Summary
Xenopus laevis rumpetroll foretrekker svømming på den hvite siden av en svart / hvit tank. Denne atferden er styrt av deres visjon. Basert på denne oppførselen, presenterer vi en enkel analyse for å teste den visuelle funksjon av rumpetroll.
Abstract
Måling av visuell funksjon i rumpetroll av frosk, Xenopus laevis, tillater screening for blindhet hos levende dyr. Den optokinetiske responsen er en visjon-basert, refleksiv atferd som har blitt observert i alle virveldyr testet. Rumpetroll øyne er små så halen flip responsen ble brukt som alternative tiltak, som krever en tekniker for å spille inn den subtile respons. Vi har utviklet en alternativ adferd assay basert på det faktum at tadpoles foretrekker å svømme på den hvite side av en tank når den plasseres i en tank med både svart og hvitt sider. Analysen som presenteres her er et billig, enkelt alternativ som skaper en reaksjon som lett kan måles. Oppsettet består av et stativ, webkamera og nestet testing tanks, lett tilgjengelig i de fleste Xenopus laboratorier. Artikkelen inneholder en film som viser virkemåten til tadpoles, før og etter opprivingen synsnerven. For å teste funksjonen av det ene øyet, vi også inkludere repretivt resultat av et rumpetroll der hvert øye gikk retinal axotomy på påfølgende dager. Fremtidige studier kan utvikle en automatisert versjon av denne analysen for å teste synet av mange rumpetroll på en gang.
Introduction
Xenopus laevis har blitt brukt som et modellorganisme for å studere hulldannelse. Øynene utvikle seg raskt, voksende til forfall på mindre enn en uke for testing gener eller veier som har en effekt på visuell utvikling og funksjon. For å teste synsfunksjon, har den optokinetiske og optomotor respons vært brukt i sebrafisk og Xenopus rumpetroll, henholdsvis 1,2. Fordi øynene til Xenopus tadpoles er relativt mindre enn sebrafisk, krever denne analysen bruk av spesialisert utstyr og trenet personell for å detektere subtile hale-flip-og øye-bevegelse oppførsel i Xenopus. En mer robust oppførsel i Xenopus er preferanse for å svømme i en tank med en hvit bakgrunn, som er beskrevet heri 3. Når du plasserer et rumpetroll i et halvt svart / halv hvit tank, svømmer den pre-metamorfe rumpetroll raskt til den hvite siden av tanken. Vi har tidligere brukt denne analysen for å bestemme om pluripotent celle-avledetØynene var funksjonell fire. Her rapporterer vi en detaljert versjon av denne analyse, som kan brukes til å teste visuell funksjon av premetamorphic Xenopus tadpoles.
Denne analysen er enklere enn optomotor respons analysen, siden det krever bare en montert digitalt videokamera, digitalkamera programvare og standard utstyr som finnes i de fleste Xenopus laboratorier. I tillegg registrerte responsen krever ingen spesiell opplæring i Tally resultater. Våre representative resultater viser at den samme gruppen av rumpetroll, etter å ha gjennomgått dobbelt retinal axotomy, svømme tilfeldig rundt tanken. Vi har også inkludert de atferd analyseresultatene fra en representant rumpetroll, som viser hvordan det ene øyet kan testes for visuell respons. En arket er blitt tatt med, slik at tallene tatt i løpet av analysen kan settes inn og analysert. Dette regnearket kan brukes til å avgjøre om rumpetrollene testet har en visuell respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animal Care
Den Xenopus laevis rumpetroll brukt i denne studien ble dyrket, oppvokst og behandlet i henhold til prosedyrer godkjent av Upstate Medical University IACUC og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
. En Pre-atferd Setup: Tadpoles
- Innhent befruktede Xenopus embryoer fra en kommersielt tilgjengelig kilde, eller in vitro befrukte egg, som tidligere beskrevet 6..
