con un vettore lentivirale, e questo causa una riduzione GJIC, come mostrato dalla absense di trasferimento 22.
Figura 1 elettroporazione elettrodo e gruppo di scorrimento. (A) Vista dall'alto: Le cellule sono coltivate su un vetrino, rivestito con ossido di indio-stagno conduttivo e trasparente (ITO). Una camera di plastica è incollato sul vetrino, per formare un contenitore per le cellule e LY. Il rivestimento è in linea retta nel mezzo, in sostanza, formando due elettrodi incisa a laser. Una diga consente di deviare le correnti verso l'alto, creando così una brusca transizione di intensità di campo elettrico. Per fornire aree non-conduttivi, l'ITO è anche inciso in due rettangoli. (Frecce rosse) corrente dal generatore di impulsi flussi da ogni punto di contatto all'altro, attraverso un'autostrada conduttivo tra i rettangoli, diffondendo in direttaione parallela alla barriera centrale, quindi sopra la diga attraverso il mezzo verso l'altro lato, electroporating le cellule in zone parallele alla diga. Per chiarezza, la parte anteriore della camera viene rimossa (B) Vista laterale.: Sono indicati il vetrino con le cellule che crescono sul ITO rivestito (verde chiaro) e incise, regioni di vetro nude. Quando viene aggiunto il mezzo elettroporazione contenente LY alla camera ad un livello sopra l'altezza della diga poi un percorso elettrico tra gli elettrodi (+) e (-), e le cellule crescono in questa zona, si forma. Si noti che lo strato di ITO è mostrato con spessore esagerato per chiarezza, anche se il suo spessore effettivo (800 A) è molto inferiore allo spessore delle celle. (C) La zona di cellule elettroporate elettroporate e non viene mostrata ingrandita. Il colorante è densa vicino alla diga, dove tutte le cellule sono state elettroporate e sfuma lungo il bordo elettroporate come la concentrazione indebolisce attraverso molteplici gap junction trasfers. Grandi frecce indicano la direzione del trasferimento colorante attraverso giunzioni gap. Si noti che la dimensione e lo spessore delle celle sono esagerati per chiarezza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Elettroporazione di T51B, cellule epiteliali di fegato di ratto. LY è stata elettroporata nel fegato di ratto cellule epiteliali T51B (lieve, 12 volt). A seguito di un 5 min. incubazione, le cellule sono state fotografate in fluorescenza (A, B) o il contrasto di fase (C) illuminazione. Notare il vasto trasferimento attraverso giunzioni gap, dimostrato dal gradiente di fluorescenza, che si estende dal limite dell'area elettroporate (frecce, linea rossa in A). Allo stesso tempo, non ci sono danni visibili alle cellule, un s visto in contrasto di fase (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Quantificazione del trasferimento gap junction. Le cellule al limite dell'area elettroporate che raccolse LY mediante elettroporazione (donatori di LY alle cellule non elettroporate) sono stati contrassegnati con una stella. Celle dove LY trasferito in giunzioni attraverso stati segnati con un punto. In (A) e (B), ci sono 57 punti e 10 stelle, cioè, GJIC = 5.7. Le cellule in (C) e (D) non hanno giunzioni, come dimostra l'assenza di un gradiente di fluorescenza. Le frecce indicano il limite dell'area elettroporate. Bar = 100 micron.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 cellule (A) T51B che sono stati danneggiati da raschiando durante la manipolazione. Queste cellule possono prendere LY anche senza elettroporazione e possono trasferire ai loro vicini attraverso giunzioni gap. (B) e (C) le cellule danneggiate da un impulso che è troppo forte. (B) T51B di fegato di ratto cellule epiteliali sono state elettroporate in ambiente mite , 20 volts. Le celle a sinistra della linea incisa (freccia) sono stati danneggiati dalla elettroporazione. In questo caso le cellule non si staccano, ma uno sguardo da vicino la fotografia contrasto di fase (pannello centrale, freccia bianca) mostra le celle per avere nuclei scuri, mentre fluorescenza molto debolmente, se non del tutto (pannello superiore). Tuttavia, il trasferimento thgiunzioni grezzi è evidente, alle cellule sul lato destro che non sono elettroporate. La fotografia fondo è stato realizzato combinando illuminazione a contrasto di fase ed UV, per facilitare la visualizzazione del bordo di elettroporazione. Cellule epiteliali (C) T51B fegato di ratto elettroporate a regolazione media, 30 volt. Le celle a sinistra della linea incisa sono stati gravemente danneggiati dal polso. Si noti come le cellule sono venuti fuori e non fluorescenza. Alcuni sopravvissuti intorno al bordo hanno raccolto LY