Summary
Girinos de Xenopus laevis preferem nadar no lado branco de um tanque preto / branco. Este comportamento é guiado pela sua visão. Com base nesse comportamento, apresentamos um ensaio simples para testar a função visual de girinos.
Abstract
Medição da função visual nos girinos do sapo, Xenopus laevis, permite a triagem para a cegueira de animais vivos. A resposta optocinéticos é, um comportamento reflexiva à base de visão que tem sido observada em todos os vertebrados testados. Girino olhos são pequenos para que a resposta da cauda da aleta foi usada como medida alternativa, o que requer um técnico treinado para registrar a resposta sutil. Foi desenvolvido um ensaio de comportamento alternativo, baseado no facto de que os girinos preferem nadar no lado branco do tanque, quando colocado num tanque com lados tanto a preto e branco. O ensaio aqui apresentado é uma alternativa de baixo custo, simples que cria uma resposta que pode ser facilmente medido. A instalação consiste em um tripé, webcam e tanques de teste aninhados, prontamente disponível na maioria dos laboratórios de Xenopus. Este artigo inclui um filme que mostra o comportamento de girinos, antes e depois do corte do nervo óptico. A fim de testar a função de um olho, também incluem represenresultados representativa de um girino em que cada olho sofreu axotomia da retina em dias consecutivos. Estudos futuros poderia desenvolver uma versão automatizada deste ensaio para testar a visão de muitos girinos de uma só vez.
Introduction
Xenopus laevis foram utilizados como um organismo modelo para estudar a formação do olho. Os olhos se desenvolvem rapidamente, crescendo para a maturidade em menos de uma semana para testar genes ou vias que têm um efeito sobre o desenvolvimento visual e função. Para testar a função visual, a resposta optocinéticos optomotor e tem sido usado em peixes-zebra e girinos de Xenopus, respectivamente, de 1,2. Porque os olhos de girinos de Xenopus são relativamente menores do que peixe-zebra, este ensaio requer o uso de equipamento especializado e pessoal treinado para detectar o comportamento sutil cauda-flip e olho-movimento em Xenopus. Um comportamento mais robusto em Xenopus é a preferência para nadar em um tanque com um fundo branco, que é aqui descrito 3. Ao colocar um girino em um tanque preto / meia branca meia, o girino pré-metamórfica nada rapidamente para o lado branco do tanque. Nós anteriormente utilizado neste ensaio para determinar se o derivado de células pluripotentesolhos eram funcional 4. Aqui, apresentamos uma versão detalhada deste ensaio, que pode ser usado para testar a função visual de girinos de Xenopus premetamorphic.
Este ensaio é mais simples do que o ensaio de resposta optomotor, uma vez que requer apenas uma câmara de vídeo montada digital, câmera digital e software de equipamentos padrão encontrado na maioria dos laboratórios de Xenopus. Além disso, a resposta registrada não requer nenhum treinamento especial para resultados tally. Nossos resultados representativos mostram que o mesmo grupo de girinos, tendo sofrido axotomia retina dupla, nadam aleatoriamente em torno do tanque. Também foram incluídos os resultados do ensaio de comportamento de um girino representativo, mostrando como um olho podem ser testados para a resposta visual. A folha de cálculo foi incluída de modo que os números adquiridos durante o ensaio pode ser inserido e analisados. Esta folha pode ser utilizado para determinar se os girinos testados têm uma resposta visual.
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Protocol
Animal Care
A Xenopus laevis girinos utilizados neste estudo foram cultivados, criados e tratados de acordo com procedimentos aprovados pelo Upstate Medical University IACUC eo Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
1. Instalação Pré-comportamento: Os girinos
- Obter embriões de Xenopus fertilizados a partir de uma fonte disponível comercialmente ou fertilizar os oócitos in vitro, como descrito anteriormente 6.
