Introduction
Bir hücre için elektrik akımının uygulanması işlemi olarak adlandırılan bir elektroporasyon ile, hücre zarı üzerindeki gözeneklerin oluşmasına neden olur. Gözenekler zardan nonpermeant çeşitli moleküllerin geçişine izin verir. Elektrik alanı meydana getirilen gözenekler, çok küçük ve hücre fizyolojisinin çok az rahatsızlık ile, hızlı bir şekilde yeniden kapatmak böylece, hassas bir şekilde kontrol edilebilir. İlginç bir şekilde, yapışkan hücreler, süspansiyon içinde elektropore edilecekse koparılmadan, büyümek yüzeyi üzerinde iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit (İTO) ile kaplanmış ve in situ elektroporasyona bir cam slayt üzerinde büyütülebilir. Hücreler, bu yüzeyde çok iyi büyüyebilir, ve bağlı ve uzatıldıkça detaylı mikroskobik gözlem mümkündür. Bu tekniği kullanarak, küçük moleküller nonpermeant anında sunulan ve comp aktivasyonu üzerinde çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, bu teknik, hücrelerin esas olarak% 100, içine edilebilir(1 gözden) bir reseptörünün ligand stimülasyon sonra yolun onents.
Elektroporasyon DNA'nın katılımı (buna electrotransfection) çoğunlukla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in situ elektroporasyon transkripsiyon faktörü bağlanma, veya siRNA 3,5 inhibe etmek için örneğin antisens RNA gibi çift iplikli DNA Decoy-Oligonükleotidleri gibi peptidler 2-4, oligonükleotidler gibi moleküller, büyük bir çeşitlilik sokulması için değerli olabilir, 6, radyoaktif nükleotidleri, 7-10, proteinler 11 12 ya da ön-ilaçları 13. Elektroporasyondan sonra hücreler, biyokimyasal analizler için lize veya sabit ve antikorlar ile boyanmış olabilir.
Hücreler, iletken kaplamanın kenarı boyunca büyüdükçe hücre büyümesi, iki yüzeyin yükseklik farkından rahatsız etmeyecek şekilde iletken İTO kaplama, 800-1,000Å çok incedir. Bu durum şu avantaja sahiptir olmayan electropbu metne dahil edilmiştir hücreler kontrol olarak hizmet etmek üzere, elektroporasyona olanlar ile yan yana yetiştirilebilir. Video tarif edildiği gibi aynı yaklaşım, boşluk junctional, hücreler arası iletişim (GJIC) 'nin incelenmesi için de kullanılabilir.
Gap kavşaklar komşu hücrelerin 14 iç bağlayan kanallardır. Src gibi onkogenler GJIC 15,16 bastırırken boşluk birleşim, hücreler arası iletişim, tümör oluşumu ve metastaz bakımından önemli bir rol oynar. Lucifer sarının (LY) çoğu zaman mikro-enjeksiyon ile kültürlenmiş hücreler içine dahil edilebilmekte ya da kazıma-yükleme 17 ve komşu hücrelere boyanın difüzyonu mikroskopik floresan aydınlatma altında görülmektedir olduğu gibi GJIC bir floresan boya incelemek. Bu teknikler ancak kaçınılmaz hücre hasarına neden olur. Şimdi hücreleri kısmen İTO 18 ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde yetiştirilen bir tekniği açıklar. Bir elektrik atma LY (ya da diğer boyalar) varlığında ca uygulanmıştırbitişik olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde, boyanın göçü, mikroskopik floresan aydınlatma ile gözlenirken, sürgünün iletken kısmına üzerinde büyüyen hücrelerin içine nüfuziyetini kullanılmıştır. Tek tabaka ayırmak için temayül rahatsız duyarlı hücreler önlemek için, bir elektrot gerektirmeyen tasarlanmış bir montaj elektrik akımı 19 uygulamak için hücrelerin üzerine yerleştirilmesini mümkün kılar. Serum uygulandıktan 12 uygulanarak G1 fazında uzunluğuna bir etkisinin olmaması ile gösterildiği gibi bu yaklaşım fos düzeylerindeki artış, hücre metabolizması için, belirgin bir bozulma olmadan hücrelerin çok sayıda GJIC ölçmek için olanağı sunar protoonkojenden protein (Raptis, yayınlanmamış) veya hücresel stres, p38 domuz veya JNK / SAPK'ın kinaz 1 ile ilişkili iki kinazlardır. Onkojen ifadesi, transformasyon ve GJ düzeyleri arasındaki bağlantının incelenmesi mümkün hale Bu yaklaşımIC 18, hem de akciğer tümör örneklerinde 20-23 taze kültürlenmiş hücreler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin, çeşitli içinde GJIC üzerine Src ve STAT3 etkisi. Buna ek olarak, alt-tabakaya bağlanma hücresel bu aşamada 19,24 azaltılır, ancak başarılı adipositik farklılaşması üzerine boşluk bağlantı kapağın gösterilmesi için kullanılan edilmiş bir üst elektrot yoksun tarif etmiş olup in situ elektroporasyon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Elektroporasyon Chambers Hücreleri Kaplama
- Laminer akış kaputu, her zamanki gibi steril tekniği kullanarak hücreleri trypsinize.