- Plasser blastula til nevrale plate scenen embryoer ved 18 ˚ C i 60 mm petriskåler som inneholder 0,1 X MMR [10 X Marc modifiserte Ringers (MMR) løsning lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mMHEPES; 1 M NaCl, justert til pH 7,5, autoklavert og lagret ved RT)] med 50 ug / ml gentamicin antibiotikum. Endre 0,1 X MMR hver dag og fjerne eventuelle døde embryoer.
- Når embryoene nå Nieuwkoop og Faber scenen ~ 27 til 30 juli, slår the embryoer til 0,1 X MMR uten antibiotika for å tillate gut bakterievekst.
- Grow rumpetrollene til de når fôring stadium (stadium 45) og flytte dem inn i 100 mm petriskåler fylt med 0,1 X MMR. Mate dem nesle pulver supernatant annenhver dag i en uke, endrer 0,1 X MMR på den mellomliggende dag.
- Etter en uke i 100 mm petriskål, flytte dyrene til halv gallon tanker fylt med frosk vann [0,5 g / L instant hav og 2 mM Dibasisk natriumfosfat (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Mate dem som i trinn 2.4, men endrer vann bare 2-3 ganger per uke når vannet er klart. Opprettholde dyrene i en 12 timers light/12 mørkt lys syklus med lysene slått på 6 am.
- Plasser halv gallon tank med forsøkspersonene på en hvit overflate som en lab benk underpad, minst 12 timers O / N, før testing.
- Test tadpoles ved trinn 45 til 50 som beskrevet i trinn 3 nedenfor.
. 2 Pre-atferd Setup: Equipment
- Sett av et område på laboratoriet for oppførselen assay. Det bør være i et rolig, lite trafikk område med standard lysstoffrør.
- Forbered testtanker for dyrene.
De hekket, halv-gallon testing tanks er sammensatt av to deler: en indre tank som vil holde vann og rumpetroll; og en ytre tank med den visuelle stimulus.- For den indre tanken, lage et lite merke på de utvendige hjørner med en tusj, 5 cm fra bunnen; Dette er vannlinjen (figur 1A, grønn stiplet linje).
- Også for den indre tank, fylle divets i tanken (ved hjørnene og sentrum) med en inert forbindelse, som Sylgard elastomer. MERK: Rumpetrollene vil nøle i disse områdene hvis de ikke er fylt i.
- For den ytre tank, dekker nøyaktig halvparten av utsiden av en tank med svart elektriske bånd, og den andre halvparten med det hvite papir figur 1B.
- Plasser tanker påinoculating platespiller.
- Oppsett webkameraet / stativ slik at det er over testing tanks. Juster kameraet for å tillate visualisering av testområdet, som vist i figur 1C.
- Koble webkameraet til en datamaskin med QuickTime Player-programvaren installert fem. Slå på kameraet. , Under Fil, velger i QuickTime Player 'Nytt filmopptak.' Oppførselen analysen oppsett vil være synlig på maskinen med en gang.
- Drapere en lett bomullsklut over hele oppsettet for å redusere eksterne signaler som kan påvirke tadpole oppførsel, så vel som å redusere reflektert lys på overflaten av vannet.
- Kontroller at luminans under klut tiltak mellom 35-50 cd / m 2.
Tre. Behavior Assay
- Fyll den indre testing tanken til 5 cm vann mark gjorde i trinn 1.2.1 med frosk vann.
- Ved hjelp av en liten netto, forsiktig beveger dyret inn i den indre testtanken.
- Åpen QuickTime programvare på datamaskinen, og ved hjelp av ytre tank som en guide, sørg for at kameraet er i stand til å visualisere og registrere testing området.
- Skriv dyret navn, dato og klokkeslett på et stykke papir og ta opp med kameraet.
- Plasser testtanken inn i den ytre beholderen med den svarte side av tanken til den høyre figur 2.
- Starte innspillingen av filmen umiddelbart etter arrangere tanken og stille timeren for 2 min.
