Introduction
Anvendelsen av elektrisk strøm til en celle fører til dannelse av porer på cellemembranen, ved en prosess som betegnes electroporation. Porene tillate passasje av en rekke nonpermeant molekyler gjennom membranen. Det elektriske felt kan styres nøyaktig, slik at porene som dannes er svært små og gjenlukke raskt, med minimal forstyrrelse av cellefysiologi. Interessant nok kan adherente celler dyrkes på en glass-slide belagt med ledende og gjennomsiktig indium-tinnoksyd (ITO) og elektroporert in situ, det vil si på overflaten, hvor de vokser, uten å bli løsrevet skal elektroporert i suspensjon. Celler kan vokse godt på denne overflaten, og som de er bundet til, og forlenget, er mulig detaljert mikroskopisk observasjon. Ved å bruke denne teknikken kan mindre nonpermeant molekyler innføres øyeblikkelig og inn i i det vesentlige 100% av cellene, noe som gjør denne teknikk er spesielt egnet for studier på aktivering av komponents av en sti følgende ligand stimulering av en reseptor (gjennomgått i 1).
Electroporation er blitt brukt hovedsakelig for innføring av DNA (også kalt electrotransfection). Imidlertid kan elektroporering in situ være verdifulle for innføring av et stort utvalg av molekyler, slik som peptider, oligonukleotider 2-4, slik som antisense-RNA, dobbelt-trådet DNA lokke oligonukleotider for å inhibere transkripsjonsfaktor binding, eller siRNA 3,5, 6, radioaktive nukleotider 7-10, proteiner 11 12 eller pro-narkotika 13. Etter elektroporering, kan cellene lysert for biokjemiske analyser eller faste og farget med antistoffer.
Den ledende ITO belegget er meget tynt, 800-1,000Å, slik at cellevekst ikke er forstyrret av høydeforskjellen mellom de to flater, som cellene vokser over kanten av det ledende belegg. Dette har den fordelen at ikke-electropfordampet celler kan dyrkes side om side med electroporated seg, for å tjene som kontroller. Den samme metode kan benyttes for undersøkelse av gapet junctional, intercellulær kommunikasjon (GJIC), som beskrevet i det bilde.
Gap veikryss er kanaler som forbinder interiøret av tilstøtende celler 14. Gap junctional, spiller intercellulær kommunikasjon en viktig rolle i dannelsen og tumormetastasering, mens onkogener slik som Src undertrykke GJIC 15,16. For å undersøke GJIC et fluorescerende fargestoff som Lucifer gul (LY) blir ofte innført i dyrkede celler gjennom mikroinjeksjon eller skrape-lasting 17 og spredningen av fargestoff til nabocellene er mikroskopisk observert henhold fluorescens belysning. Disse teknikkene er imidlertid uunngåelig forårsake skade på cellen. Vi skal nå beskrive en teknikk hvor cellene er dyrket på et objektglass som er delvis belagt med ITO 18.. En elektrisk puls ble anvendt i nærvær av LY (eller andre fargestoffer) caved hjelp av dens penetrering inn i cellene som vokser på den ledende del av objektglasset, mens fargestoff migrering til de tilstøtende, ikke-electroporated celler ble observert mikroskopisk ved fluorescens-belysning. For å unngå forstyrrende sensitive celler som kan være tilbøyelige til å løsne fra monolaget, en sammenstilling er designet som ikke krever en elektrode for å bli plassert på toppen av cellene for å påføre elektrisk strøm 19. Denne tilnærmingen har evnen til å kvantifisere GJIC i et stort antall celler, uten noen påvisbar forstyrrelse for cellulær metabolisme, som indikert ved fravær av en effekt på lengden av G1 fase følgende serumstimulering 12, øker i nivåene av de fos protooncogene protein (Raptis, upublisert) eller to kinaser assosiert med mobilnettet stress, p38 hog eller JNK / SAPK kinase en. Denne tilnærmingen gjort mulig undersøkelse av sammenhengen mellom nivåer av onkogen uttrykk, transformasjon og GJIC-18, så vel som virkningen av Src og STAT3 ved GJIC i en rekke celletyper, inkludert celler ferskt kultur fra lungetumorprøver 20-23. I tillegg, i situ elektroporering med oppsettet beskrevet som mangler en toppelektrode har blitt anvendt for påvisning av gap junction lukking ved adipocytic differensiering, selv om cellulær festing til substratet reduseres ved det stadiet 19,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plating cellene i Electroporation Chambers
- I en laminær-strømningshette, trypsinize cellene ved å bruke steril teknikk som vanlig.
