Summary
アフリカツメガエルのオタマジャクシは黒/白のタンクの白側水泳を好むツメガエル 。この現象は、それらの視覚によって案内される。この動作に基づいて、我々はオタマジャクシの視覚機能をテストするための簡単な分析を提示する。
Abstract
カエルのオタマジャクシにおける視覚機能の測定は、 アフリカツメガエル 、生きた動物で失明のためのスクリーニングが可能となる。視運動性応答は試験した全ての脊椎動物で観察されている視覚ベース、反射的な動作です。従ってテールフリップ応答が微妙応答を記録するための訓練を受けた技術者を必要とする別の尺度として使用したオタマジャクシの目が小さい。私たちは、オタマジャクシは黒と白の両サイドにタンク内に置かれたとき、タンクの白い側に泳ぐことを好むという事実に基づいて、代替行動アッセイを開発した。ここで紹介するアッセイは、容易に測定された応答を作成し、安価な、簡単な代替手段です。セットアップは、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で容易に利用可能、三脚、ウェブカメラと、ネストされたテスト用のタンクで構成されています。この記事では、前と視神経を切断した後、オタマジャクシの挙動を示すのムービーが含まれています。片目の機能をテストするために、我々はまた、REPREを含むそれぞれの目には連続した日に、網膜軸索切断を受けているオタマジャクシのsentative結果。今後の研究では、一度に多くのオタマジャクシのビジョンをテストするためにこのアッセイの自動化されたバージョンを開発することもできます。
Introduction
アフリカツメガエルは、眼の形成を研究するためのモデル生物として用いられてきた。目はビジュアル開発と機能に影響を与える遺伝子または経路をテストするための一週間も経たないうちに満期まで成長し、急速に開発しています。視覚機能をテストするには、視運動と微細運動応答は、それぞれ1,2、ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルのオタマジャクシで使用されている。 アフリカツメガエルのオタマジャクシの目はゼブラフィッシュよりも比較的小さいので、このアッセイは、 アフリカツメガエルの微妙なテールフリップと眼球運動の挙動を検出するために、特殊な装置を使用し、訓練された人材を必要とします。 アフリカツメガエルにおけるより堅牢な動作がここに記述されている3、白背景、とのタンクで泳ぐための好みです。半分黒/ハーフ白タンクにオタマジャクシを配置するときに、事前に変成オタマジャクシはすぐにタンクの白側に泳ぐ。我々は以前、多能性細胞由来かどうかを判断するためにこのアッセイを使用目は4機能的であった。ここでは、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシの視覚機能をテストするために使用され得るこのアッセイの詳細なバージョンを、報告する。
それだけで、ほとんどのアフリカツメガエルの研究室で発見搭載したデジタルビデオカメラ、デジタルカメラのソフトウェアや標準的な装置を必要とするので、このアッセイは、微細運動応答アッセイよりも簡単である。また、記録された応答は、集計結果に特別なトレーニングを必要としません。当社の代表的な結果は、二重の網膜軸索切断を受けたオタマジャクシの同じグループは、タンクの周りにランダムに泳ぐことを示している。また、片方の眼は、視覚的応答を試験することができる方法を示す、代表的なオタマジャクシから行動アッセイの結果が含まれている。アッセイの間に取得された数値が挿入され、分析することができるようにワークシートが含まれている。このワークシートは、試験したオタマジャクシは、視覚的応答を有するか否かを決定するために使用することができる。
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Protocol
動物ケア
アフリカツメガエルは、本研究で用いたオタマジャクシがアップステート医科大学動物実験委員会および実験動物の管理と使用に関する指針によって承認された手順に従って上昇し、治療、成長させたツメガエル 。
1前の行動セットアップ：オタマジャクシ
- 市販のソースから受精アフリカツメガエル胚を入手するか、以前に記載したように、6 in vitroで 、卵母細胞を受精。
- 20のKCl;; 20のCaCl 2、50mMのHEPES 0.1X MMR [10×Marcの修正リンゲル（MMR）は、溶液の在庫（10 mMのMgCl 2を含む60ミリメートルペトリ皿に18˚Cで神経板期胚への胞胚を置く。 1 MのNaCl、50μg/ mlのゲンタマイシン抗生物質]）、pH7.5に調整し、オートクレーブにかけ、室温で保存した。毎日0.1X MMRを変更し、デッド胚を削除します。