- Når timeren piper, fjerne indre testtank, rotere den ytre tanken 180 ° og sett den indre test tanken i den ytre tanken. Starter tidtakeren. Merk: svart side bør nå være på den andre siden.
- Gjenta trinn 3.7, åtte flere ganger for totalt ti forsøk. Bruk figur 2 som en guide og krysse av på hvert forsøk.
- Gjenta oppførselen assay på to forskjellige dager.
4. Netthinne Axotomy
- Plasser dyret i 0,02% Tricaine før de er ikke svarertil en hale klype med en # 3 tang.
- Smelt 1% agarose i 0,1 X MMR og deretter legge til en 60 mm petriskål. Når avkjølt, foreta en liten rektangulær divot i agarose og tilsett tadpole til divot med en liten 0,02% Tricaine, slik at dyret er delvis nedsenket i væsken.
- Pierce huden i en 45 graders vinkel bak ryggregionen av øyet med en 25 G nål, mens avstivning dyret mot tang på den motsatte side.
- Tar seg ikke å avklipt venen, som ligger ved siden av synsnerven, forsiktig nå inn i hullet med # 5 tang, klipp synsnerven og snu den ut av veien. Hvis det er alvorlig blødning skyldes uhell snipping arterien, deretter raskt plassere dyret i 2% Tricaine å avlive. FORSIKTIG: 2% Tricaine løsning kan forårsake nummenhet hos mennesker. Denne løsningen skal håndteres med hansker.
- For å gjenopprette dyret etter operasjonen, plassere dyret i 100 mm petriskål med 0,7 X MMR og 50 mikrogram / ml gentamicin i 20 min. Next, transfer rumpetroll til oppsamlingstanken med frosk vann. La dyret hvile O / N.
- Neste morgen, teste visuell funksjon som beskrevet ovenfor (trinn 3.1 til 3.9).
5. Analyser Resultater
- Etter studiene er ferdig, måle mengden av tid rumpetroll forblir på den svarte siden av tanken.
- Manuelt vise videoene ved hjelp av programvare som viser tid og lar hyppige pauser. Se på videoen visningstiden. Noter start av de to-minutters prøveperiode, som når den indre tank med hell hekker inni den ytre beholderen og blir kvadrert i lys av kameraet.
- Bruk posisjonen til rumpetroll øyne for å definere hvilken side av tanken dyrene svømmer på. Definer krysset over fra den ene side av tanken til den andre bare når begge øyne har krysset den svart / hvit linje.
- Noter begynnelsen og slutten av hvert intervall (i sekunder) som dyret bruker på den sorte siden. Pause og revikle video for å sikre nøyaktighet. Total sek innenfor hvert forsøk.
- Input disse tallene inn i den vedlagte Behavior regneark. Regnearket beregner forholdet mellom tid at dyret brukt på den hvite siden ved å trekke den tid brukt på den svarte siden av tanken fra den totale 120 sek prøving og dividere med den totale tiden i sek [(120 - total sekunder brukt på svart side) / 120 sek]. Regneark gjennomsnitt denne andelen over alle 10 forsøk.
- Bruk en student t-test, sammenkoblet, tosidige fordelingen for å avgjøre om de prøvelser mellom dagene er signifikant (P ≤ 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tidligere rapporter har vist at premetamorphic Xenopus rumpetroll foretrekker å bade på den hvite siden av en svart / hvit tank og kalte denne analysen, Bakgrunnsfarge preferanse analysen 3 Vi har endret denne analysen for å teste den visuelle funksjon av enten øyet av rumpetroll i mindre enn en uke. På denne måten kan deres øyne samles for histologisk undersøkelse.