e sembrano essere trasmetterla ai loro vicini a destra via giunzioni gap. Cellule (D) T51B elettroporate con 10 mcg / ml di ioduro di propidio. Si noti l'intensa colorazione dei nuclei. (E) Cupole delle cellule epiteliali. Cellule T51B elettroporati a impostazione mite, 15 Volt. Nota anche l'elettroporazione di cellule a sinistra. Tuttavia, quando confluenti, le cellule T51B formare cupole che possono fuoriuscire durante la manipolazione e il lavaggio, e le cellule circostanti possono take up LY. Notare il vasto trasferimento colorante. (F) Le cellule che sono secchi possono prendere LY senza electroporation.The mezzo di crescita è stato rimosso dalle cellule T51B e cellule sono stati lasciati in una cappa a flusso laminare per 30 min. LY è stato successivamente aggiunto alle cellule per 1 min e le cellule sono state successivamente fissato, lavato e fotografato sotto fluorescenza (pannello superiore) oppure a contrasto di fase (pannello inferiore) illuminazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 Il blocco peptide Grb2-SH2 inibisce l'attivazione di Erk EGF-mediata, in cellule viventi intatte. Combinazione di GJIC e trasduzione del segnale studi. Seguito di legame ligando, un certo numero di fattori di crescita recettori come il fattore di crescita epidermico Receptor (EGFR) sono trans-fosforilazione su specifici residui di tirosina. Questi costituiscono i siti di docking per l'SRC-omologia-2 domini di trasduttori di segnale, come Grb2, che è legata al fattore di scambio sos GTP / PIL, che viene così portato alla membrana e attiva Ras. Ciò comporta l'attivazione della cascata Raf / Mek / Erk e la fosforilazione di Erk ad una sequenza di P TE P Y. Pertanto, la rilevazione con anticorpi specifici fosfo-Erk può essere una misura di attivazione del recettore EGF. Dopo la fissazione, le cellule vengono sondati con un anticorpo anti-Perk (Signalling Cell), seguito da un anticorpo biotina-coupled secondario, streptavidina-Cavallo-raddish perossidasi e il substrato diamminobenzidina, che dà un colore marrone 29. In questo esperimento, un fosfopeptide bloccando il dominio Grb2-SH2 (PVPE p Y INQS) è stato introdotto da in situ elettroporazione icellule NIH 3T3 nto che crescono nelle camere elettroporazione e la crescita-arrestati a medio speso. 5 minuti dopo l'applicazione di impulsi, le cellule sono state stimolate con EGF per 5 minuti, fissi, sondati per attivare fosfo-ERK1 / 2 da parte delle cellule stainingand immunoperossidasi dallo stesso campo fotografato in campo chiaro (in alto) o contrasto di fase (in basso) l'illuminazione. Si noti che il peptide blocco Grb2-SH2 ha ridotto drasticamente il segnale FEG, vale a dire, fosforilazione di Erk (zona a). L'inibizione del segnale si estende in ~ 3-4 righe di celle adiacenti nella zona non elettroporate (squiggly staffa), probabilmente a causa del movimento del 1123 Da peptide attraverso giunzioni gap. Questo risultato costituisce una prova convincente che l'inibizione osservato deve essere dovuto al peptide, piuttosto che un artefatto di elettroporazione, dal momento che le cellule in questo settore non ha ricevuto alcuna corrente, ma acquisito il peptide dai loro vicini. Al tempo stesso, non vi è alcun effetto rilevabile sulla morfologia cellulare comedimostrato da contrasto di fase. La freccia indica il limite dell'area elettroporate. Ingrandimento: 240x. Per maggiori dettagli e controlli vedi riferimento 29. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici nel protocollo
Materiale elettroporate
La purezza del materiale da elettroporate è molto importante. Se le cellule sono molto piatto, devono essere utilizzate concentrazioni più elevate di poi il colorante inseguimento (fino a 20 mg / ml per LY) e in tali casi, la purezza è ancora più importante che nelle cellule con una forma più sferica 1. Oltre LY una grande varietà di altri coloranti o molecole nonpermeant sono stati impiegati, come ad esempio una serie di coloranti Alexa utilizzare come sonde per canali composte da diverse connessine 25. Tuttavia, coloranti come etidio bromuro o ioduro di propidio sono intercalati nel DNA in modo che i nuclei fluorescenza molto forte, il che rende la quantificazione di trasferimento colorante più difficile (Figura 4D). I coloranti di monitoraggio devono essere preparati e lavaggi condotti in terreno di coltura privo di calcio, a causa di un afflusso di calcio può interrompere la comunicazione giunzionale, oltre a ridurre celvitalità l. Tutte le soluzioni devono essere mantenuti a 37 ° C prima di elettroporazione, che facilita la chiusura dei pori e la vitalità 1.