- 胚はNieuwkoopとフェーバー段階に到達したら〜27から30 7、目を切り替える抗生物質なしの0.1X MMRへのE胚腸細菌の増殖を可能とする。
- 彼らは供給ステージ（ステージ45）に到達するまで、オタマジャクシを育て、0.1X MMRで満たさ100ミリメートルペトリ皿に移動します。介入の日に0.1X MMRを変える、一週間、一日おきに、彼らにイラクサ粉末上清フィード。
- 100ミリメートルペトリ皿中の1週間後、カエルの水で満たされた半ガロンのタンクに動物を移動し、[0.5グラム/ Lの瞬間、海と2 mMリン酸ナトリウム二塩基性（のNa 2 HPO 4：141.96 MW）のpH 6.8]。ステップ2.4のように、彼らを養うが、水が濁っている場合には、水を週に2〜3回だけを変更してください。ライトは6時にオンにして、12時間のlight/12明暗サイクルで動物を維持する。
- 試験前に、少なくとも12時間、O / N、実験台のアンダーパッドのような白い表面の試験対象と半ガロンタンクを配置します。
- ステージ45から50の試験オタマジャクシは以下の手順3で説明。
2前行動セットアップ：技術設備T
- 行動分析のための実験室の面積を取っておく。これは、標準的な蛍光灯の静かな、低トラフィックエリアである必要があります。
- 動物のためのテストタンクを準備します。
ネストされた、半ガロン試験槽は2つの部分から構成されています。水やオタマジャクシを開催する内槽;および視覚刺激と外槽。- 内槽の場合は、シャーピー、一番下から5cmと外側の角に小さなマークを作る。これは水ライン（ 図1A、緑の点線）である。
- また、内槽のために、シルガードエラストマーのような不活性化合物と（コーナーと中央）タンク内のdivetsを埋める。注：これらは記入されていない場合は、オタマジャクシは、これらの分野に残るでしょう
- 外槽の場合は、1黒い絶縁テープでタンクと白のティッシュペーパー図1Bとの残りの半分の外のちょうど半分をカバーしています。
- 上のタンクを配置ターンテーブルを接種する。
- セットアップウェブカメラ/三脚には、テスト用のタンクの上になるように。 図1Cに示すように、検査部位の視覚化を可能にするようにカメラを調整する。
- 5をインストールしたQuickTime PlayerソフトウェアでコンピュータにWebカメラを接続してください。カメラの電源を入れます。 QuickTime Playerのでは、ファイルの下に、「新しい動画撮影を。」を選択行動分析のセットアップがすぐにコンピュータ上で表示されます。
- オタマジャクシ動作に影響を与える可能性があり、外部の合図を低減、ならびに、水の表面での反射光を低減するためにセットアップ全体にわたって軽量綿布ドレープ。
- 35〜50のCD / m 2で布措置に基づく輝度いることを確認してください。
3。行動アッセイ
- カエルの水でステップ1.2.1で行われた5cmのウォーターマーク、内側テスト給油して下さい。
- 小さなネットを使用して、ゆっくりと内部テストタンクに動物を移動します。
- オープンQコンピュータと、ガイドとして外槽の使用についてuickTimeソフトウェアは、カメラのテストエリアを視覚化し、記録することができることを確認してください。
- カメラで紙や記録の一部に、動物の名前、日付と時刻を書き込みます。
- 右図2に、タンクの黒い面と外槽に試験水槽を配置します。
- タンクを配置した直後に動画撮影を開始し、2分間のタイマーをセットします。
- タイマービープ音は、内部試験水槽を削除すると、外槽を180°回転させ、外槽の内側にインナー試験水槽を配置します。タイマーを開始する。注：黒側は、現在、他の側に配置する必要があります。
- 10の試験の合計ステップ3.7、8回繰り返します。各試行をオフにチェックし、ガイドとして、図2を使用してください。
- 2別の日に行動分析を繰り返します。
4。網膜軸索切断
- 彼らが応答しなくなるまで0.02％トリカイン動物を配置＃3ピンセットで尾のピンチに。
- 0.1X MMR中の1％アガロースを融解し、次いで60ミリメートルのペトリ皿に入れる。いったん冷却し、アガロース中に小さな長方形のディボットを作り、動物が部分的に液体に沈められるように、少し0.02％トリカインでディボットにオタマジャクシを追加します。
- ピアース25 G針で目の背部の後ろに45度の角度で肌、反対側の鉗子に対して動物をブレースながら。