Not: Bu, camın üzerine hücrelerin yayılmasını engelleyebilir, çünkü santrifüjle adherens ve boşluk bağlantıları bu nedenle oluşumunu tripsin tüm izlerini ortadan kaldırmak için çok önemlidir. - Pipet 1, 37 o C'de in situ elektroporatörü içine (Şekil 1) ve yerine, CO2 inkübatör ile donatılmış steril elektroporasyon odalarında ml hücre süspansiyonu.
Not: Hücre yapışması, fibronektin, kolajen, poli-lisin ya da hücre ve doku yapıştırıcı (Malzemeler Tabloya bakınız) üzerine kaplanarak artırılabilir. - Hücreler konfluent tabakası oluşturdular onlar GJIC inceleme için hazırdır.
2. Elektroporasyon Prosedürü
GJIC muayene için elektroporasyon, bir laminer akış kaputu dışında yapılabiliralır bu yana sadece bir kaç dakika. Daha uzun inkubasyon süreleri belirli bir deney için gerekli olduğu durumda, o zaman bir laminer akış başlığı içinde tamamen yapılabilir. Tüm durumlarda, hücrelerin büyüdüğü odacıklar steril olması gerekmektedir.
- 5 mg / ml, Lucifer sarı bir çözelti hazırlayın: 2 mi Kalsiyum içermeyen büyüme ortamında (elektroporatörü ile birlikte verilme), 10 mg LY eritin. 4 o C'deki solüsyonu ve mağaza filtre-sterilize, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duyar deneyler için
- Büyüme ortamı aspire ve tek tabaka ya da sıfırdan hücreleri kurutmak için dikkatli olmak, kalsiyum-barındırmayan ortam maddesi ile hücreleri yıkayın. Hücreler kurutulur varsa genellikle koyu çekirdekleri ve elektroporasyon olmadan LY al. Etkisi daha hava akımı (Şekil 4F) maruz slayt ortasında daha belirgindir.
- Bir Eppendorf pipet ile, bölme, B kenarında, hücreler (bütün odası için 400 ul), boya çözeltisinin pipetleDikkatli eing hücre tabakasını dokunmamaya.
- Elektroporatörü ile birlikte tutucu odasına yerleştirin ve uygun kuvvette (Tartışma) bir darbe uygulamak.
- Dikkatle LY çözümün bazı aspire. Bu deneyler için daha az önemli bir ikinci kez tekrar edilebilir.
- ,% 10 serum ihtiva eden diyaliz kalsiyum içermeyen DMEM ekleyin.
- Boşluk bağlantıları ile boya transferini sağlamak için inkübatör 3-5 dakika için kuluçkalayın.