Vi viser her hvordan responsen er på grunn av visuelle signaler. I Movie 1, rumpetrollene i venstre og høyre paneler er de samme dyrene. På venstre er dyrene før operasjonen og på høyre, dyrene etter severing både optiske nervene. Vi virvlet vannet for å vise at det ikke tilsettes for å frastøte dyrene fra den sorte siden eller tiltrekke dem til den hvite siden. I filmen, gir vi en skjematisk av rumpetroll i de nederste hjørnene, som viser tilstanden i synsnerven for hvert sett av dyr. I film 1, normal, un-opererte rumpetroll svare på bakgrunnsfargen på mindre enn 30 sekunder i testtanken mens de blinde rumpetroll svømme formålsløst rundt tanken. Hastigheten av filmene ble økt og den faktiske tiden registrert i øvre høyre hjørne.
For å teste synet på ett øye, har vi tatt med resultatene fra et dyr som har synsnerven ble kuttet på det ene øyet og testet i vår analyse. Den optiske nerven i det andre øyet ble kuttet etter to dager med testing, og visjonen styrt atferd testet på følgende dager igjen. I figur 3 viser et diagram hvor lang tid det tadpole valgte å svømme på den sorte siden av tanken. Dette ble målt på seks sammenhengende dager figur 3A. Som beskrevet ovenfor ble den høyre synsnerven kuttet etter opptreden ble testet på dag 2, og til venstre, etter opptreden test på dag 4. The tadpole trekkes det hvite side av tanken tilfeldig ved 50% av tiden, figur 3C. Legg merke til at enimal brukte mer tid på den hvite siden av tanken i løpet av de siste seks forsøkene på dag 1 til 4. Mengden av tid brukt på den svarte siden var mer selv på dager 5 og 6, når dyret var blind på begge øynene. Resultatene fra hver av de to dagene ble midlet sammen og presentert i et grafisk form figur 3C.
Figur 1. Eksperimentell oppsett av syn-guidet atferd analysen. (A) Den indre test tanken forblir gjennomsiktig og er merket for å indikere vannstand (grønn stiplet linje på hjørnet). (B) Den ytre testtank er dekket i svart elektrisk tape på den ene halvdelen og hvitt silkepapir på den andre. (C) Rumpetrollene er visualisert ved hjelp av et webkamera plassert på et stativ, og koblet til en bærbar datamaskin. Testingen tanks hvile på en inoculating platespiller for å gi enkel vende mellom forsøkene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk av hvordan visjonen styrt atferd analysen er utført. Rektanglene representerer testtank, som viser hvordan den halvt hvit / halvt svart området endres med hvert forsøk. Dette kan brukes i løpet av opptreden assay for å markere prøvenummeret. Testen tank til høyre er et nærbilde av rumpetroll og forventet atferd i løpet av to minutter analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
hin-page = "always"> 
Figur 3. Et representativt eksperiment tallying prosentandelen av tid tadpole svømte på den hvite side av testbeholderen. (A) Mengden av sek den tadpole brukt på den sorte siden av tanken måles og plassert i en tabell. (B ) Tabellen i A omdannes til prosentandel av tiden brukt på den hvite siden av tanken. Dette gjøres ved å trekke sek brukt på den svarte siden av det totale prøvetiden (120 sek) og dividere med 120 sek. Rumpetroll som var ubehandlet (U), hadde en enkelt axotomy (SA), og deretter en dobbel axotomy (DA) ble testet. (C) Grafen representerer den gjennomsnittlige prosentandelen av tid brukt i den hvite siden (hvit bar) og svart side ( svart strek). I tabellen benyttes til å gjøre grafen vises nedenfor.g3highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Movie en. Behavioral respons av seende og blinde dyr i den hvite bakgrunnen preferanse analysen. Tadpoles i venstre og høyre panelene er de samme, men de på høyresiden har gjennomgått dobbelt retinal axotomy. En skjematisk i de nederste hjørnene indikerer om den optiske nerven er intakt eller kuttet (blå linje). Timeren i øvre høyre hjørne viser tid. Filmen er sped opp for enklere visning. En gang i det hvite området, legg merke til hvordan rumpetrollene svømme nær grensen mellom hvit og svart og omvendt retning. Vennligst klikk her for å se denne videoen.