- 視神経の隣にある静脈をチョキチョキしないように注意しながら、慎重に、＃5ピンセットで穴に達する視神経を切り取ると邪魔にそれを反転。重度の出血が原因で誤って動脈を切り取るに存在する場合には、すぐに安楽死させるために、2％トリカイン動物を配置します。注意：トリカイン液2％がヒトにしびれを引き起こす可能性があります。このソリューションは、手袋をして取り扱ってください。
- 動物を回復するために、手術後、0.7X MMRで100ミリメートルペトリ皿と20分間50μg/ mlのゲンタマイシン動物を配置します。 NEXT、カエルの水で回収タンクにオタマジャクシを移す。てみよう動物の残りのO / N
- 翌朝、（3.1から3.9ステップ）上記のような視覚機能をテストします。
5。結果の分析
- 試験が終了した後、オタマジャクシは、タンクの黒い面に留まる時間を測定する。
- 手動で時刻を表示し、頻繁に一時停止を可能にするソフトウェアを使用して動画を表示する。映像の表示時間を見てください。内槽が正常に外槽の内側に入れ子にし、カメラのビューで二乗されたときである2分間の裁判の開始を書き留めます。
- 動物が上の泳いでいる水槽のどちら側を定義するためにオタマジャクシの目の位置を使用してください。両眼が黒/白のラインを越えた場合にのみ、他にタンクの片側からクロスオーバー定義します。
- 動物は、黒側に費やすことを（秒単位）の各区間の始まりと終わりを書き留めます。一時停止して再正確さを保証するためにビデオを巻き。各試行内の秒の合計。
- 付属の行動のためのワークシートに入力これらの番号を。に費やした合計秒 - ワークシートには、動物が（120 [秒で合計時間で合計120秒のトライアル·アンド·ディバイドから、タンクの黒い面に費やす時間を差し引くことにより、白側に費やした時間の割合を計算します黒側）/ 120秒]。全10試行以上のワークシートの平均は、この比率。
- 日の間試験は（P≤0.05）が有意であるかどうかを判断するためにスチューデントのt検定、対の、両側分布を使用してください。
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Representative Results
以前の報告は、我々はオタマジャクシのどちらかの目の視覚機能をテストするために、このアッセイを変更した、変態前のアフリカツメガエルのオタマジャクシは、白/黒のタンクの白側に泳ぐと、このアッセイと呼ばれることを好むことを背景色嗜好のアッセイ3を示している週間足らず。このようにして、彼らの目は、組織学的検査のために収集することができる。
私たちは、応答が視覚的手がかりに起因しているかをここに表示されます。 動画1は、左右のパネル内のオタマジャクシは、同じ動物である。左の両方の視神経を切断した後、手術前、右、動物に動物である。私たちは、何も黒い面から動物を撃退するか、白側にそれらを誘致するために追加されていないことを示すために水を旋回。映画では、動物の組ごとに視神経の状態を示している底部コーナーでオタマジャクシの概略図を提供する。 動画1、ノーマル、U内N-操作オタマジャクシブラインドオタマジャクシがタンクの周りにあてもなく泳ぎながら試験水槽に30秒未満で背景色に反応する。ムービーの速度が増加し、実際の時間は、右上隅に記録される。
片方の目の視力をテストするために、我々は視神経1の目に切断し、我々のアッセイで試験した動物から得られた結果が含まれている。他の眼の中の視神経は、テストの2日後に切断され、視覚誘導挙動は再び次の日に試験した。 図3では、グラフはオタマジャクシがタンクの黒い面に泳ぐことを選んだ時間の長さを示しています。これは、6つの連続した日の、図3Aで測定した。前述したように動作が2日、左でテストされた後に、右視神経が4日目の行動試験の後、切断されました。オタマジャクシは時間図3Cの50％でランダムにタンクの白側を好んだ。 ANことに注意してください位側は、1〜4日の最後の6試験中にタンクの白側に多くの時間を費やした。黒側に費やされる時間の量は、動物が両方の目には見えなかった日5および6の上に、より均一であった。二日間の各々からの結果を一緒に平均化し、グラフ形式で図3Cに示された。
図1。視覚誘導行動アッセイの実験設備。（A）内部テストタンクは透明のままであり、（緑のコーナーで破線）水位を示すためにマークされている。（B）の外側の試験槽は黒で覆われている半分および他の白ティッシュペーパーに電気テープ。（C）オタマジャクシがウェブカム三脚上に置き、ポータブルコンピュータに接続を使用して可視化される。テストタンクS試験間容易な回転を可能にするために接種するターンテーブル上に置きます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。視覚誘導行動分析の実行方法の概略。長方形は、各試行でどのように半分白/ハーフ黒面積の変化を示す、試験水槽を表す。これは、試行番号をマークするために行動アッセイ中に使用することができる。右のテストタンクは2分のアッセイの間オタマジャクシとその予想される動作をクローズアップしている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ホアヒン - ページ= "常に"> 