Determinazione della tensione e capacità ottimale
Intensità di campo elettrico è un parametro critico per la permeazione delle cellule, così come vitalità. L'applicazione di impulsi multipli ha mostrato di offrire risultati migliori in termini di permeazione e vitalità cellulare di un singolo impulso. L'apparato Insitu Porator dei progetti cellulari ha tre impostazioni per la capacità e il numero di impulsi: Lieve (10 impulsi, 10 ms di distanza, 0,1 sec tra gli impulsi), medio (20 impulsi, 80 ms di distanza, 0,2 sec tra gli impulsi) e Strong (50 impulsi , 120 ms a parte, 0,5 sec tra gli impulsi), mentre la tensione può essere finemente controllato in modo indipendente (2-45V). Infatti, le cellule piatte richiedono tensioni più basse rispetto a quelle trasformate, le cellule in un ciuffo o celle con una piccola area adesione al substrato (ad esempio, cellule di insetto Sf9), Probabilmente a causa delle grandi quantità di corrente che passa attraverso una cella estesa che è in contatto con una superficie conduttiva grande. Per ulteriori dettagli su questo argomento, si veda 1.
Potenziali problemi e risoluzione dei problemi
Se le cellule sono stati raschiati durante le manipolazioni, possono prendere il colorante e la fluorescenza senza elettroporazione (Figura 4A). La quantità di energia fornita alle cellule influisce sull'efficienza di elettroporazione. Se l'impulso è troppo debole (ad esempio, le impostazioni di impulsi troppo basso voltaggio e), poi le cellule appaiono normali in contrasto di fase, ma non reagiscono, tranne forse per alcune cellule che possono essere morti o sono stati raschiati durante la manipolazione (Figura 4A) . Se l'impulso è troppo forte, in contrasto di fase le cellule sembrano avere nuclei molto scuri (Figura 4B), ma possono mantenere una certa LY, e anche permettere qualche trasferimento colorante cellule vicine. Alla vigilian impulsi superiori le cellule sono distrutte (Figura 4C). Tali cellule sono lisate, pertanto, essi non conservano LY e fluorescenti molto debolmente, se non del tutto. Alcune linee cellulari epiteliali quali T51B strutture forma di cupola che può venire fuori durante i cambi medi. Le cellule circostanti possono poi fluorescenti come il colorante può essere trasferito attraverso giunzioni gap (Figura 4E). Esempi di condizioni ottimali per elettroporazione linee rappresentativi sono mostrati nella Tabella 1.
Vantaggi rispetto ad altre tecniche e significato
Introduzione DNA
Vi è un gran numero di protocolli di trasfezione, come calcio-fosfato coprecipitazione 26 o diversi tipi di liposomi. Tuttavia, essi possono influenzare la cellula in modi sottili che possono essere molto importante, soprattutto per gli studi di trasduzione del segnale. Ad esempio, la fosforilazione Tyr-705 del trasduttore di segnale e attivatore di trascrizioneione-3 (STAT3) che è correlato con la sua attività trascrizionale è drammaticamente aumentata dalla procedura di calcio-fosfato trasfezione anche in assenza di DNA. Questo potrebbe essere dovuto al fatto che il precipitato altera cella per l'adesione cellulare e caderina impegno, un noto attivatore Stat3 27. Alcuni liposomi hanno avuto un effetto simile, ma meno pronunciato, mentre elettroporazione o infezione retrovirale non ha influenzato i livelli di STAT3 6.