| Day 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Trial 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Trial 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Forholdet mellom tid brukt på hvit side | ||||||
| Ratio 1 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 2 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 3 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 4 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 5 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 6 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 7 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 8 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 9 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Ratio 10 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Gjennomsnittlig | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | <td> 1,00|
| Dag 1 | Dag 2 | Dag 3 | Dag 4 | Dag 5 | Dag 6 | |
| Trial 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Trial 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Trial 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Trial 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Trial 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Trial 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Trial 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Forholdet mellom tid brukt på hvit side > | ||||||
| Ratio 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Ratio 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Ratio 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Ratio 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Ratio 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Ratio 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Ratio 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Ratio 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Ratio 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Gjennomsnittlig | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Regneark en. Hvit bakgrunn preferanse analysen regneark. Dette regnearket har beregningene bygget inn slik at den kan brukes til å skrive inn tall og telleresultatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer her en enkel visjon styrt atferdsanalyse som lett kan utføres på under en uke etter minimal opplæring lab personell. Mens andre analyser krever spesialutstyr og kompetanse på dyrs atferd, gjør at denne analysen en rask test for å fastslå visuell funksjon. En annen atferdsanalyse, Visual Avoidance analysen, er utviklet for å finne ut hvordan Tectum bidrar til visuell persepsjon i Xenopus 10. Dette assay måler romlige innstilling og kontrast følsomhet som reaksjon på et bevegelig versus stabil bakgrunn, og dermed kan måle mer spesialisert syn-baserte oppførsel enn den enkle analysen rapportert her. En automatisert oppførsel system er rapportert som kan måle mengden av tiden som brukes på den ene side av tanken 8.. Det er også kommersielt tilgjengelig programvare (f.eks NOEN-labyrint programvare) som har blitt brukt for å måle hvor mye tid sebrafisk tilbringer i mørke eller lyse omgivelser ni. Den enssay vi rapporterer her krever ikke kjøp av disse typene av dyrt utstyr eller programvare, men i stedet baserer seg på dagligdagse reagenser og utstyr for å måle visuell funksjon.
Den syn-styrt assay utføres på et dyr ved å teste dets visuell funksjon. Når man sammenligner de atferdsanalyseresultatene av flere rumpetroll til hverandre, observerte vi ingen statistisk forskjell mellom dyr innen behandlingsgruppene. Vi testet tre rumpetroll på seks sammenhengende dager, og også testet ytterligere fem dyr på tre påfølgende dager, kjører ti forsøk per dag. I begge tilfeller fant vi ingen statistisk signifikante endringer blant de ubehandlede eller enkelt axotomy gruppene (P = 0,2067), men likevel fått en statistisk signifikant endring når disse dyrene ble sammenlignet med den doble axotomy gruppen (P = 0,002). Dette ble målt ved hjelp av Prism 6.0c programvare som kjører en to-veis ANOVA statistisk test med en Tukey multippel sammenligningstest (n = 8 rumpetroll). For å ha maksimalmengde datapunkter før operasjonen, foreslår vi at du bruker seks-dagers oppførsel analysen. Hvis resultatene må oppnås raskere med mindre degenerering av vevet, foreslår vi at du bruker tre-dagers system.
Dette assay tester ett dyr om gangen. Vi utførte pilotstudier for å se om to rumpetroll eller flere kan måles samtidig. For å finne ut om å ha to rumpetroll i en tank påvirket deres preferanse for den hvite siden av tanken, testet vi hver rumpetroll separat og deretter sammen. Siden bildene ble tatt over tanken, hvis rumpetrollene svømte over eller under hverandre i lengre tid, fant vi det vanskelig å skille dem fra hverandre. Hvis vi brukte rumpetroll i forskjellige størrelser, observerte vi at jo større man vil påvirke hvor den minste svømte. Fremtidige teknologier kunne utvikles til genetisk mark rumpetroll, som ville tillate bedre sporing av flere dyr av samme størrelse.