図3。代表的な実験は、試験水槽の白側のオタマジャクシ泳い時間の割合を集計。（A）秒の量は、タンクの黒い面に費やしたオタマジャクシが表に測定され、配置されます。（B ）Aの表は、タンクの白側のに費やされる時間の割合に変換されます。これは、全試行時間（120秒）から黒側に費やさ秒を差し引くと120秒で割ることによって行われます。 （U）未処理だったオタマジャクシは、単一の軸索切断（SA）を持っていたし、次にダブル軸索切断（DA）を試験した。（C）のグラフは（白側（白いバー）、黒側で過ごした時間の平均割合を表す黒いバー）。グラフを作製するために使用される表を以下に示す。g3highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
映画の1。左と右のパネルにある白い背景の嗜好分析。オタマジャクシにおける弱視と盲の動物の行動反応は同じですが、右のものは二重の網膜軸索切断を受けている。底部コーナーの回路図は、視神経が完全な、または切断（青色のバー）であるかどうかを示します。右上隅のタイマは時間を示している。映画は見やすく高速化されている。かつて白い部分で、オタマジャクシが近い白と黒と逆方向の境界に泳ぐことに注意してください。 動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| DAY 1 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | 5日目 | 6日目 | |
| トライアル1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 裁判2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 裁判3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 裁判4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 裁判5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ TD> | 0 |
| 裁判6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| トライアル7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| トライアル8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| トライアル9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| トライアル10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 白側に費やされる時間の割合 | ||||||
| 比1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 比10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 平均 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <TD> 1.00|
| 1日目 | 2日目 | 3日目 | 4日目 | 5日目 | 6日目 | |
| トライアル1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| 裁判2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| 裁判3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| 裁判4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| 裁判5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| 裁判6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| トライアル7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| トライアル8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| トライアル9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| トライアル10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| 白側に費やされる時間の割合 > | ||||||