Not: Bu noktada, diyaliz serum dahil açıklıklarının kapanmasına yardımcı olur. - Canlı hücre gözlem için Kalsiyum içermeyen DMEM ile tüzel kişiliği olmayan boya yıkayın. Seçenek olarak ise, hücreler çukuruna% 4 formaldehit ilave edilmek suretiyle bu aşamada tespit edilebilir, daha sonra PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) ile yıkanmıştır. Tüm durumlarda yıkama tüm arka planı kaldırmak gerekir.
NOT: Ön deneyler gerilimi çok düşükse, uygun koşulları belirlemek amacıyla, o hücrelerin incubato kurtarmak izin mümkündürBir kaç dakika boyunca r ve slaytlar maliyeti kurtarmak için, aynı Sürgü ikinci kez electroporate.
3. Mikroskobik İnceleme
- Kullanılan boya için uygun bir filtre ile donatılmış bir ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, floresan aydınlatma altında hücreleri dikkate alınmalıdır. Sarı Lucifer, uyarma 423nm, emisyon 555nm, Nikon IX70 mikroskop için WBV filtre.
- Faz kontrast altında hücre morfolojisini incelemek için, sıvı ile üst doldurduktan sonra, iyi plastik üstüne bir cam kapak-slip koyarak menisküs etkilerini ortadan kaldırmak. Daha iyi fotoğraflar için, iyi slayt ayrılabilir, ve lamel çerçeveye yerleştirilir. Canlı hücreler için bu büyüme ortamı ile doldurulması gerekir ise sabit hücreler için de, mikroskopik gözlem için gliserol ile doldurulabilir.
NOT: Hücreler bir boya (yukarıdaki aşama 2.7) transferi aşağıdaki formaldehitle sabitlendi, eğer yıkama ve görüntüleme daha kolaydır. Hücreler ise hiçbirT floresan sabit hücrelerin floresans birkaç saat boyunca muhafaza edilir getirirken LY hücre tipi, gerilim ve miktarına bağlı olarak, yaklaşık 60 dakika içinde hücrelerden elimine edilir, sabit. Bununla birlikte, floresan kaybolur ya da sabit hücrelerde, O / N inkübasyondan sonra dağılır. Bu nedenle, fotoğraf elektroporasyon (Şekil 2) kısa bir süre sonra alınmalıdır.
Hücreler arası İletişimin 4. Kantifikasyonu
- Floresans ve faz kontrast (Şekil 3) altında, bir 20x objektif ile hücrelerin fotoğraf.
- Olmayan elektroporasyona alanı (Şekil 2, ok, elektroporasyon kenar) ile sınırında elektropore hücreleri belirlemek ve bir yıldız ile işaretleyin.
- Boya boşluk bağlantıları aracılığıyla transfer olan-olmayan elektroporasyona tarafında, floresanlama hücreleri belirlemek ve bir işaret ile (Şekil 3A ve 3B).
- Toplam sayısına bölünkenar (Şekil 3A ve 3B) boyunca elektroporate edilmiş hücrelerde sayısına göre olmayan elektroporasyona alanda hücreleri fluoresan.
NOT: en az 200 bitişik Elektroporasyona çevresindeki hücrelerden Transfer, her bir deney için hesaplanır. Elde edilen sayı GJIC değerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2, tespit ve yıkama sonrası floresan (Panel A ve B) kapsamında LY ile elektropore edildi ve fotoğraflandı sıçan karaciğer epitel hücreleri T51B 22, ya da faz-kontrast (C) aydınlatma göstermektedir. Panel A, electroporated alanın kenar kırmızı olarak işaretlenmiştir. Kırmızı çizginin sağında flüoresans gradyanı boşluk bağlantıları yoluyla transferini ifade eder. Boya transfer olan hücreler, bir nokta ile işaretlenmiş ise, elektroporasyona alanının kenarında Hücreler, bir yıldız ile belirlenmiş ve işaretlenmiştir: Şekil 3A ve 3B'de, aralık kavşak iletişim kantitasyonu gösterilmiştir. Oranı, boya elektroporasyona sınır hücre başına, transfer hücrelerin ortalama sayısını göstermektedir. Bu örnekte, yani 57 nokta ve 10 yıldız, GJIC = 5.7 vardır.
