Introduction
La aplicación de corriente eléctrica a una célula provoca la formación de poros en la membrana celular, mediante un proceso denominado electroporación. Los poros permiten el paso de una variedad de moléculas nonpermeant través de la membrana. El campo eléctrico puede ser controlada con precisión, de modo que los poros formados son muy pequeñas y volver a cerrar rápidamente, con la mínima perturbación a la fisiología celular. Curiosamente, las células adherentes pueden ser cultivadas en un portaobjetos de vidrio recubierto con óxido de indio-estaño conductora y transparente (ITO) y electroporación in situ, que está en la superficie donde crecen, sin ser individual para ser a electroporación en suspensión. Las células pueden crecer muy bien en esta superficie, y como están unidos y extendidos, la observación microscópica detallada es posible. Usando esta técnica, moléculas pequeñas nonpermeant se pueden introducir de forma instantánea y en esencialmente el 100% de las células, lo que hace esta técnica especialmente adecuada para estudios sobre la activación de un borradoronents de una vía después de la estimulación del ligando de un receptor (revisado en 1).
La electroporación se ha utilizado principalmente para la introducción de ADN (también llamado electrotransfección). Sin embargo, la electroporación in situ puede ser valiosa para la introducción de una gran variedad de moléculas, tales como péptidos, oligonucleótidos 2-4, tales como ARN antisentido, oligonucleótidos de doble cadena de ADN de señuelo para inhibir la unión del factor de transcripción, o siRNA 3,5, 6, 7-10 nucleótidos radiactivos, proteínas 11 12 o profármacos 13. Después de la electroporación, las células pueden ser lisadas para los análisis bioquímicos o fijaron y se tiñeron con anticuerpos.
El recubrimiento de ITO conductor es muy delgada, 800-1,000Å, de modo que el crecimiento celular no se ve perturbado por la diferencia de altura de las dos superficies, ya que las células crecen a través del borde del revestimiento conductor. Esto ofrece la ventaja de que no electropevaporaron células pueden ser cultivadas lado a lado con los electroporación, para servir como controles. El mismo enfoque se puede utilizar para el examen de la unión brecha, la comunicación intercelular (GJIC), como se describe en el vídeo.
Gap cruces son canales que conectan los interiores de células adyacentes 14. Unión Gap, la comunicación intercelular juega un papel importante en la formación de tumores y metástasis, mientras que los oncogenes tales como Src suprimen GJIC 15,16. Para examinar GJIC un colorante fluorescente como el amarillo Lucifer (LY) a menudo se introduce en células cultivadas a través de microinyección o raspar de carga 17 y la difusión del colorante en las células vecinas se observa microscópicamente bajo iluminación de fluorescencia. Estas técnicas, sin embargo, invariablemente causan daño celular. Describimos ahora una técnica donde las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio que está parcialmente recubierto con ITO 18. Un pulso eléctrico se aplica en la presencia de LY (u otros colorantes) cautilizando su penetración en las células que crecen en la parte conductora de la corredera, mientras que la migración de colorante a las células adyacentes no se observó microscópicamente electroporación través de la iluminación de fluorescencia. Para evitar células sensibles perturbadores que pueden tender a separarse de la monocapa, un conjunto fue diseñado que no requieren un electrodo que se coloca en la parte superior de las células para aplicar la corriente eléctrica 19. Este enfoque ofrece la posibilidad de cuantificar la GJIC en un gran número de células, sin ninguna perturbación detectable con el metabolismo celular, como se indica por la ausencia de un efecto sobre la duración de la fase G1 después de la estimulación de suero 12, el aumento de los niveles de los fos proteína protooncogén (Raptis, inédito) o dos quinasas asociadas con el estrés celular, el cerdo p38 o JNK / SAPK quinasa 1. Este enfoque hace posible el examen de la relación entre los niveles de expresión de oncogenes, transformación y GJIC 18, así como el efecto de Src y Stat3 sobre GJIC en una variedad de tipos de células, incluyendo células recién cultivadas a partir de muestras de tumor de pulmón 20-23. Además, en la electroporación in situ con la configuración descrita que carece de un electrodo superior ha sido empleado con éxito para la demostración de cierre de brecha de la salida a la diferenciación adipocítico, aunque la unión celular al sustrato se reduce en esa etapa 19,24.
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Protocol
1. Plating las células en las cámaras de electroporación
- En una campana de flujo laminar, trypsinize las células utilizando una técnica estéril como de costumbre.