| 比1 | 100パーセント | 100パーセント | 100パーセント | 100パーセント | 43％ | 43％ |
| 比2 | 100パーセント | 98パーセント | 100パーセント | 27％ | 43％ | 52％ |
| 比3 | 94パーセント | 100パーセント | 77パーセント | 100パーセント | 52％ | 61パーセント |
| 比4 | 100パーセント | 100パーセント | 91パーセント | 100パーセント | 51％ | 40％ |
| 比5 | 100パーセント | 100パーセント | 94パーセント | 82パーセント | 53％ | 53％ |
| 99パーセント | 18％ | 97パーセント | 53％ | 43％ | 56パーセント | |
| 比7 | 100パーセント | 89パーセント | 73パーセント | 80パーセント | 63パーセント | 53％ |
| 比8 | 100パーセント | 6％ | 68％ | 80パーセント | 70％ | 47％ |
| 比9 | 100パーセント | 100パーセント | 97パーセント | 64パーセント | 50％ | 53％ |
| 比10 | 99パーセント | 83パーセント | 100パーセント | 73パーセント | 48％ | 33％ |
| 平均 | 99パーセント | 79パーセント | 90％ | 76％ | 51％ | 49％ |
ワークシート1。白地優先アッセイワークシート。このワークシートは、それが数字と集計結果を入力するために使用することができるように建設され、計算されています。
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Discussion
ここでは簡単に最小限の訓練を受けた研究室の担当者が週の下で実行することができる簡単な視覚誘導行動分析を報告する。他のアッセイは、動物の行動に特化した設備や専門知識を必要としますが、このアッセイは、視覚的な機能を決定するために簡単なテストを可能にする。別の行動分析、ビジュアル回避アッセイは、蓋がアフリカツメガエル 10内視知覚に貢献する方法を決定するために開発されました。このアッセイは、安定した背景に対して移動に応じた施策の空間的調整とコントラスト感度、したがって、ここで報告されたシンプルなアッセイより専門的なビジョンに基づく行動を測定することができます。自動化された行動システムはタンク8の一方の側に費やす時間の量を測定することが報告されている。暗いまたは明るい環境9で過ごす時間ゼブラフィッシュの量を測定するために使用されている市販のソフトウェア（ 例えば ANY-迷路ソフトウェア）もある。 Assay我々は高価な機器やソフトウェアのこれらの種類を購入する必要はありません、ここで報告しているが、代わりに視覚機能を測定するために、日常の試薬や機器に依存しています。
視覚誘導アッセイは、その視覚的な機能をテストするために1動物に対して行われる。お互いにいくつかのオタマジャクシの行動アッセイ結果を比較すると、我々は、処置群内の動物間で有意差は観察されなかった。私たちは、6日連続で3オタマジャクシをテストし、また、一日あたり10回の試行を実行して、3日連続で別の5匹の動物をテストしました。いずれにしても、我々は、未処理または単一の軸索切断群（P = 0.2067）の間で統計的に有意な変化は認められなかったが、これらの動物は、二重軸索切断群（P = 0.002）と比較した統計学的に有意な変化を得た。これは、Tukeyの多重比較検定（nは8オタマジャクシ）で2ウェイANOVA統計検定を実行するプリズム6.0cソフトウェアを用いて測定した。最大を持っている手術前のデータポイント量は、6日間の行動アッセイを使用して示唆している。結果は、組織の少ない変性に速く得られる必要がある場合、我々は3日間のシステムを使用してお勧めします。