C ve D, Transkripsiyon-3'ün sinyal ileticisi ve aktivatör (Stat3) içinde T51B hücreleri t down regüle edilmiştirtransferi 22 oid'in ile gösterildiği gibi sabit Demiri siRNA'nın lentiviral vektör ile sentezleme, ve bu GJIC bir azalmaya neden olur.
Şekil 1. Elektroporasyon elektrot ve slayt montaj. (A) Üst görünüm: Hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit (ITO) ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde yetiştirilmektedir. Bir plastik bölme hücreleri ve LY için bir kap oluşturmak üzere, bir slayt üzerine yapıştırılır. Kaplama lazerle esas olarak iki elektrodu oluşturan ortasında düz bir çizgi olup. Bir baraj böylece elektrik alanı yoğunluğu keskin bir geçiş oluşturarak, mevcut yukarı doğru yönlendirmek için kullanılır. Iletken olmayan alanları sağlamak için, İTO da iki dikdörtgenler kazınmıştır. Darbe jeneratörü Cari (kırmızı oklar) doğrudan yayılan, dikdörtgen arasındaki iletken bir karayolu vasıtasıyla, diğer her temas noktasında akaralanları baraj paralel iyon hücrelerini elektroporat ardından diğer tarafa vasıtasıyla baraj üzerinde orta bariyer paraleldir. . Netlik sağlamak için, haznenin ön kısmı (B), yandan görünümü kaldırılır: İTO kaplı (açık yeşil) ve kazınmış, çıplak cam bölgelerde büyüyen hücreleri ile slayt gösterilir. (-), Ve bu alanda büyüyen hücreler meydana gelir LY ihtiva eden ortam daha sonra elektroporasyon baraj yüksekliği elektrotlar arasında bir elektrik yolu (+) ve üzerinde bir düzeye kadar bölmeye eklenir. Gerçek kalınlık (800 A) hücrelere kalınlığından daha az olmasına rağmen, İTO tabakası açıklık için abartılı kalınlıkta gösterildiğine dikkat ediniz. (C) içinde elektroporasyona tabi olmayan hücrelerin Electroporated alan büyütülmüş olarak gösterilmiştir. Konsantrasyon birden gap junction transf yoluyla zayıflatır gibi boya tüm hücreleri elektropore ve elektroporasyona kenarı boyunca kaybolur edildi barajın yakınındaki yoğuners. Büyük oklar, boşluk bağlantıları ile boya transferi yönünü gösterir. Hücrelerin büyüklüğü ve kalınlığı netlik için abartılı olduğunu unutmayın. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
T51B Şekil 2. Elektroporasyon, sıçan karaciğer epitel hücreleri. LY T51B fare karaciğeri epitel hücreleri (hafif, 12 volt), elektroporasyona uğratılmıştır. 5 dakika ardından. Kuluçka, hücreler floresan (A, B) ya da faz kontrast (C), aydınlatma altında fotoğraflandı. Elektroporasyona alanı (oklar, A kırmızı çizgi) kenarında uzanan floresan gradyanı ile gösterilen boşluk bağlantıları yoluyla geniş transferi, dikkat edin. Aynı zamanda, herhangi bir hücre Görünür bir hasar yok, bir orada faz-kontrast (C) altında görülen s. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Gap junction transferi Şekil 3. kantitasyonu. Elektroporasyon (non-Electroporated hücrelere LY bağışçılar) tarafından LY aldı Electroporated alanının kenarında hücreler yıldız ile işaretlenmiştir. LY ile gap junction aktarılır Hücreler bir nokta ile işaretlendi. (A) ve (B) 'de, örneğin 57 ve noktalar 10 yıldız, GJIC = 5.7 bulunmaktadır. Floresans gradyanı yokluğu ile gösterildiği gibi (C) ve (D) hücreler, bağlanma yerlerine sahip olacak boşluk yoktur. Oklar Elektroporasyona