MERK: Det er svært viktig å eliminere ved sentrifuge alle spor av trypsin, fordi de kan hindre spredning av cellene på glasset, derav dannelsen av adherens og gap veikryss. - Pipetter 1 ml av cellesuspensjonen i sterilt electroporation kamre forsynt med de in situ electroporator (figur 1), og plasser i en 37 ° C, CO 2 inkubator.
MERK: Celleadhesjon kan forbedres ved utsåing på fibronektin, kollagen, poly-lysin eller celle og vevs-klebemiddel (se Materialer tabell). - Når cellene har dannet en konfluent lag de er klare for GJIC eksamen.
2. Electroporation Prosedyre
Electroporation for GJIC eksamen kan gjennomføres utenfor en laminær-flow hette,siden det bare tar noen få minutter. Hvis lengre inkubasjonstider er nødvendig for et bestemt eksperiment, da det kan utføres i sin helhet i en laminær-strømningshette. I alle tilfeller må de kammere hvor cellene er dyrket være steril.
- Forbered en 5 mg / ml Lucifer gul oppløsning: Oppløs 10 mg LY pulver (følger med electroporator) i 2 ml Kalsium fritt vekstmedium. For eksperimenter som krever lengre inkubasjonstid, filter-sterilisere løsningen og oppbevar ved 4 o C.
- Aspirer vekstmedium og vaske cellene med kalsium-free medium, være forsiktig så du ikke riper monolaget eller tørke cellene. Hvis cellene er tørket de vanligvis har mørkere kjerner og plukke opp LY uten elektroporering. Effekten er mer uttalt i midten av lysbildet som er mer utsatt for luft trekk (figur 4F).
- Med en Eppendorf pipetten, pipette fargestoffoppløsningen til de celler (400 ul for hele kammeret), på kanten av kammeret, being forsiktig så du ikke berører cellelaget.
- Plasser kammeret i holderen som følger med electroporator og anvende en puls av passende styrke (se diskusjon).
- Nøye Aspirer noen av LY-løsning. Det kan brukes om igjen en gang for mindre viktige eksperimenter.
- Legg Kalsium-fritt DMEM inneholdende 10% dialyserte serum.
- Inkuber cellene i 3-5 min i inkubatoren for å la fargestoffoverføring gjennom gap junctions.
MERK: Inkludering av dialyserte serum på dette punktet hjelper pore nedleggelse. - Vask unincorporated fargestoff med kalsium-free DMEM for levende celle observasjon. Alternativt kan cellene være fast på dette stadium, ved tilsetning av 4% formaldehyd til brønnen, deretter vasket med PBS (fosfat-bufret saltløsning). I alle tilfeller vasking må fjerne all bakgrunn.
MERK: I innledende eksperimenter for å finne de optimale forhold, hvis spenningen er for lav, så er det mulig å la cellene komme i incubator for noen minutter og electroporate samme lysbilde en gang, for å spare på kostnadene for lysbilder.
3. mikroskopisk undersøkelse
- Observer celler under fluorescens-belysning, ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med passende filter for fargestoffet som benyttes. For Lucifer gul, er eksitasjon 423nm, utslipp 555nm, WBV filter for en Nikon IX70 mikroskop.
- Eliminer meniscus effekter ved å plassere en glassdeksel-slip på toppen av plast også, etter å ha fylt det til toppen med væske, for å undersøke cellemorfologi henhold fasekontrast. For bedre bilder, kan det godt være løsrevet fra raset, og dekkglass plassert på rammen. For faste celler, kan brønnen være fylt med glycerol for mikroskopisk observasjon, mens for levende celler, må det fylles med vekstmedium.
MERK: Vasking og fotografering er enklere hvis cellene er festet med formaldehyd etter overføringen av fargestoff (trinn 2.7 ovenfor). Dersom cellene ikke er noent fast, fluorescens utskilles fra cellene i løpet av omtrent 60 min, avhengig av celletype, spenning og mengden av LY innført mens i faste celler fluorescens fastholdes i flere timer. Imidlertid forsvinner fluorescens eller oppløses etter O / N inkubering, selv i faste celler. Av denne grunn må fotografier tas kort tid etter elektroporering (figur 2).
4. Kvantifisering av Intercellular Communication
- Fotografere cellene med en 20x Målet etter fluorescens og fasekontrast (figur 3).