- Coloque blastula de embriões em estágio placa neural em 18 ˚ C em 60 milímetros placas de Petri contendo 0,1 X MMR [10 Modificado estoque solução (MMR) de Ringer de X Marc (10 mM MgCl2, KCl 20 mM, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES; NaCl 1 M; ajustado para pH 7,5, autoclavado e armazenado a temperatura ambiente)] com 50 ug / ml de antibiótico gentamicina. Mude 0,1 X MMR cada dia e remover quaisquer embriões mortos.
- Uma vez que os embriões atingem Nieuwkoop e Faber fase ~ 27-30 julho, mude ªe embriões em 0,1 X MMR sem antibiótico para permitir o crescimento de bactérias do intestino.
- Crescer os girinos até que atinjam a fase de alimentação (fase 45) e movê-los em 100 milímetros placas de Petri cheias de 0,1 X MMR. Alimentá-los urtiga sobrenadante pó todos os dias durante uma semana, mudando a 0,1 X MMR no dia de intervenção.
- Depois de uma semana na 100 milímetros placa de Petri, mova animais para meia galão tanques cheios de água sapo [0,5 g / L oceano instantâneas e 2 mM de sódio dibásico (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Alimente-os como no passo 2.4, mas mudar a água apenas 2-3 vezes por semana, quando a água está turva. Manter os animais em um 12 horas light/12 ciclo claro-escuro com as luzes de ligar às 6 da manhã.
- Coloque o tanque de meio litro com os assuntos de teste em uma superfície branca, como um resguardo bancada do laboratório, pelo menos 12 horas O / N, antes do teste.
- Girinos de teste nas fases 45 a 50, tal como descrito no passo 3 abaixo.
. 2 Configuração Pré-comportamento: Equipment
- Separe uma área do laboratório para o ensaio de comportamento. Ele deve estar em uma área tranquila, de baixo tráfego, com iluminação fluorescente padrão.
- Prepare os tanques de teste para os animais.
Os aninhados, tanques de teste de meio-litro são compostos de duas partes: um tanque interno que vai segurar a água e girinos; e um tanque exterior com o estímulo visual.- Para o tanque interno, fazer uma pequena marca nos cantos externos com um Sharpie, a 5 cm do fundo; esta é a linha de água (Figura 1A, linha pontilhada verde).
- Além disso, para o tanque interno, preencha os divets no tanque (nos cantos e no centro) com um composto inerte, como Sylgard elastômero. NOTA: Os girinos permanecerá nestas áreas se não forem preenchidos
- Para o tanque exterior, cobrem exactamente a metade do lado de fora de um tanque com uma fita isolante preto e a outra metade com o tecido de papel branco Figura 1B.
- Colocar os tanques nainoculando plataforma giratória.
- Configuração da webcam / tripé para que ele está acima dos tanques de teste. Ajustar a câmara para permitir a visualização de área de teste, tal como mostrado na Figura 1C.
- Conecte a webcam ao computador com o software QuickTime Player instalado 5. Ligue a câmera. No QuickTime Player, em Arquivo, selecione 'New Gravação de filme. " A configuração do ensaio de comportamento será visível no computador imediatamente.
- Estenda um pano de algodão leve ao longo de toda a instalação para reduzir a estímulos externos que podem afetar o comportamento de girinos, bem como, reduzir a luz refletida na superfície da água.
- Certifique-se que a luminosidade no âmbito das medidas de pano entre 35-50 cd / m 2.
3. Assay Comportamento
- Encha o tanque de provas interior para a marca de 5 cm de água feita no passo 1.2.1 com água sapo.
- Usando uma pequena rede, mova suavemente o animal para dentro do tanque de teste interno.
- Abrir QuickTime software no computador e, usando o tanque exterior como um guia, certifique-se de que a câmera é capaz de visualizar e registrar a área de testes.
- Escreva o nome dos animais, data e hora em um pedaço de papel e gravar com a câmera.
- Coloque o tanque de teste para o tanque exterior com o lado negro do tanque para a direita Figura 2.