alanının kenarına işaret etmektedir. Bar = 100 mikron.es / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Manipülasyon sırasında kazıma tarafından zarar görmüş Şekil 4. (A) T51B hücreleri. Bu hücreler bile elektroporasyon olmadan LY pick up olabilir ve boşluk bağlantıları aracılığıyla komşularıyla aktarabiliriz. (B) ve çok güçlü bir darbe ile zarar görmüş (C) Hücreler. (B) T51B sıçan karaciğer epitel hücreleri hafif ayarda elktroporatlandı , 20 volt. Kazınmış hat (ok) soldaki hücreler elektroporasyon tarafından zarar görmüş. Bu durumda hücreler faz kontrast fotoğrafta (orta panel, beyaz ok) ancak yakından bakmak, ayırmak vermedi onlar, çok zayıf floresan ederken, koyu çekirdekleri için hücreleri gösterir tüm (üst panelde) eğer. Bununla birlikte, TH aktarmakKaba ara bağlantılar elektropore değildir yandaki hücrelere, belirgindir. Alt fotoğraf elektroporasyon kenarının görüntüleme kolaylaştırmak için, UV ve faz kontrast aydınlatma birleştirilerek hazırlandı. Orta ayarda, 30 voltta elektroporasyona (C), T51B sıçan karaciğer epitel hücreleri. Kazınmış hattının solundaki hücreler ağır darbe ile zarar görmüş. Hücreler dökülmek ve floresan yok nasıl unutmayın. Kenarlarındaki bazı kurtulanlar LY aldı ve boşluk bağlantıları aracılığıyla sağa komşularına de aktarılması gibi görünen var. 10 ug / ml Propidyum iyodür ile elktroporatlandı (D) T51B hücreleri. . Çekirdeklerin yoğun boyama dikkat epitel hücreleri (E) Kubbeler. T51B hücreler hafif bir ortamda, 15 Volt elektroporasyona. Soldaki hücrelerin elektroporasyon da dikkat edin. Birleşmiş Bununla birlikte, hücreler T51B manipülasyon ve yıkama sırasında kopabilir kubbe oluşturur ve çevredeki hücrelerin ta mayLY kadar ke. Geniş boya transferini edin. Electroporation.The büyüme ortamı olmadan LY almak kurutulabilir bulunmamıştır (F) Hücreler T51B hücreleri uzaklaştırılmış ve hücreler, 30 dakika boyunca, bir laminar akış başlığı içinde bırakılmıştır. LY sonra 1 dakika boyunca hücrelere eklendi ve hücreler daha sonra, sabit yıkanmış ve floresan (üst panel) veya faz-kontrast (alt panel) aydınlatma altında fotoğraflandı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Grb2-SH2 engelleme peptid sağlam, canlı hücrelerde EGF-aracılı Erk aktivasyonunu inhibe eder. GJIC ve sinyal transdüksiyon çalışmaları kombinasyonudur. Ligand bağlanması takiben, Epidermal Büyüme Faktörü Rec büyüme faktörü reseptörleri arasında bir dizieptor (EGFR) spesifik tirozin artıkları üzerinde, trans-fosforile edilmiş. Bunlar böylece membran getirdi ve Ras aktive edilir GTP / GSYH değişim faktörü sos, bağlı olduğu Grb2 gibi sinyal dönüştürücüler Src homoloji-2 alanlar için yerleştirme siteleri oluşturmaktadır. Bu P TE p-Y dizisi Raf / MEK / ERK kaskadın Erk fosforilasyon aktivasyonuna neden olur. Bu nedenle, belirli bir fosfo-ERK antikorlarla tarama EGF reseptörünün aktivasyonunun bir ölçüsüdür. Tespit ardından, hücreler kahverengi bir renk veren 29 bir biyotin-bağlı ikincil antikor, streptavidin ile At turpu peroksidazı ve substrat olarak diaminobenzidin ile, bir anti-Perk antikoru (Celi Signalling) ile sondalandı. Bu deneyde, Grb2-SH2 domain (PVPE p Y INQS) engelleyen bir fosfopeptıt yerinde elektroporasyon tarafından tanıtıldı ielektroporasyon odaları ve büyüyen Nto NIH 3T3 hücreleri geçirdi ortamında büyüme-tutuklandı. 