NOTA: Es muy importante eliminar por centrifugación todos los rastros de la tripsina, ya que pueden impedir la propagación de las células en el cristal, por lo tanto, la formación de adherentes y uniones gap. - Pipetear 1 ml de la suspensión de células en las cámaras de electroporación estériles proporcionadas con el en electroporador situ (Figura 1), y colóquelo en un 37 o C, CO 2 incubadora.
NOTA: La adhesión celular se puede mejorar en placas sobre fibronectina, colágeno, poli-lisina o de células y el tejido adhesivo (ver Tabla de Materiales). - Cuando las células han formado una capa confluente de que estén listos para el examen GJIC.
2. Procedimiento electroporación
La electroporación para el examen GJIC puede llevarse a cabo fuera de una campana de flujo laminar,ya que toma sólo unos pocos minutos. Si se requieren tiempos de incubación más largos para un experimento específico, entonces puede llevarse a cabo enteramente en una campana de flujo laminar. En todos los casos, las cámaras donde se cultivan las células deben ser estériles.
- Prepare una solución de color amarillo ml 5 mg / Lucifer: Disolver 10 mg de polvo LY (suministrado con el electroporador) en 2 ml de medio de cultivo libre de calcio. Para los experimentos que requieren tiempos de incubación más largos, filtro-esterilizar la solución y se almacena a 4 º C.
- Aspirar el medio de cultivo y se lavan las células con medio libre de calcio, teniendo cuidado de no rayar la monocapa o secar las células. Si se secan las células por lo general tienen núcleos oscuros y recoger LY sin electroporación. El efecto es más pronunciado en el centro de la diapositiva que está más expuesta a corrientes de aire (Figura 4F).
- Con una pipeta Eppendorf, pipeta la solución de colorante a las células (400 l para toda la cámara), en el borde de la cámara, ber cuidado de no tocar la capa de células.
- Coloque la cámara en el soporte suministrado con el electroporador y aplicar un pulso de la fuerza apropiada (ver Discusión).
- Aspirar cuidadosamente algo de la solución LY. Puede ser reutilizado una segunda vez para experimentos menos importantes.
- Añadir DMEM libre de calcio que contiene 10% de suero dializado.
- Se incuban las células durante 3-5 minutos en la incubadora para permitir la transferencia de colorantes a través de uniones.
NOTA: La inclusión de suero dializado en este punto ayuda de cierre de los poros. - Lavar el colorante no incorporado con DMEM libre de calcio para la observación de células vivas. Alternativamente, las células pueden fijarse en esta etapa, a través de la adición de 4% de formaldehído al pozo, después se lavaron con PBS (solución salina tamponada con fosfato). En todos los casos el lavado debe eliminar todo el fondo.
NOTA: En experimentos preliminares para determinar las condiciones óptimas, si el voltaje es demasiado bajo, entonces es posible hacer que las células se recuperan en el incubator durante unos minutos y electroporar la misma diapositiva una segunda vez, para ahorrar en el coste de diapositivas.
3. Examen microscópico
- Observar las células bajo iluminación de fluorescencia, usando un microscopio invertido equipado con el filtro apropiado para el tinte que se utiliza. Para Lucifer amarillo, excitación es 423nm, 555nm emisión, filtro WBV para un microscopio Nikon IX70.
- Eliminar los efectos de menisco mediante la colocación de un cubre de vidrio en la parte superior del plástico y, después de llenar a la cima con el líquido, para examinar la morfología celular bajo contraste de fase. Para obtener mejores imágenes, el pozo puede ser separado de la corredera, y el cubreobjetos colocado en el bastidor. Para las células fijas, el pozo puede ser llenado con glicerol para la observación microscópica, mientras que para las células vivas que debe ser llenado con medio de crecimiento.
NOTA: Lavado y fotografiar es más fácil si las células se fijan con formaldehído tras la transferencia del colorante (paso 2.7). Si las células no sont fijo, la fluorescencia se elimina de las células dentro de aproximadamente 60 min dependiendo de la introdujo en células fijadas, mientras que la fluorescencia se mantiene durante varias horas tipo de célula, la tensión y la cantidad de LY. Sin embargo, la fluorescencia se desvanece o se disipa después de O / N de incubación, incluso en células fijadas. Por esta razón, las fotografías deben tomarse pronto después de la electroporación (Figura 2).
4. La cuantificación de la comunicación intercelular
- Fotografiar las células con un objetivo de 20x bajo de fluorescencia y de contraste de fase (Figura 3).
