Summary
Xenopus tadpoles siyah / beyaz tankın beyaz tarafında yüzme tercih laevis'den. Bu davranış, onların vizyonu tarafından yönlendirilir. Bu davranışa dayanarak, iribaşların görme fonksiyonunu test etmek için basit bir test sunuyoruz.
Abstract
Kurbağa kurbağa yavruları görsel fonksiyon ölçümü, Xenopus laevis, canlı hayvanlarda körlüğe için tarama sağlar. Optokinetik yanıtı, test edilen bütün omurgalı gözlenmiştir bir görüntü-bazlı, dönüşlü bir davranıştır. Böylece kuyruk kapak tepkisi ince yanıtı kaydetmek için eğitimli bir teknisyen gerektirir alternatif tedbir olarak kullanılan Tadpole gözler küçük. Biz tadpoles siyah ve beyaz her iki taraf ile bir tank içinde yerleştirilen zaman bir tank beyaz tarafında yüzmek için tercih ettiği gerçeğine dayalı alternatif bir davranış testi geliştirdi. Burada sunulan deney, kolaylıkla ölçülür bir yanıt oluşturan bir basit, ucuz bir alternatiftir. Kurulum en Ksenopus laboratuarlarında hazır bir tripod, web kamerası ve iç içe test tanklar, oluşur. Bu makalede önce ve optik sinir kesilmesinin ardından, iribaşların davranışını gösteren bir film içermektedir. Bir gözün işlevini test etmek için, biz de Repre dahilHer göz ardışık günlerde retina axotomy uygulanan hangi bir kurbağa yavrusu bir sentative sonuçları. Gelecek çalışmalar seferde birçok iribaşların vizyonunu test etmek için bu testte bir otomatik versiyonunu gelişebilir.
Introduction
Xenopus laevis göz oluşumunu çalışmak için bir model organizma olarak kullanılmaktadır. Gözleri görme gelişimi ve fonksiyonu üzerinde bir etkiye sahip test genlerin ya da yollar için en az bir hafta içinde vadeye kadar büyüyen, hızla gelişir. Görme fonksiyonunu test etmek için, optokinetik ve optomotor yanıtı sırasıyla 1,2, Zebra balığı ve Xenopus iribaşlara kullanılmaktadır. Xenopus iribaşların gözleri zebrabalıkları nispeten daha küçük olduğundan, bu deney Xenopus'ta ince kuyruk-Flip ve göz hareketleri davranışları tespit için özel ekipman kullanımı ve eğitimli personel gerektirir. Xenopus'ta daha sağlam bir davranış, burada 3 tanımlanan bir beyaz arka plan ile bir tank içinde yüzme için tercihtir. Bir buçuk siyah / yarı-beyaz tankı bir iribaş yerleştirirken, ön-metamorfik iribaş hızla tankın beyaz tarafına yüzer. Daha önce pluripotent hücre-türevli olmadığını belirlemek için bu tahlil kullanılmıştırGözleri 4 fonksiyonel vardı. Burada, premetamorphic Xenopus iribaşların görme fonksiyonunu test etmek için kullanılabilir, bu tahlilde ayrıntılı bir versiyonu, rapor etmektedir.
Sadece en Ksenopus laboratuvarlarda bulunan bir monte dijital video kamera, dijital kamera yazılımı ve standart ekipman gerektirir çünkü bu deney, optomotor tepki deneyi daha basittir. Buna ek olarak, kaydedilen tepki taksitli sonuçlarına özel bir eğitim gerektirir. Bizim temsilcisi sonuçları çift retina axotomy geçirmiş iribaşların aynı grup, tankın etrafına rastgele yüzmek olduğunu göstermektedir. Ayrıca bir göz görsel tepki açısından test edilebilir gösteren temsili bir tadpole arasındaki davranış deney sonuçları dahil ettik. Deneyde sırasında elde edilen sayı eklenir ve analiz edilebilir, böylece bir çalışma dahil edilmiştir. Bu çalışma, test edilen tadpoles görsel bir tepki var olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan Bakımı
Xenopus Bu çalışmada kullanılan tadpoles Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Upstate Medical University IACUC ve Kılavuz tarafından onaylanan prosedürlere uygun olarak, yükseltilmiş yetiştirilen ve tedavi edildi laevis.
. 1. Ön davranış Kurulum: Tadpoles
- Bir ticari olarak temin edilebilen bir kaynaktan, döllenmiş embriyolar Xenopus elde edilir ya da daha önce tarif edildiği gibi 6, in vitro olarak, oosit döller.