5 dakika darbe uygulamadan sonra, hücreler, 5 dakika boyunca EGF ile stimüle sabit aydınlık (en üst) veya faz kontrast (alt) ışık altında fotoğraflandı aynı alandan immünoperoksidaz stainingand hücreleri tarafından aktive fosfo-ERK1 / 2 için problanmıştır. Yani, Grb2 SH2-bloke peptit büyük ölçüde EGF sinyallerden unutmayın ERK phosphorilasyon (alan). Sinyalin engellenmesi esasen boşluk bağlantıları ile 1123 Da peptidin hareketine olmayan elektroporasyona alanına (dolambaçlı dirsek) bitişik hücrelerin 3-4 ~ içine satır, muhtemelen uzanır. Bu bulgu, bu bölgedeki hücreler herhangi bir akım alırsınız, ancak komşularından peptid satın vermedi beri gözlenen önlemenin yerine elektroporasyon bir dışlayıcı daha nedeniyle peptide olması gerektiğini ikna edici bir kanıt oluşturmaktadır. Aynı zamanda, hücre morfolojisi üzerinde herhangi bir bulgulanabilir etkisi, oradaFaz kontrast ile gösterilmiştir. Electroporated alanının kenarına noktaları ok. Büyütme: 240x. Daha fazla bilgi ve kontroller başvuru 29 için bkz. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolünde kritik adımlar
Elektroporasyona malzeme
Elektropore edilecekse Malzemenin saflığı çok önemlidir. Hücreler, çok düz ise, izleme boyanın daha yüksek konsantrasyonlarda (20 mg LY / ml kadar) ve bu gibi durumlarda kullanılmalıdır, saflık: daha da önemlisi, daha küresel bir şekle sahip 1 hücrelerinde daha uzundur. LY Bunun yanı sıra, diğer boyalar ya da nonpermeant moleküllerin büyük bir çeşitlilik, örneğin başka bir connexins 25 oluşan kanal için problar olarak kullanmak için Alexa boya bir dizi olarak, kullanılmıştır. Çekirdekler boya transferi daha zor (Şekil 4D) niceliğinin belirlenmesine yapar, çok güçlü flüoresans Ancak örneğin etidyum bromür veya propidyum iyodit gibi boyalar DNA'da eşlik etmektedir. İzleme boyalar, kalsiyum girişi kavşak çıkış yolunu kapatmak yanı sıra cel azaltabilir, çünkü hazırlanan ve yıkama kalsiyum içermeyen büyüme ortamında yürütülmelidirl canlılığı. Tüm çözümler öncesinde açıklıklarının kapanmasına ve canlılığını 1 kolaylaştırır elektroporasyon, 37 o C de tutulmalıdır.
Uygun gerilim ve kapasitans belirlenmesi
Elektrik alan gücü, hücre geçirgenliği, yanı sıra canlılığı için kritik bir parametredir. Birden palslarının tatbiki tek bir darbe daha geçirgenliğe ve hücre canlılığı açısından daha iyi sonuçlar için gösterilmiştir. Hafif (10 darbeleri, ayrı 10 ms, darbeler arasında 0.1 sn), Orta (20 darbeleri, ayrı 80 jısn'ye 0.2 darbeler arasında sn) ve Güçlü (50 bakliyat: Hücre Projelerinin Insitu Poratör cihaz kapasitans ve darbe sayısının üç ayarları vardır , 120 us dışında bakliyat arasındaki, 0.5 sn), Gerilim ince) bağımsız (2-45V kontrol edilebilir iken. Aslında, hücreler, düz alt tabaka için küçük bir yapışma alanı ile bir yığın ya da hücrelerinde daha düşük dönüştürülmüş olanları voltajını, hücre gerektirirler (örneğin, böcek Sf9 hücreleri), Muhtemelen daha büyük bir iletkenlik alanı ile temas halinde olan uzun bir hücre içinden geçen akımın daha büyük miktarda. Bu konuda daha ayrıntılı bilgi için, bkz 1.