- Identifisere og merke med en stjerne de electroporated celler på grensen til ikke-electroporated område (Figur 2, pil, elektroporering kant).
- Identifisere og markert med en prikk som fluorescerer cellene på ikke-elektroporert side, hvor fargestoffet har overført gjennom gap junctions (Figurene 3A og 3B).
- Dele den totale antallfluorescerende celler på den ikke-elektroporert område med antall electroporated celler langs kanten (Figurene 3A og 3B).
MERK: Overføringen fra minst 200 sammenhengende electroporated grensecellene beregnes for hvert forsøk. De oppnådde tall er GJIC verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser rottelever epithelial T51B celler 22, electroporated med LY og fotografert i henhold fluorescens (panel A og B), eller fase-kontrast (C) belysning, etter fiksering og vask. I panel A, er kanten av elektroporert området merket med rødt. Gradienten av fluorescensen til høyre for den røde linje betegner overføring gjennom gap junctions. I figur 3A og 3B, er kvantifisering av gapet junctional kommunikasjon vist: cellene ved kanten av elektroporert område ble identifisert og merket med en stjerne, mens celler hvor fargestoffet var overført ble markert med en prikk. Forholdet viser det gjennomsnittlige antall celler som fargestoffet som er overført inn i, pr elektroporert kant celle. I dette eksempelet er det 57 prikker og 10 stjerner, dvs. GJIC = 5,7.
I C og D, signalet Prototype og aktivator av transkripsjon-3 (STAT3) har blitt nedregulert i T51B celler through stabil siRNA uttrykk med en lentiviral vektor, og dette fører til en reduksjon i GJIC, som vist ved fravær av overføringen 22..
Figur 1. Electroporation elektrode og glidende. (A) Sett ovenfra: Cellene dyrkes på en glass-slide, belagt med ledende og gjennomsiktig indium-tinn oksid (ITO). En plast kammer er limt på glide, for å danne en beholder for celler og LY. Belegget er laser-etset i en rett linje i midten, i det vesentlige danner to elektroder. En dam blir brukt til å avlede de nåværende oppover, og dermed skape en skarp overgang i elektrisk feltstyrke. For å gi ikke-ledende områder, er ITO også etset i to rektangler. Omløps (røde piler) fra pulsgeneratoren strømmer fra hvert kontaktpunkt til den andre, via en ledende veien mellom rektanglene, sprer seg i et direkteion parallelt med midtbarriere, deretter over demningen gjennom mediet til den andre siden, electroporating cellene i områder parallelt til demningen. For klarhet, er den fremre del av kammeret fjernes (B) fra siden.: Raset med cellene vokser på ITO belagt (lys grønn) og etset, nakne glass regionene vises. Når electroporation medium inneholdende LY tilsettes til kammeret til et nivå over høyden av demningen deretter en elektrisk bane mellom elektrodene (+) og (-), og de celler som vokser på dette området, er dannet. Legg merke til at ITO lag er vist med overdreven tykkelse for klarhetens skyld, men dens virkelige tykkelse (800 A) er mye mindre enn tykkelsen av cellene. (C) Et område av electroporated og uten electroporated celler er vist forstørret. Fargestoffet er tett i nærheten av demningen hvor alle celler ble elektroporert og tones over elektroporert kanten som konsentrasjonen svekker gjennom flere gap junction transfers. Store piler i retning av fargestoff overføring gjennom gap veikryss. Legg merke til at størrelsen og tykkelsen av cellene er overdrevet for klarhet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Electroporation av T51B, rotte lever epitelceller. LY ble elektroporert inn T51B rottelever epitelceller (mild, 12 volt). Etter 5 min. inkubering ble cellene fotografert i henhold til fluorescens (A, B) eller fasekontrast (C) belysning. Legg merke til den omfattende transport gjennom gap junctions, vist ved gradient av fluorescens, som strekker seg fra kanten av den elektroporert området (piler, rød linje i A). På samme tid, er det ingen synlig skade på cellene, et s sett under fase-kontrast (C). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Kvantitering av gap junction overføring. Cellene på kanten av elektroporert området som plukkes opp LY ved elektroporering (donorer av LY til den ikke-elektroporert celler) ble merket med en stjerne. Cellene der LY overført inn gjennom gap veikryss ble markert med en prikk. I (A) og (B), er det 57 prikker og 10 stjerner, dvs. GJIC = 5,7. Celler i (C) og (D) ikke har gap junctions, som vist ved fravær av en gradient av fluorescens. Pilene peker på kanten av elektroporert området. Bar = 100 mikrometer.es / Ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. (A) T51B celler som har blitt skadet ved å skrape under manipulasjon. Disse cellene kan plukke opp LY selv uten elektroporering og kan overføre det til sine naboer gjennom gap junctions. (B) og (C) Celler skadet av en puls som er for sterk. (B) T51B rottelever-epitel-celler ble elektroporert ved mild innstilling , 20 volt. Cellene på venstre side av den etsede linje (pil) er blitt skadet av elektroporering. I dette tilfelle cellene ikke løsner, men en nærmere ved fasekontrast fotografi (midtre panel, hvite pilen) viser at cellene har mørke kjerner, mens de fluorescerer meget svakt, om i det hele tatt (topp-panelet). Imidlertid overføre thgrove gap junctions er tydelig, til cellene på høyre side som ikke er electroporated. Den nederste bilde ble laget ved å kombinere UV-og fasekontrastbelysning, for å lette visning av kanten av elektroporering. (C) T51B rottelever-epitelceller electroporated ved middels innstilling, 30 volt. Cellene på venstre side av den etsede linjen er blitt alvorlig skadet av pulsen. Legg merke til hvordan cellene har kommet av og ikke fluorescere. Noen overlevende rundt kanten har plukket opp LY og synes å være sende den videre til sine naboer til høyre via gap veikryss. (D) T51B celler electroporated med 10 mikrogram / ml Propidium iodide. Legg merke til den intense fargingen av kjernene. (E) Domes av epitelceller. T51B celler elektroporert ved mild innstilling, 15 Volt. Legg merke til at selv elektroporering av celler til venstre. Imidlertid, når sammenflytende, T51B cellene danner domer som kan komme av under manipulasjon og vasking, og de omliggende celler kan take opp LY. Legg merke til den omfattende fargestoff overføring. (F) celler som har tørket, kan plukke opp LY uten electroporation.The vekstmediet ble fjernet fra T51B celler og cellene ble igjen i en laminær-strømningshette i 30 minutter. LY ble senere lagt til cellene i 1 min og cellene ble deretter fast, vasket og fotografert i henhold fluorescens (øverste panel) eller fase-kontrast (nedre panel) belysning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Grb2-SH2 blokkering peptid hemmer EGF-mediert Erk aktivering i intakte, levende celler. Kombinasjon av GJIC og signaltransduksjon studier. Følgende ligand binding, en rekke vekstfaktor reseptorer slik som den epidermale vekstfaktor Receptor (EGFR) er trans-fosforylert på bestemte tyrosinresiduene. Disse utgjør docking nettsteder for SRC-homologi-to domener av signal transdusere som Grb2, som er bundet til GTP / BNP utveksling faktor sos, som dermed førte til membranen og aktiverer Ras. Dette resulterer i aktivering av Raf / Mek / Erk kaskade og fosforylering av Erk ved en TE P P Y sekvens. Derfor kan sondering med spesifikke fosfo-Erk antistoffer være et mål for aktivering av EGF-reseptoren. Etter fiksering blir cellene probet med et anti-Perk antistoff (Cell Signalling), etterfulgt av en biotin-koblet sekundært antistoff, Hest streptavidin-peroksydase-raddish og Diaminobenzidine substrat, hvilket gir en brun farge 29. I dette forsøk ble en phosphopeptide blokkerer Grb2-SH2 domene (PVPE p Y INQS) innført ved in situ i electroporationnto NIH 3T3 celler vokser i electroporation kamre og vekst-arrestert i brukt medium. 5 min etter puls program, ble cellene stimulert med EGF i 5 min, fast, analysert for aktivert fosfor-Erk1 / 2 av immunoperoxidase stainingand celler fra samme felt fotografert i henhold lysfelt (øverst) eller fasekontrast (nederst) belysning. Merk at Grb2-SH2 blokkerer peptid dramatisk redusert EGF signal, dvs. Erk fosforylering (område a). Inhiberingen av signalet strekker seg inn ~ 3-4 rekker med tilstøtende celler i den ikke-elektroporert område (snirklete brakett), sannsynligvis på grunn av bevegelsen til 1123 Da peptidet gjennom gap junctions. Dette funn utgjør overbevisende bevis for at den observerte inhibering må skyldes peptidet, snarere enn en gjenstand av elektroporering, siden cellene i dette området ikke mottok noen strøm, men ervervet peptidet fra sine naboer. På samme tid, er det ingen påvisbar virkning på cellemorfologi somvist ved fasekontrast. Pilen peker til kanten av electroporated området. Forstørrelse: 240x. For flere detaljer og kontroller se referanse 29. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Electroporated materiale