- Identificar y marcar con una estrella las células sometidas a electroporación en la frontera con la zona de no-electroporación (Figura 2, flecha, borde electroporación).
- Identificar y marcar con un punto células fluorescentes en el lado no-electroporación, donde el colorante ha transferido a través de uniones (Figuras 3A y 3B).
- Se divide el número total decélulas fluorescentes en la zona de no-electroporación por el número de células sometidas a electroporación a lo largo del borde (Figuras 3A y 3B).
NOTA: La transferencia de al menos 200 células del borde contiguas a electroporación se calcula para cada experimento. El número obtenido es el valor GJIC.
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Representative Results
La Figura 2 muestra células de hígado de rata T51B epitelial 22, electroporación con LY y fotografiados bajo de fluorescencia (panel A y B), o de contraste de fase (C), la iluminación siguientes fijación y lavado. En el panel A, el borde de la zona de electroporación está marcado en rojo. El gradiente de la fluorescencia a la derecha de la línea roja indica la transferencia a través de uniones. En la figura 3A y 3B, la cuantificación de la brecha ocasiones la comunicación se muestra: Se identificaron las células en el borde de la zona de electroporación y marcado con una estrella, mientras que las células donde el tinte había transferidos fueron marcados con un punto. La relación muestra el número medio de células que el tinte transferido en, por célula frontera electroporación. En este ejemplo hay 57 puntos y 10 estrellas, es decir, GJIC = 5,7.
En C y D, el transductor de señal y activador de la transcripción-3 (STAT3) ha sido downregulated en T51B células Tediante expresión siRNA estable con un vector lentiviral, y esto provoca una reducción en la GJIC, como se muestra por la ausencia de transferencia 22.
Figura 1. electrodo electroporación y la corredera. (A) Vista superior: Las células se cultivan en un portaobjetos de vidrio, recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente (ITO). Una cámara de plástico se une sobre el portaobjetos, para formar un recipiente para las células y LY. El revestimiento es grabado con láser en una línea recta en el medio, formando esencialmente dos electrodos. Una presa se utiliza para desviar las corrientes hacia arriba, creando así una transición brusca de la intensidad de campo eléctrico. Proporcionar áreas no conductores, la OIC también está grabado en dos rectángulos. Actuales (flechas rojas) desde el generador de impulsos fluye desde cada punto de contacto a la otra, a través de una carretera conductora entre los rectángulos, extendiéndose en un directoion paralela a la barrera central, a continuación, sobre la presa a través del medio hasta el otro lado, la electroporación las células en las zonas paralelas a la presa. Para mayor claridad, la parte frontal de la cámara se retira (B) Vista lateral.: El portaobjetos con las células que crecen en el ITO recubiertos (verde claro) y las regiones de cristal grabado, se muestran desnudos. Cuando se añade el medio de electroporación que contiene LY a la cámara a un nivel por encima de la altura de la presa a continuación una trayectoria eléctrica entre los electrodos (+) y (-), y las células que crecen en esta área, se forma. Tenga en cuenta que la capa de ITO se muestra con un espesor exagerado para mayor claridad aunque su espesor real (800 A) es mucho menor que el espesor de las células. (C) El área de las células sometidas a electroporación a electroporación y no se muestran agrandado. El tinte es denso cerca de la presa, donde se sometieron a electroporación y se desvanece a través del borde electroporación todas las células como la concentración se debilita a través transf múltiples brecha de la salidares. Las flechas grandes indican la dirección de la transferencia de colorantes a través de uniones. Tenga en cuenta que el tamaño y el grosor de las células son exageradas para mayor claridad. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Electroporación de T51B, las células epiteliales de hígado de rata. LY se sometió a electroporación en células de hígado de rata T51B epiteliales (leve, 12 voltios). Después de unos 5 minutos. incubación, las células se fotografiaron bajo de fluorescencia (A, B) o de contraste de fase (C) de iluminación. Tenga en cuenta la amplia transferencia a través de uniones, que se muestra por el gradiente de la fluorescencia, que se extiende desde el borde del área de electroporación (flechas, línea roja en A). Al mismo tiempo, no hay daño visible en las células, una s ve bajo de contraste de fase (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La cuantificación de la transferencia de brecha de la salida. Las células en el borde de la zona de electroporación que recogió LY por electroporación (donantes de LY a las células no electroporación) fueron marcados con una estrella. Las células donde