Potansiyel sorunları ve sorun giderme
Hücreler manipülasyonlar sırasında kazınarak varsa, onlar boya pick up ve elektroporasyon (Şekil 4A) olmadan floresan olabilir. Hücrelere verilen enerji miktarı elektroporasyon verimini etkiler. Nabız çok zayıf ise (yani çok düşük gerilim ve darbe ayarları), daha sonra hücrelerin faz kontrast altında normal görünür ama onlar belki de ölmüş olabilir veya manipülasyon sırasında kazınmış olan bazı hücreleri hariç, floresan olmayan (Şekil 4A) . Darbe faz kontrast hücrelerin altında, çok güçlü ise çok koyu çekirdekleri (Şekil 4B) var görünüyor, ancak bazı LY korumak ve hatta komşu hücrelere bazı boya transferine izin verebilir. Arifesinden, daha yüksek bir darbe hücreleri (Şekil 4C) olan toplam yok edilir. Bu tür hücreler parçalanır, bu nedenle LY tutmayan ve hiç değilse, çok zayıf floresan. Böyle orta değişiklikleri sırasında çatlayabilir T51B formu kubbe yapıları gibi bazı epitel hücre hatları. Boya boşluk bağlantıları (Şekil 4E) aracılığıyla transfer edilebilir çevreleyen Hücreler daha sonra floresan olabilir. Örnek hatları için uygun elektroporasyon koşullarının örnekleri, Tablo 1 'de gösterilmektedir.
Diğer teknikleri ve önemi üzerinde Avantajları
DNA sokma
Kalsiyum-fosfat eşçökeltmesi 26 ya da lipozomlar gibi transfeksiyon farklı protokoller, çok sayıda bulunmaktadır. Ancak, özellikle de sinyal transdüksiyon çalışmaları için çok önemli olabilir, ince şekilde hücre etkileyebilir. Örneğin, sinyal dönüştürücü ve transkriptin aktivatörün Tyr-705 fosforilasyonununkendi transkripsiyon aktivitesi ile iyon-3 (Stat3) önemli ölçüde daha DNA yokluğunda Kalsiyum-fosfat transfeksiyon prosedürü ile artar. Bu durum, hücre yapışması ve çökelti kadherin bir yaklaşım, bilinen bir aktivatör Stat3 27 hücre değiştirir gerçeğine bağlı olabilir. Elektroporasyon veya retroviral enfeksiyon Stat3 seviyelerini 6 etkisi olmazken bazı lipozomlar, benzer ama daha az belirgin bir etkisi vardı.
Peptidlerin giriş
Alışılmış bir yöntemi, HIV-TAT geninden türetilen gibi, hücre zarından geçen sekanslar ile birlikte bir füzyon peptidinin bir yapı. Bununla birlikte, zarın içinden transfer nispeten yavaş bir süreçtir ve sinyal inhibisyon olarak verimli değildir. Bir ligand ile reseptör aktivasyonunun şu meydana gelen olaylar dizisinin çalışma için, bir peptidin anlık verilmesi için yeteneği, peptidomimetik veya diğer bileşiklerin önemli bir advantag sunarör. FITC ile birleştirilmiş peptidler (Raptis, yayınlanmamış) ortaya koymuştur gibi lipofilik peptidi, hücre zarının içine gömülü olduğu alımını artırmak için bir hücre-geçirgen peptidin Elektroporasyon mümkün olası değildir. Bu, (aynı peptidin elektroporasyon sinyalin 29 tam bir inhibisyonunu elde Örneğin Grb2 SH2 alanı bloke-hücre geçirgen peptidin kullanımı yoluyla da EGF ile Erk aktivasyonunun engellenmesi, 28 sadece kısmen olduğu dikkat çekicidir Şekil 5). Lipozomlar göre diğer teknikler varlığı de vardır. Bununla birlikte, malzemenin (Şekil 5, dolambaçlı dirsek verilmeden sinyal engellenmesi esasen olmalıdır mümkün olan en sert gösteri sunmak, hangi boşluk bağlantı çalışmaları ile birlikte, tedavi edilen olanlar yan işlemden geçmemiş hücrelerin de tarafının muayene izin vermez c).