- Comece a gravar o filme imediatamente depois de organizar o tanque e ajustar o temporizador para 2 min.
- Quando os beeps temporizador, remova o tanque de teste interno, gire o tanque exterior de 180 ° e coloque o tanque de teste interno dentro do tanque externo. Inicie o cronômetro. Nota: o lado negro deve ser agora no outro lado.
- Repita o passo 3.7, mais oito vezes para um total de dez ensaios. Use a Figura 2 como um guia, riscando cada julgamento.
- Repetir o ensaio de comportamento em dois dias separados.
4. Retinal axotomia
- Coloque o animal em 0,02% tricaina até que eles não respondempara uma pitada de cauda com um # 3 fórceps.
- Derreta 1% de agarose em 0,1 X MMR e, em seguida, adicionar a uma 60 milímetros placa de Petri. Uma vez arrefecido, fazer uma pequena torrão rectangular na agarose e adicionar o girino para o torrão com um pouco de 0,02% tricaína, de modo que o animal está parcialmente submerso no líquido.
- Perfurar a pele a um ângulo de 45 graus atrás região dorsal do olho com uma agulha 25 G, enquanto que preparando o animal contra uma pinça sobre o lado oposto.
- Tomando cuidado para não cortar a veia, que fica próximo ao nervo óptico, cuidadosamente chegar no buraco com # 5 fórceps, cortar o nervo óptico e lançá-lo para fora do caminho. Se houver hemorragia grave devido a acidentalmente cortando a artéria, em seguida, coloque rapidamente o animal em 2% tricaina a eutanásia. CUIDADO: solução tricaina 2% pode causar dormência em seres humanos. Esta solução deve ser manuseado com luvas.
- Para recuperar o animal após a cirurgia, coloca animal em placa de 100 mm de Petri com 0,7 X MMR e 50 ug / ml de gentamicina, durante 20 min. Next, transferência de girino para tanque de recuperação com água sapo. Deixe descansar animais O / N.
- Na manhã seguinte, o teste da função visual, como descrito acima (etapas 3,1-3,9).
5. Analisar os Resultados
- Após os ensaios de terminado, medir a quantidade de tempo que o girino permanece sobre o lado negro do tanque.
- Visualizar manualmente os vídeos usando software que exibe o tempo e permite pausas frequentes. Olhe para o tempo de exibição de vídeo. Faça-se o início do ensaio de dois minutos, o qual é, quando o tanque interior aninha com sucesso dentro do tanque exterior e é elevado ao quadrado em vista da câmara.
- Utilizar a posição dos olhos do girino para definir qual dos lados do tanque, os animais são em natação. Definir atravessar de um lado do tanque para o outro apenas quando ambos os olhos ter atravessado a linha de preto / branco.
- Anote o início eo fim de cada intervalo (em segundos) que o animal passa do lado negro. Faça uma pausa e reenrole o vídeo para garantir a precisão. Total do sec dentro de cada julgamento.
- Entrada esses números na planilha Comportamento anexado. A planilha irá calcular a proporção de tempo que o animal passou do lado branco, subtraindo o tempo gasto com o lado negro do tanque do total de seg julgamento e dividir por 120 o tempo total em segundos [(120 - total gasto em segundos o lado negro) / 120 seg]. As médias da planilha esta relação sobre todas as 10 tentativas.
- Use T-teste de um aluno, emparelhado, distribuição bicaudal para determinar se as provas entre os dias são significativas (P ≤ 0,05).
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Representative Results
Relatórios anteriores demonstraram que os girinos de Xenopus premetamorphic preferir nadar no lado branco de um tanque de preto / branco e chamou este ensaio, o Fundo Preferência de cor Ensaio 3 Mudamos este ensaio, a fim de testar a função visual de ambos os olhos de girinos em menos do que uma semana. Desta forma, os olhos podem ser recolhidos para exame histológico.