このアッセイは、一度に1つの動物を試験する。我々は2つのオタマジャクシ以上を同時に測定することができたかどうかを確認するためのパイロット研究を行った。 1タンクに2オタマジャクシを有するタンクの白側のために自分の好みに影響を与えたかどうかを判断するために、私たちは一緒に、別々にして、それぞれのオタマジャクシをテストしました。画像はタンクの上に取られたのでオタマジャクシは時間の任意の長さのために互いに上または下に泳いでいる場合、我々はそれが難しいそれらを区別することがわかった。我々は、異なるサイズのオタマジャクシを使用した場合、我々はより大きな1はどこ小さい1泳いに影響を与えることを観察した。将来の技術は、遺伝的に開発することができた、同じサイズの複数の動物のよりよい追跡を可能にオタマジャクシをマーク。
tadpoの数十にこのアッセイを実施中LESは、我々はいくつかのオタマジャクシは、より一貫して他のものよりも白側を優先することを観察した。その動作が2日連続で10％を超えて変動しオタマジャクシ、、我々はかかるだろうが、手術の前に三日目に再び試験した。これは、別の観察であったかもしれない：私たちは、白い背景の上に動物を配置することも、タンクの白側のための彼らの好みの違いを作ったことに気づいた。その余分な一日持つことは、タンクの白側を好むためにいくつかのオタマジャクシを条件付け役立っている可能性があります。このアッセイの制限は、それが唯一の視覚機能をテストすることである。我々が観察したばらつきを少なく視覚機能や失明のほかに、他の発達の欠陥が原因である可能性があります。このため、手術前に60％未満の嗜好性を示した動物は、さらにテストされていません。
また、事前に変成オタマジャクシの年齢の範囲をテストした。我々は、ステージ45より若いオタマジャクシが非常に小さく、彼らの目は私たちの私たちを使用して追跡することが困難であることがわかったBCAM。古いオタマジャクシ（ステージ51から55 +）は、より気を取らなかった。彼らは最終的には、タンクの白側に多くの時間を費やしたが、彼らはそこに泳ぐ時間がかかるようです。これらの古い動物は大きかったし、そのため、より簡単に追跡することが、上記のように手術前にテストする必要がありました。これとは対照的に、予想通り、50までのステージ45のオタマジャクシの大半は行儀、これらの年齢の動物は、今後の研究で使用するのがベストでしょう。
概日の光の変化は、 アフリカツメガエル 2の視覚誘導行動応答に影響を及ぼすことが示されている。この観察と一致して、我々はすぐに午前中に実施された試験では、試験槽の白側に泳い同じ動物が、午後の行動試験中にずっと時間がかかったことに気づいた。 「同じ動物/別の時間」の試行回数を行った後、我々は午前6時から午後1時までだった行動分析のための最高の時間を決定した。
我々はまた、デジタルhandhを使用していた暗い場所5の下で動物をテストするためには、FireWireで接続されたELDビデオカメラ。これは、動物が見て、その桿体を使用している、夜間または暗所視のテストを可能にした。条件は、単に視覚誘導アッセイを行うために、動物に必要な光の最小量を求めることにより変更した。ここで紹介するアッセイは、動物が主に見て、その錐体視を利用している、明所視をテストします。これらのアプローチを組み合わせることによって、視覚、暗所視と明所両方のタイプは、試験することができる。
我々は、本質的に発現し、目のフィールド転写因子および外因性要因、ノギンを過剰発現する多能性細胞から成長させた異所目で動物の視覚機能をテストするために、このアッセイを使用していました。これらの組織から発生した目は4,11機能的であった。ノギンはまた、前の中枢神経系の発達12において役割を果たしているが、動物キャップtrのと併せて、この視覚誘導アッセイを用いてansplantアッセイは、眼の発生における役割を明らかにした。初期胚形成に影響を与えるが、まだ眼の発生において役割が多能性アニマルキャップ細胞4,11網膜前駆細胞の形成を誘導し得る有することが示されていない他の外因性要因。この行動のアッセイを用いて、将来の研究は、これらの新たに生成された眼の視覚機能を決定することができる。
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Acknowledgments
EY015748、EY017964（MEZ）、およびEY019517（ASV）：この作品は、国立衛生研究所からの補助金によって賄われていた。この作品はまた、眼科部門及びセントラルニューヨークのライオンズに失明無制限グラントを防止するための研究によってサポートされていました。我々はまた、動物の彼の優れたケアのためのこのビデオに出演するにはステップのために、私たちの動物技術者、マシュー·メリーニに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
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