Gap kavşak çalışmaları
Mikroenjeksiyonboyalar veya kazıma-yükleme yaygın olarak kullanılan, ama onlar her zaman hücresel hasara tanıtmak edilmektedir. Photobleaching sonra başka bir teknik, floresan kurtarma invaziv değil ama pahalı ekipman gerektirir ve fototoksik maddelerin oluşumu bir sorun olabilir iken birkaç hücre, bir defada muayene edilebilir. Paraşüt tahlil boya Calcein AM (yeşil) ile ön-yükleme hücrelerden oluşur, sonra gap kavşakları 15 dk-3 saat içinde meydana gibi hücreler, hücre tabakasının üzerine yapışır icar. Hücrelerin büyük bir kısmı bu şekilde tedavi edilebilir, ancak bu deneyde boşluk bağlantı yerleri meydana getirmek hücrelerinin yeteneği hücre tipi 30 derece arasında değişir.
Sınırlamalar
Gerekli olan gerilim ve nispeten büyük elektrik yükleri moleküllerinin verilmesi için daha yüksektir. Büyük plasmidlerin giriş için gerekli yüksek gerilim, bazı hücre ölümü olabilir. Farklı molekülleri için gerekli görece gerilimlerönce 9,12 tarif edilmiştir. Belirli bir elektroporasyon aparatı kullanılarak elektroporasyon anlatmakta ise de, birisi 19 yer alan ayrıntılı açıklama kısmını kullanarak bunu yapmak, veya hücre üzerinde bir üst elektrot ile daha kolay bir kurulum yapmak, ve asit 1 ile aşınmaya elektrikli ev aletleri ile deneyimli mümkündür.
Gelecek tarifi
Yazılım tam GJIC 31 ölçmek için geliştirilmiştir. Bir diğer iyileştirme, birleştirilmemiş boyayı gerek yoktur, böylece bunlar, hücre içinde sadece bir kez floresan Kuantum noktalarının geliştirilmesidir. Işlem, gerçek zamanlı canlı değil, sabit hücrelerde gözlemlenen edilebilir ise bu yıkama stresi önler. Yolakları kesmek için peptidlerin giriş saflaştırılmış bileşenler kullanılarak tespit etkileşimlerinin alaka in vivo değerlendirilmesi için güçlü bir yaklaşım. Pot incelenmesiBelirli bir geçiş yolunu önlemekte olan, farklı peptidlerin esas teşkil Neoplasianm tedavisi için rasyonel peptidomimetik ilaçların geliştirilmesinde önemli bir ilk adımdır.
Diğer yorumlar
Slaytlar kuyudaki İTO yüzeyine ulaşmak için küçük bir fırça ile Extran-1000 çözeltisi ile yıkandı ve su ile durulanabilmektedir. Hücreler lam üzerine sabitlenmiş olan, ilk önce tripsin ya da diğer proteolitik enzimler ile bir protein izlerini ortadan kaldırmak için gerekli olabilir. Sodyum Dodesil Sülfat ihtiva eden deterjanlar kaçınılmalıdır. Yıkanmış slaytlar peroksit gazı ile sterilize edilebilir. Ancak, tutucu herhangi LY çözüm sızdırıyor kısa devreye neden olabilir çünkü eğer slayt üzerine kuyunun mühür kırma önlemek için çok önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking. Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).
- Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway. Nature. 391, 285-288 (1998).
- Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth. Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).
- Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M.
- Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. Transfection techniques affecting Stat3 activity levels. Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).
- Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1. Science. 278 (5335), 124-128 (1997).
- Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP. DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).
- Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells. DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).
- Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins. Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).
- Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis. J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).
- Raptis, L., Firth, K. L.
- Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy. Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).
- Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H.
- Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors. Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).
- Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide. DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).
- Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes. Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells. Lab Invest. 78, 639-640 (1998).
- Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. Gap junctional communication in lung carcinoma cells. Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).
- Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts. DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).
- Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells. BMC Cancer. 12, 605 (2012).
- Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes. DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).
- Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities. Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).
- Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide. J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).
- Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide. Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).
- Meda, P.
- Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).
- Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts. Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).
- Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells. Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).
- Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen. Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).