Mostramos aqui como a resposta é devido a pistas visuais. No Movie 1, os girinos nos painéis esquerdo e direito são os mesmos animais. À esquerda são os animais antes da cirurgia e à direita, os animais depois de romper os nervos ópticos. Nós rodou na água para mostrar que nada é adicionado para repelir os animais do lado preto ou atraí-los para o lado branco. No filme, que proporcionam uma vista esquemática dos girinos nos cantos inferiores, o que mostra o estado do nervo óptico, para cada conjunto de animais. No Movie 1, o normal, ugirinos n operados responder a cor de fundo em menos de 30 segundos no tanque de teste, enquanto os girinos cegos nadar a esmo em torno do tanque. A velocidade dos filmes foi aumentada eo tempo real gravado no canto superior direito.
Para testar a visão de um olho, que têm incluído os resultados a partir de um animal cujo nervo óptico foi cortada de um olho e testado no nosso ensaio. O nervo óptico no outro olho foi cortado depois de dois dias de testes, eo comportamento guiado por visão testado nos seguintes dias novamente. Na Figura 3, um gráfico que mostra a quantidade de tempo que o girino escolheu a nadar no lado negro do tanque. Isto foi medido em seis dias consecutivos Figura 3A. Como descrito acima, o nervo óptico direito foi cortada após comportamento foi testado no dia 2, e à esquerda, após o teste de comportamento no dia 4. Girino O preferido o lado branco do tanque aleatoriamente em 50% do tempo Figura 3C. Note-se que o umimal passou mais tempo no lado branco do tanque durante os últimos 6 ensaios nos dias 1 a 4. A quantidade de tempo gasto no lado negro era mais mesmo nos dias 5 e 6, quando o animal era cego de ambos os olhos. Os resultados de cada um dos dois dias foram ponderados e apresentados em conjunto na Figura 3C uma forma de gráfico.
Figura 1. Experimental set-up de ensaio comportamento guiado por visão. (A) O tanque de teste interno permanece transparente e está marcado para indicar os níveis de água (linhas no canto verde tracejada). (B) O tanque de teste externo é coberto de preto fita isolante sobre um meio e tecido de papel branco do outro. (C) Os girinos são visualizados utilizando uma câmara colocada num tripé e ligada a um computador portátil. O tanque de testede descanso em uma plataforma giratória inoculando para permitir a fácil de viragem entre ensaios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquemática de como o ensaio de comportamento guiado por visão é realizada. Os retângulos representam o tanque de teste, mostrando como o meio branco / preto metade da área muda com cada tentativa. Isto pode ser utilizado durante o ensaio de comportamento para marcar o número de teste. O tanque de teste à direita é um close-up do girino e seu comportamento esperado durante os dois minutos de ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Uma experiência representativa calculando a percentagem de tempo que o girino nadado no lado branco do tanque de teste. (A) A quantidade de sec o girino gasto no lado negro do tanque é medido e colocado numa tabela. (B ) O quadro do A é convertido para a porcentagem de tempo gasto do lado branco do tanque. Isso é feito subtraindo do seg gasto no lado negro do tempo total de ensaio (120 segundos) e dividindo-se por 120 segundos. Os girinos que estavam sem tratamento (U), teve um único axotomia (SA) e, em seguida, uma axotomia duplo (DA) foram testados. (C) O gráfico representa a porcentagem média de tempo gasto no lado branco (barra branca) eo lado preto ( barra preta). A tabela utilizada para fazer o gráfico é mostrado abaixo.g3highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1. Resposta comportamental de animais avistados e cegas no fundo branco preferência ensaio. Girinos nos painéis esquerdo e direito são os mesmos, mas os da direita sofreram axotomia retina dupla. Um esquema nos cantos inferiores indica se o nervo óptico está intacta ou cortado (barra azul). O cronômetro no canto superior direito indica tempo. O filme é acelerado para facilitar a visualização. Uma vez na área branca, observe como os girinos nadam perto da fronteira entre a direção branco e preto e inversa. Clique aqui para ver este vídeo.