LY transferido a través de los cruces brecha fueron marcados con un punto. En (A) y (B), hay 57 puntos y 10 estrellas, es decir, GJIC = 5,7. Las células en (C) y (D) no tienen uniones gap, como lo demuestra la ausencia de un gradiente de fluorescencia. Las flechas apuntan hacia el borde de la zona de electroporación. Bar = 100 m.en / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. células (A) T51B que han sido dañados por raspado durante la manipulación. Estas células pueden recoger LY incluso sin la electroporación y pueden transferir a sus vecinos a través de uniones. (B) y (C) las células dañadas por un pulso que es demasiado fuerte. (B) T51B hígado de rata se sometieron a electroporación las células epiteliales en el ajuste suave , 20 voltios. Las células de la izquierda de la línea grabada (flecha) han sido dañados por la electroporación. En este caso, las células no se separan, sin embargo, una mirada cercana a la fotografía de contraste de fase (panel central, flecha blanca) muestra que las células tienen núcleos oscuros, mientras que presentan fluorescencia muy débil, en todo caso (panel superior). Sin embargo, transferir ªuniones gap en bruto es evidente, a las células en el lado derecho que no se electroporación. La fotografía del fondo se realizó mediante la combinación de UV y la iluminación de contraste de fase, para facilitar la visualización del borde de la electroporación. Células epiteliales de hígado (C) T51B rata electroporación ajustado al medio, 30 voltios. Las células de la izquierda de la línea grabada han sufrido graves daños por el pulso. Observe cómo las células han salido y no fluorescente. Algunos sobrevivientes alrededor del borde han recogido LY y parecen estar pasándolo a sus vecinos a la derecha a través de los cruces brecha. Células (D) T51B electroporadas con 10μg / ml de yoduro de propidio. Tenga en cuenta la intensa tinción de los núcleos. (E) Cúpulas de las células epiteliales. Células T51B a electroporación en el ajuste leve, 15 Volts. Tenga en cuenta la electroporación de las células incluso a la izquierda. Sin embargo, cuando confluentes, las células T51B formar cúpulas que puedan desprenderse durante la manipulación y el lavado, y las células circundantes pueden take hasta LY. Tenga en cuenta la amplia transferencia de colorantes. (F) Las células que se han secado puede recoger LY sin electroporation.The medio de crecimiento fue retirado de las células y T51B células se dejaron en una campana de flujo laminar durante 30 min. LY se añadió posteriormente a las células durante 1 min y las células fueron posteriormente fijado, lavado y fotografía bajo fluorescencia (panel superior) o de contraste de fases (panel inferior) de iluminación. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. El péptido de bloqueo SH2 de Grb2 inhibe la activación de Erk mediada por EGF en las células vivas, intactas. Combinación de GJIC y estudios de transducción de señales. Después de la unión de ligando, un número de receptores de factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico Receptor (EGFR) son trans-fosforilada en residuos de tirosina específicos. Estos constituyen sitios de atraque para las Src homología 2 dominios de transductores de señales, tales como Grb2, que se une a los sos factor de intercambio de GTP / PIB, que así se trajeron a la membrana y activa Ras. Esto resulta en la activación de la cascada Raf / Mek / Erk y la fosforilación de Erk en una secuencia P P Y TE. Por lo tanto, el sondeo con anticuerpos fosfo-Erk específicos puede ser una medida de la activación del receptor de EGF. Tras la fijación, las células se probaron con un anticuerpo anti-Perk (Señalización Celular), seguido por un anticuerpo secundario acoplado a biotina, estreptavidina-peroxidasa de rábano de caballo-y el sustrato de diaminobencidina, que da un color marrón 29. En este experimento, un fosfopéptido bloquea el dominio SH2 de Grb2 (PVPE p Y INQS) se introdujo por electroporación en situ into células NIH 3T3 que crecen en las cámaras de electroporación y crecimiento arrestados-en medio gastado. 5 min después de la aplicación del pulso, las células fueron estimuladas con EGF durante 5 min, se fijaron, probaron para activado fosfato ERK1 / 2 por las células stainingand inmunoperoxidasa del mismo campo fotografiado bajo campo claro (arriba) o de contraste de fase (parte inferior) de iluminación. Tenga en cuenta que el péptido bloquea SH2 de Grb2 reduce drásticamente la señal de EGF, es decir, la fosforilación de ERK (zona A). La inhibición de la señal se extiende en ~ 3-4 hileras de células adyacentes en el área de no-electroporación (serpenteante soporte), probablemente debido al movimiento del Da péptido 1123 a través de uniones. Este hallazgo constituye evidencia convincente de que la inhibición observada debe ser debido al péptido, en lugar de un artefacto de la electroporación, ya que las células en esta área no recibieron ninguna corriente, pero adquirieron el péptido de sus vecinos. Al mismo tiempo, no hay ningún efecto detectable en la morfología celular comomostrado por contraste de fase. La flecha apunta hacia el borde de la zona de electroporación. Ampliación: 240x. Para más detalles y controles, véase la referencia 29. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos en el protocolo