Renheten av det materiale som skal elektroporert er svært viktig. Hvis cellene er meget flat, må da høyere konsentrasjoner av sporingsfargestoff brukes (opptil 20 mg / ml for LY), og i slike tilfeller, er renheten enda viktigere enn i celler med en mer sfærisk formen 1. Foruten LY et stort utvalg av andre fargestoffer eller nonpermeant molekyler har blitt anvendt, for eksempel en serie av Alexa fargestoffer som skal brukes som prober for kanaler som består av forskjellige connexins 25. Imidlertid er fargestoffer som for eksempel etidiumbromid eller propidium jodid Pilgrim i DNA, slik at kjernene fluorescerer meget sterkt, noe som gjør kvantifisering av fargestoffoverføring vanskeligere (figur 4D). Sporing fargestoffer må være forberedt og vaskinger utført i kalsium-fritt vekstmedium, fordi en kalsiuminnstrømningen kan avbryte junctional kommunikasjon, så vel som reduserer cell levedyktighet. Alle løsningene må holdes ved 37 ° C før elektroporering, noe som letter pore lukking og levedyktighet 1.
Bestemmelse av den optimale spenning og kapasitans
Elektrisk feltstyrke er en kritisk parameter for cellegjennomtrengning, samt levedyktighet. Anvendelsen av flere pulser som har vist seg å gi bedre resultater med hensyn til gjennomtrengning og celleviabilitet enn en enkelt puls. Den Insitu amper apparat av Cell Projects har tre innstillinger for kapasitans og puls Nummer: Mild (10 pulser, 10 mS hverandre, 0,1 sek mellom pulser), middels (20 puls, 80 mS hverandre, 0,2 sekunder mellom pulser) og sterk (50 pulser , 120 mS fra hverandre, 0,5 sek mellom pulsene), mens den spenning kan reguleres uavhengig fint (2-45V). Faktisk flate celler krever lavere spenninger enn de transformerte celler, i en klump eller celler med en liten adhesjon området til underlaget (f.eks, insekt Sf9-celler), Muligens på grunn av de større mengder av strømmen som går gjennom et utvidet celle som er i kontakt med et større ledende område. For ytterligere informasjon om dette emnet, kan du se en.
Potensielle problemer og feilsøking
Hvis cellene har blitt skrapet under manipuleringer, kan de ta opp fargestoff og fluorescerer uten elektroporering (figur 4A). Mengden av energi som leveres til cellene påvirker effektiviteten av elektroporering. Hvis pulsen er for svak (dvs. for lav spenning og pulsinnstillinger), deretter cellene vises normalt under fase kontrast men de har ikke fluorescere, kanskje bortsett fra for visse celler som kan være døde eller har blitt skrapt under manipulasjon (figur 4A) . Hvis pulsen er for sterk, under fase celler kontrast synes å ha svært mørke kjerner (Figur 4B), men kan beholde noen LY, og med tillate noen fargestoff overføring til nabocellene. På even høyere pulser cellene er ødelagt (figur 4C). Slike celler blir lysert, således at de ikke beholder LY og fluorescerer meget svakt, om i det hele tatt. Visse epitele cellelinjer så som T51B formen kuppelenheter, som kan komme av under mellom endringer. De omliggende cellene kan deretter fluorescere som fargestoff kan overføres gjennom gap junctions (figur 4E). Eksempler på electroporation optimale forhold for representative linjer er vist i tabell 1.
Fordeler fremfor andre teknikker og betydning
DNA introduksjon
Det finnes et stort antall transfeksjon protokoller, slik som kalsium-fosfat co-ventet 26 eller forskjellige typer liposomer. De kan imidlertid påvirke celle i subtile måter som kan være svært viktig, spesielt for signaltransduksjon studier. For eksempel, Tyr-705-fosforylering av signalet transduseren og aktivator av transkripsjonion-3 (STAT3) som korrelerer med sitt transkripsjonsaktiviteten øker dramatisk etter fremgangsmåten av kalsium-fosfat transfeksjon, selv i fravær av DNA. Dette kan skyldes det faktum at utfellingen forandrer celle til celle adhesjon og cadherin inngrep, en kjent STAT3 aktivator 27. Visse liposomer hadde en lignende, men mindre uttalt effekt, mens elektroporering eller retroviral infeksjon ikke påvirker STAT3 nivåer seks.