| Day 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | Dia 5 | Dia 6 | |
| Experimento 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ensaio 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Experimento 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ensaio 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Teste 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Teste 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Proporção de tempo gasto no lado branco | ||||||
| Razão 1 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 2 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 3 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 4 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 5 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 6 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 7 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 8 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 9 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Razão 10 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Média | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | <td> 1,00|
| Dia 1 | Dia 2 | Dia 3 | Dia 4 | Dia 5 | Dia 6 | |
| Experimento 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Ensaio 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Experimento 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Ensaio 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Teste 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Teste 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Teste 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Teste 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Teste 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Teste 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Proporção de tempo gasto no lado branco > | ||||||
| Razão 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Razão 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Razão 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Razão 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Razão 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Razão 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Razão 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Razão 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Razão 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Média | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Planilha 1. Fundo branco preferência planilha ensaio. Esta planilha tem os cálculos construídas de modo que ele pode ser usado para introduzir números e resultados tally.
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Discussion
Relatamos aqui um ensaio comportamental guiada pela visão simples que pode ser facilmente realizado em menos de uma semana pelo pessoal de laboratório minimamente treinados. Enquanto outros ensaios requerem equipamento especializado e experiência em comportamento animal, este ensaio permite um teste rápido para determinar a função visual. Outro ensaio comportamental, o ensaio de evitação visual, foi desenvolvida para determinar a forma como o tectum contribui para a percepção visual em Xenopus 10. Este ensaio mede sintonia espacial e sensibilidade ao contraste em resposta a um movimento contra fundo estável e, portanto, pode medir o comportamento baseado em visão mais especializado do que o ensaio simples relatado aqui. Um sistema automatizado comportamento tem sido relatado que pode medir a quantidade de tempo despendido em um dos lados do tanque 8. Também há software disponível no mercado (por exemplo, software ANY-labirinto), que tem sido usado para medir a quantidade de peixe-zebra tempo gasto em ambientes escuros ou claros 9. A umssay relatamos aqui não requer a compra destes tipos de equipamentos ou software caro, mas em vez disso depende de reagentes e equipamentos todos os dias para medir a função visual.
O ensaio guiada pela visão é efectuada de um animal para testar a sua função visual. Ao comparar os resultados do ensaio de comportamento de vários girinos um ao outro, não observamos diferença estatística entre os animais dentro dos grupos de tratamento. Testamos três girinos em seis dias consecutivos e também testou outros cinco animais em três dias consecutivos, correndo dez ensaios por dia. Em ambos os casos, não foram encontradas alterações estatisticamente significativas entre os grupos axotomia não tratados ou solteiras (P = 0,2067), mas obteve uma variação estatisticamente significativa quando esses animais foram comparados com o grupo dupla axotomia (P = 0,002). Isto foi medido utilizando o software Prism 6.0 c a execução de um teste estatístico de 2-way ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey (n = 8 girinos). Para ter a máximaquantidade de pontos de dados antes da cirurgia, sugerimos o uso do ensaio de comportamento de seis dias. Se os resultados precisam ser obtidos mais rapidamente com menos degeneração do tecido, sugerimos utilizar o sistema de três dias.
Este ensaio testa um animal de cada vez. Realizamos estudos-piloto para ver se dois girinos ou mais poderia ser medido simultaneamente. Para determinar se ter dois girinos em um tanque afetado sua preferência para o lado branco do tanque, testamos cada girino separadamente e depois em conjunto. Desde que as imagens foram tiradas acima do tanque, se os girinos nadando acima ou abaixo de outro por qualquer período de tempo, descobrimos que é difícil distingui-los. Se usássemos girinos de diferentes tamanhos, observou-se que quanto maior um afetaria onde o menor nadou. As tecnologias do futuro poderia ser desenvolvido para girinos geneticamente marca, o que permitiria um melhor acompanhamento de vários animais do mesmo tamanho.