Material de electroporados
La pureza del material que se va a electroporación es muy importante. Si las células son muy planas, se deben utilizar concentraciones más altas de entonces el colorante de seguimiento (hasta 20 mg / ml para LY) y en tales casos, la pureza es incluso más importante que en las células con una forma más esférica 1. Además LY han empleado una gran variedad de otros colorantes o moléculas nonpermeant, tales como una serie de colorantes Alexa para utilizar como sondas para los canales que constan de diferentes conexinas 25. Sin embargo, colorantes tales como bromuro de etidio o yoduro de propidio se intercalan en el ADN de modo que los núcleos de fluorescencia muy fuertemente, lo que hace la cuantificación de la transferencia de colorantes más difícil (Figura 4D). Los colorantes de rastreo deben ser preparados y lavados llevaron a cabo en medio de crecimiento libre de calcio, porque una afluencia de calcio puede interrumpir la comunicación de la unión, así como reducir cell viabilidad. Todas las soluciones deben mantenerse a 37 ° C antes de la electroporación, lo que facilita el cierre de los poros y la viabilidad 1.
Determinación de la tensión y la capacitancia óptima
Intensidad de campo eléctrico es un parámetro crítico para la penetración celular, así como la viabilidad. La aplicación de múltiples pulsos se ha demostrado para ofrecer mejores resultados en términos de permeación y la viabilidad celular de un solo pulso. El aparato Insitu Porator de Proyectos Cell tiene tres ajustes de capacidad y número de pulsos: leve (10 pulsos, 10 microsegundos de diferencia, 0,1 segundos entre pulsos), Mediano (20 pulsos, 80 ms de diferencia, 0,2 segundos entre pulsos) y Strong (50 pulsos , 120 ms de diferencia, 0,5 seg entre los impulsos), mientras que el voltaje puede ser controlado independientemente finamente (2-45V). De hecho, las células planas requieren voltajes más bajos que los transformadas, las células en un grupo o células con una pequeña área de adhesión al sustrato (por ejemplo, células de insectos Sf9), Posiblemente debido a las grandes cantidades de corriente que pasa a través de una célula extendida que está en contacto con una superficie conductora más grande. Para más detalles sobre este tema, por favor consulte 1.
Los posibles problemas y solución de problemas
Si las células han sido raspada durante las manipulaciones, pueden recoger el colorante fluorescente y sin electroporación (Figura 4A). La cantidad de energía suministrada a las células afecta la eficiencia de la electroporación. Si el pulso es muy débil (es decir, demasiado bajo tensión y la configuración de pulsos), entonces aparecen normal bajo contraste de fase de las células pero que no son fluorescentes, excepto quizás para ciertas células que pueden estar muerto o han sido raspadas durante la manipulación (Figura 4A) . Si el pulso es demasiado fuerte, en virtud de las células de contraste de fase parecen tener núcleos muy oscuros (Figura 4B), pero pueden retener LY, e incluso permitir una cierta transferencia de colorante a las células vecinas. En vísperasn pulsos más altos que las células se destruyen (Figura 4C). Tales células se lisan, por lo tanto, no retienen LY y fluorescencia muy débilmente, en todo caso. Ciertas líneas de células epiteliales como T51B estructuras forma de cúpula que puedan desprenderse durante cambios de medio. Las células circundantes pueden entonces fluorescencia medida que el tinte se puede transferir a través de uniones (Figura 4E). Ejemplos de condiciones de electroporación óptimas para líneas representativos se muestran en la Tabla 1.
Las ventajas sobre otras técnicas e importancia
Introducción de ADN
Hay un gran número de protocolos de transfección, tales como calcio-fosfato de co-precipitación o 26 diferentes tipos de liposomas. Sin embargo, pueden afectar a la célula de maneras sutiles que pueden ser muy importantes, especialmente para estudios de transducción de señales. Por ejemplo, la fosforilación de Tyr-705 del transductor de señal y activador de la transcripciónion-3 (STAT3) que se correlaciona con su actividad transcripcional se incrementa dramáticamente por el procedimiento de transfección con fosfato de calcio, incluso en ausencia de ADN. Esto podría ser debido al hecho de que el precipitado de células altera a la adhesión celular y el compromiso cadherina, un conocido activador de Stat3 27. Ciertos liposomas tuvieron un efecto similar, pero menos pronunciada, mientras que la electroporación o infección retroviral no afectan los niveles de Stat3 6.