Innføringen av peptider
En vanlig metode er konstruksjon av et fusjonspeptid med sekvenser som krysser cellemembranen, for eksempel avledet fra HIV-tat-genet. Imidlertid er overføringen gjennom membranen en relativt langsom prosess og signal hemming er ikke så effektiv. For studiet av den sekvens av hendelser som inntreffer følgende reseptoraktivering av en ligand, mulighet for umiddelbar innføring av et peptid, peptidomimetiske eller annen forbindelse har en viktig advantage. Elektroporering av en celle-gjennomtrengelig peptid for å akselerere dens binding ikke er mulig, sannsynligvis fordi den lipofile peptid bygges inn i cellemembranen, slik det er åpenbart med FITC-koblede peptider (Raptis, upublisert). Det er interessant å merke seg at hemmingen av Erk aktivering av EGF gjennom bruk av en celle gjennomtrengelig peptid som blokkerer Grb2-SH2 domene for eksempel, var bare delvis 28, mens elektroporering av det samme peptid oppnådd en fullstendig hemming av signalet 29 ( figur 5). Andre teknikker, basert på liposomer er også eksisterer. Imidlertid, har de ikke tillater gjennomgang av ubehandlede celler ved siden av hverandre med de som ble behandlet i forbindelse med gap junction studier, som kan gi en sterkest mulig demonstrasjonen at signal hemming må ha på grunn av materialet blir innført (figur 5, snirklete brakett , c).
Gap junction studier
Mikroinjeksjonav fargestoffer eller skrape-lasting er vanlig ansatt, men de alltid introdusere celleskader. En annen teknikk, fluorescens restitusjon etter fotobleking er ikke invasiv men det krever kostbart utstyr, og noen celler kan undersøkes på en gang, mens dannelsen av fototoksiske stoffer kan være et problem. Den fallskjerm-analysen består av pre-lastende celler med fargestoffet calcein AM (grønn), og deretter å la cellene holder seg på en cellelaget, som gap junctions dannes i løpet av 15 min-3 timer. Et stort antall celler kan bli behandlet på denne måten, men evnen til cellene for å danne gap junctions i denne analysen varierer enormt med celletypen 30..
Begrensninger
Den nødvendige spenning er høyere for innføring av molekyler av større størrelse og elektrisk ladning. Ved de høye spenninger som er nødvendige for innføring av store plasmider, kan det være noen celledød. De relative spenninger som kreves for forskjellige molekylerer blitt beskrevet tidligere 9,12. Selv om vi beskrive elektroporering ved å bruke et spesifikt electroporation apparat, er det mulig for en erfaren med elektriske apparater for å gjøre det ved hjelp av den detaljerte beskrivelse i 19, eller lage en enklere oppsett med en toppelektrode over cellene, og etse med syrer 1.
Fremtidige retninger
Programvare har blitt utviklet til nettopp kvantifisere GJIC 31. En ytterligere forbedring er utviklingen av kvante prikker som fluorescerer bare når de befinner seg i cellen, slik at det ikke er noe behov for å vaske den inkorporerte fargestoff. Dette unngår stress av vasking, mens prosessen kan observeres i levende, ikke faste celler i sanntid. Innføringen av peptider for å avbryte signalveier er en kraftig metode for in vivo-evaluering av relevansen av interaksjoner som er identifisert ved hjelp av rensede komponenter. Undersøkelsen av pottenential av ulike peptider til å hemme en bestemt sti er det første viktig skritt i utviklingen av peptidomimetiske narkotika, for rasjonell behandling av neoplasi.
Andre kommentarer
Skinnene kan vaskes med Extran-1000-løsning ved hjelp av en liten pensel å nå ITO overflaten i brønnen, og skylles med vann. Hvis cellene har blitt festet på dekselet, kan det være nødvendig å fjerne spor av proteiner med trypsin og andre proteolytiske enzymer først. Natriumdedecylsulfat inneholder vaskemidler må unngås. Vasket lysbilder kan steriliseres med peroxide gass. Imidlertid er det svært viktig å unngå å bryte forseglingen av brønnen på glide fordi hvis noen LY løsning lekkasjer i holderen kan det føre til kortslutning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