Na realização deste ensaio em dezenas de TADPOles, observamos que alguns girinos preferiu o lado branco de forma mais consistente do que outros. Girinos, cujo comportamento variou em mais de 10% em dois dias consecutivos, que levaria foram testadas novamente com um terceiro dias antes da cirurgia. Isso pode ter sido por causa de uma outra observação: notamos que colocar os animais em um fundo branco também fez a diferença em sua preferência pelo lado branco do tanque. Ter esse dia extra pode ter ajudado a condicionar alguns girinos a preferir o lado branco do tanque. Uma limitação deste ensaio é que ele só testes de função visual. A variabilidade foi observada pode ser devido a outros defeitos de desenvolvimento, além de redução da função visual ou cegueira. Por esta razão, os animais que mostraram menos de 60% de preferência, antes da cirurgia não foram testados ainda mais.
Nós também testamos uma gama de idades de girinos pré-metamórficas. Descobrimos que os girinos com menos de estágio 45 eram muito pequenas e seus olhos eram difíceis de rastrear, usando o nosso nósbcam. Girinos mais velhos (estágios 51-55 +) foram mais distraídos; embora eles finalmente passou mais tempo no lado branco do tanque, eles parecem levar mais tempo para nadar lá. Estes animais mais velhos eram maiores e, portanto, mais fácil de controlar, mas precisava testar antes da cirurgia como indicado acima. Em contraste, a maioria dos girinos na fase de 45 até 50 comportou-se como esperado e animais destas idades seria melhor para usar em estudos futuros.
Mudanças de luz circadianos têm sido mostrados para afetar respostas comportamentais guiada por visão em Xenopus 2. Consistente com esta observação, percebemos que o mesmo animal que rapidamente nadou para o lado branco do tanque de teste em ensaios realizados na parte da manhã, levou muito mais tempo durante os testes de comportamento da tarde. Após a realização de uma série de «mesmos animais / hora diferente 'ensaios, determinou-se o melhor momento para o ensaio comportamento era 06:00-13:00.
Temos também utilizado um handh digitaiseld câmara de vídeo ligada por firewire para testar os animais sob condições de pouca luz 5. Este teste permitiu de visão noturna ou escotópica, em que o animal utiliza os seus bastonetes para ver. Condições foram alteradas simplesmente por encontrar a menor quantidade de luz necessária para o animal para realizar o ensaio guiada pela visão. O ensaio aqui apresentado testa visão fotópica, em que o animal usa principalmente seus cones fotorreceptores para ver. Ao combinar estas abordagens, os dois tipos de visão, e escotópica fotópico, pode ser testado.
Usamos este ensaio para testar a função visual de animais com um olho ectópica cresceu a partir de células pluripotentes superexpressão dos fatores de transcrição olho campo intrinsecamente expressas eo fator extrínseco, cuca. Olhos geradas a partir desses tecidos eram funcionais 4,11. Noggin também desempenha um papel no desenvolvimento do sistema nervoso central anterior 12, mas utilizando este ensaio guiada pela visão em conjunto com a tampa de animais trensaio ansplant, seu papel no desenvolvimento do olho foi descoberto. Outros fatores extrínsecos que afetam a formação do embrião precoce, mas ainda não foram mostrados para ter um papel no desenvolvimento do olho pode induzida formação progenitor da retina em células pluripotentes animal cap 4,11. Utilizando este ensaio comportamental, estudos futuros podem determinar a função visual destes olhos recentemente gerados.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde: EY015748, EY017964 (MEZ) e EY019517 (ASV). Este trabalho também foi apoiado pela Research para prevenir a cegueira irrestrito Grant ao Departamento de Oftalmologia e os Leões da Central de Nova York. Gostaríamos também de agradecer ao nosso técnico de animal, Matthew Mellini, pelo excelente cuidado dos animais e para intervindo para estrelar este vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
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