La introducción de péptidos
Un método común es la construcción de un péptido de fusión con secuencias que cruzan la membrana celular, tales como derivados del gen tat del VIH-. Sin embargo, la transferencia a través de la membrana es un proceso relativamente lento y la inhibición de la señal no es tan eficiente. Para el estudio de la secuencia de eventos que ocurren siguiente activación del receptor por un ligando, la capacidad para la introducción inmediata de un péptido, peptidomimético o de otro compuesto ofrece una importante advantage. Electroporación de un péptido permeable a las células para acelerar su absorción no es posible, probablemente porque el péptido lipófilo está incrustado en la membrana celular, como se revela con péptidos acoplados a FITC (Raptis, no publicado). Es interesante observar que la inhibición de la activación de ERK por el EGF mediante el uso de una célula permeable péptido bloquea el dominio SH2 de Grb2 por ejemplo, fue sólo parcial 28, mientras que la electroporación de la misma péptido logró una inhibición completa de la señal 29 ( la Figura 5). Otras técnicas, basadas en liposomas también están en existencia. Sin embargo, no permiten el examen de las células no tratadas lado a lado con los tratados, en conjunción con estudios de brecha de la salida, que puede ofrecer la más fuerte demostración posible que la inhibición de la señal debe ser debido al material que se introduce (Figura 5, el soporte serpenteante , c).
Los estudios de unión Gap
Microinyecciónde colorantes o raspado de carga se emplean comúnmente, pero invariablemente presentan daño celular. Otra técnica, la recuperación de la fluorescencia después de photobleaching no es invasiva, pero requiere un equipo caro, y pocas células puede ser examinado en un momento, mientras que la formación de sustancias fototóxicas puede ser un problema. El ensayo consiste en paracaídas de las células pre-carga con el colorante calceína AM (verde), a continuación, dejando que las células se adhieren sobre una capa de células, como uniones gap se forman dentro de 15 min-3 hrs. Un gran número de células puede ser tratada de esta manera, pero la capacidad de las células para formar uniones gap en este ensayo varía enormemente con el tipo de célula 30.
Limitaciones
La tensión requerida es mayor para la introducción de moléculas de mayor tamaño y cargas eléctricas. A las altas tensiones necesarias para la introducción de plásmidos grandes, puede haber algo de muerte celular. Los voltajes relativos necesarios para diferentes moléculasse han descrito previamente 9,12. Aunque se describe la electroporación utilizando un aparato de electroporación específica, es posible que alguien con experiencia en aparatos eléctricos para hacer que el uso de la descripción detallada en 19, o hacer una configuración más simple con un electrodo superior por encima de las células, y grabar con ácidos 1.
Orientaciones futuras
Software han sido desarrollados para cuantificar con precisión GJIC 31. Una mejora adicional es el desarrollo de puntos cuánticos que emiten fluorescencia sólo una vez que están en la célula, por lo que no hay necesidad de lavar el colorante no incorporado. Esto evita el estrés de lavado, mientras que el proceso puede ser observado en células vivas, no fijadas en tiempo real. La introducción de péptidos para interrumpir las rutas de señalización es un enfoque poderoso para la evaluación in vivo de la relevancia de las interacciones identificadas usando componentes purificados. El examen de la ollacial de diferentes péptidos para inhibir una vía específica es el primer paso importante en el desarrollo de fármacos peptidomiméticos, para el tratamiento racional de la neoplasia.
Otros comentarios
Los portaobjetos se pueden lavar con Extran-1000 solución usando un pequeño pincel para llegar a la superficie de ITO en el pozo, y se enjuagaron con agua. Si las células se han fijado en la diapositiva, puede ser necesario para eliminar las trazas de proteína con tripsina u otras enzimas proteolíticas primero. Dodecilsulfato de sodio que contienen detergentes deben ser evitados. Diapositivas lavados se pueden esterilizar con gas de peróxido. Sin embargo, es muy importante para evitar que se rompa el sello del pozo en la diapositiva porque si cualquier fuga de solución LY en el soporte que puede causar un corto circuito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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