L'introduzione di peptidi
Un metodo comune è la costruzione di un peptide di fusione con sequenze che attraversano la membrana cellulare, come derivato dal gene di HIV-tat. Tuttavia, il trasferimento attraverso la membrana è un processo relativamente lento e l'inibizione del segnale non è così efficace. Per lo studio della sequenza di eventi verificatisi attivazione del recettore seguito da un legante, la possibilità per l'introduzione immediata di un peptide, composti peptidomimetici o altra offre un importante vantage. Elettroporazione di un peptide cellula permeabile per accelerare la sua adozione non è possibile, probabilmente perché il peptide lipofilo è incorporato nella membrana cellulare, come rivelato con peptidi FITC-accoppiati (Raptis, inedito). È interessante notare che l'inibizione di ERK da EGF attraverso l'uso di un peptide cellula permeabile bloccando il dominio SH2-Grb2 per esempio, è stata solo parziale 28, mentre elettroporazione dello stesso peptide ottenuto una completa inibizione del segnale 29 ( Figura 5). Altre tecniche, basate su liposomi sono in esistenza. Tuttavia, essi non consentono l'esame delle cellule non trattate fianco a fianco con quelli trattati, in collaborazione con studi divario di giunzione, che può offrire il più forte possibile dimostrazione che l'inibizione del segnale deve essere dovuto al materiale in fase di introduzione (figura 5, squiggly staffa , c).
Studi Gap giunzione
Microiniezionedi coloranti o raschiare-loading sono comunemente impiegati, ma invariabilmente introducono danni cellulari. Un'altra tecnica, recupero di fluorescenza dopo photobleaching non è invasiva ma richiede attrezzature costose, e poche cellule può essere esaminata alla volta, mentre la formazione di sostanze fototossiche può essere un problema. Il saggio paracadute si compone di cellule pre-carico con il colorante calceina AM (verde), lasciando poi le cellule aderiscono su uno strato di cellule, come giunzioni formano entro 15 min-3 ore. Un gran numero di cellule può essere trattato in questo modo, ma la capacità delle cellule di formare giunzioni in questo dosaggio varia enormemente con il tipo di cella 30.
Limitazioni
La tensione necessaria è maggiore per l'introduzione di molecole di grandi dimensioni e cariche elettriche. Alle alte tensioni necessarie per l'introduzione di grandi plasmidi, ci può essere qualche morte cellulare. Le tensioni relative richieste per le diverse molecolesono state descritte in precedenza 9,12. Sebbene si descrive l'elettroporazione usando un apparato elettroporazione specifico, è possibile per qualcuno esperto con elettrodomestici a porta con la descrizione dettagliata di 19, o fare una configurazione più semplice con un elettrodo superiore sopra le celle, e etch con acidi 1.
Direzioni future
Software sono stati sviluppati per quantificare con precisione GJIC 31. Un ulteriore miglioramento è lo sviluppo di punti quantici fluorescenti che solo una volta che sono nella cella, in modo che non vi è alcuna necessità di lavare il colorante non incorporata. Questo evita lo stress di lavaggio, mentre il processo può essere osservato in cellule vive, non fisse in tempo reale. L'introduzione di peptidi ad interrompere le vie di segnalazione è un approccio potente per la valutazione in vivo della rilevanza delle interazioni individuate utilizzando componenti purificati. L'esame della pentolaziale di diversi peptidi di inibire un percorso specifico è il primo passo importante nello sviluppo di farmaci peptidomimetici, per il trattamento razionale di neoplasia.
Altre osservazioni
Le slide possono essere lavati con Extran-1000 soluzione con un pennello piccolo per raggiungere la superficie ITO nel pozzo, e risciacquati con acqua. Se le cellule sono state fissate sul vetrino, può essere necessario rimuovere tracce di proteine con tripsina o altri enzimi proteolitici prima. Sodio dodecilsolfato detergenti contenenti devono essere evitati. Vetrini lavati possono essere sterilizzati con gas di perossido. Tuttavia, è molto importante per evitare di rompere il sigillo del bene sul vetrino, perché se eventuali perdite soluzione LY nel supporto che possono causare un corto circuito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