I utfører denne analysen på dusinvis av tadpoles, observerte vi at noen rumpetroll foretrakk den hvite siden mer konsekvent enn andre. Rumpetroll, hvis adferd variert med mer enn 10% på to påfølgende dager, ville vi ta ble testet på nytt på en tredje dag før operasjonen. Dette kan ha vært på grunn av en annen observasjon: vi la merke til at å plassere dyrene på en hvit bakgrunn også gjort en forskjell i deres preferanse for den hvite siden av tanken. Å ha den ekstra dagen kan ha hjulpet tilstanden noen rumpetroll til å foretrekke den hvite siden av tanken. En begrensning av denne analyse er at den bare tester visuell funksjon. Den variasjonen vi har observert kan skyldes andre utviklingsmessige defekter, foruten nedsatt synsfunksjon eller blindhet. Av denne grunn ble det dyr som viste mindre enn 60% vil, før kirurgi ikke testet ytterligere.
Vi testet også en rekke aldre av pre-metamorfe rumpetroll. Vi fant ut at rumpetroll yngre enn stadium 45 var veldig liten og deres øyne var vanskelig å spore ved hjelp av vår viBCAM. Eldre rumpetroll (iscenesetter 51 - 55 +) var mer distrahert; selv om de til slutt brukte mer tid på den hvite siden av tanken, synes de å ta lengre tid å svømme der. Disse eldre dyr var større, og derfor lettere å spore, men nødvendig testing før operasjonen som nevnt ovenfor. I kontrast, de fleste av rumpetroll på scenen 45 opp til 50 oppførte seg som forventet og dyr av disse aldre ville være best å bruke i fremtidige studier.
Circadian lys endringer har vist seg å påvirke synet styrt atferdsmessige reaksjoner i Xenopus to. I samsvar med denne observasjonen, la vi merke til at det samme dyret som raskt svømte til den hvite siden av testtank i studier utført på morgenen, tok mye lengre under ettermiddagsatferdstester. Etter å ha gjennomført en rekke "samme dyre / annen gang 'forsøk, vi bestemt den beste tiden for oppførselen analysen var fra 6 am til 13:00.
Vi har også brukt en digital handheld videokamera koblet med firewire for å teste dyr under dårlige lysforhold fem. Dette tillot testing av natta eller scotopic syn, der dyret bruker sine stang fotoreseptorer å se. Betingelser ble endret ved ganske enkelt å finne den minste mengde lys nødvendig for dyret til å utføre synsstyrt assay. Analysen presenteres her tester photopic visjon, der dyret bruker stort sett sine koniske fotoreseptorer å se. Ved å kombinere disse tilnærmingene, begge typer visjon, scotopic og photopic, kan bli testet.
Vi brukte denne analysen for å teste den visuelle funksjon av dyr med en ektopisk øye vokst fra pluripotente celler overekspresjon de egentlig uttrykt øye feltet transkripsjonsfaktorer og ytre faktor, Noggin. Øyne som genereres fra disse vev var funksjonell 4,11. Noggin spiller også en rolle i fremre sentralnervesystemet utvikling 12, men ved hjelp av denne syn-styrt analysen i forbindelse med dyrehetten transplant analysen, ble dens rolle i øye utvikling avdekket. Andre ytre faktorer som påvirker tidlig embryo formasjon, men har ennå ikke vist seg å ha en rolle i øye utvikling kan indusert retinal stamfar formasjonen i pluripotent dyr cap cellene 4,11. Ved hjelp av denne atferds analysen, kunne fremtidige studier bestemme visuell funksjon av disse nylig genererte øyne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert med tilskudd fra National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), og EY019517 (ASV). Dette arbeidet ble også støttet av Forskningsrådet for å hindre blindhet ubegrenset tilskudd til Ophthalmology Department og Lions of Central New York. Vi vil også takke våre dyr tekniker, Matthew Mellini, for hans godt vare på dyrene og for å tråkke på til stjerne i denne videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