- 20 mM KCI;; 20 mM CaCl 2; 50 mM HEPES 0.1x MMR [10 X Marc'ın Modifiye Ringer (MMR) çözelti stok (10 mM MgCl2 içeren 60 mm Petri kapları 18 ˚ C'de nöral plak sahne embriyolar blastula yerleştirin; 1 M NaCI, 50 ug / ml gentamisin antibiyotik]), pH 7.5 'e ayarlandı ve otoklavda, oda sıcaklığında saklandı. Her gün 0.1x MMR değiştirin ve herhangi bir ölü embriyolar kaldırmak.
- Embriyolar ~ 27 Nieuwkoop ve Faber aşamaya ulaştıklarında - 30 7, inci geçişantibiyotik olmadan 0.1x MMR içine E embriyolar bağırsak bakteri gelişimini sağlamak için.
- Onlar besleme sahne (evre 45) ulaşıncaya kadar tetarlar büyür ve 0.1x MMR ile dolu 100 mm Petri kapları içine taşıyabilirsiniz. Aradan gününde 0.1x MMR değiştirerek, bir hafta boyunca her gün onlara ısırgan tozu süpernatant besleyin.
- 100 mm Petri kabındaki Bir hafta sonra, kurbağa su dolu yarım galon tankları için hayvanlar arasında hareket [0.5 g / L anlık okyanus ve 2 mM sodyum fosfat dibazik (Na 2 HPO 4: 141,96 mw) pH 6.8]. Adım 2.4 gibi onları beslemek, ancak su bulutlu olduğunda suya haftada sadece 2-3 kez değiştirin. Işıklar 06:00 de dönüm ile 12 saat aydınlık/12 karanlık ışık döngüsü içinde hayvanları korumak.
- Bir laboratuar tezgah underpad, en az 12 saat O / N, testten önce gibi beyaz bir yüzeye test konularla yarım galon tankı yerleştirin.
- Aşamaları 45-50 Test tadpoles aşağıdaki aşama 3'te tarif edildiği.
. 2. Ön davranış Kurulum: Equipment
- Davranış tahlil için laboratuara bir alanı kenara. Bu standart floresan aydınlatma ile sessiz, düşük trafik alanda olmalıdır.
- Hayvanlar için test tankları hazırlayın.
Iç içe, yarım galon test tankları iki kısımdan oluşur: su ve kurbağa yavrularını yapacak bir iç tank; ve görsel uyaran ile bir dış tankı.- İç tank için, bir sharpie, alttan 5 cm ile dış köşelerinde küçük bir işareti yapmak; Bu su hattı (Şekil 1A, yeşil noktalı çizgi).
- Aynı zamanda, iç depo için, Sylgard elastomer gibi eylemsiz bir bileşik ile (köşelerinde ve merkezinde) tank içinde divets doldurun. NOT: içeri dolu değilse tadpoles bu alanlarda oyalanmak
- Dış tank için, beyaz kağıt mendil Şekil 1B siyah elektrik bandı ve diğer yarısı ile bir tankın dışında tam yarısını kapsamaktadır.
- Üzerine tankları yerleştirinpikap aşılamak.
- Kur kamerası / tripod bu test tankların üstünde olduğunu böylece. Şekil 1C 'de gösterildiği gibi, test alanı görüntülenmesine olanak vermek üzere kamera ayarlayın.
- 5 yüklü QuickTime Player yazılımı ile bir bilgisayara kameranızı bağlayın. Kamerayı açın. QuickTime Player, File altında, 'Yeni Film Recording' seçeneğini seçin. Davranış tahlil kurulum hemen bilgisayarda görünür olacaktır.
- Larva davranışını etkileyen dış ipuçları azaltmak, hem de, suyun yüzeyinde yansıyan ışığı azaltmak için tüm kurulum boyunca hafif bir pamuklu bez Örtü.
- Emin olun 35-50 cd / m 2 arasında bez önlemleri altında parlaklık.
3.. Davranış Assay
- Kurbağa su ile adım 1.2.1 yapılan 5 cm su işareti için iç test deposunu doldurun.
- Bir küçük net kullanarak, yavaşça iç test tankına hayvan taşımak.
- Açık Sbilgisayar ve bir rehber olarak dış tankı kullanarak uickTime yazılım, kamera test alanı görselleştirmek ve kaydetmek mümkün olduğundan emin olun.
- Kamera ile kağıt ve kaydın parçası üzerinde hayvan adı, tarih ve saati yazın.
- Doğru Şekil 2'ye tankın siyah tarafı ile dış tanka test tankı yerleştirin.
- Depoyu düzenlenmesi hemen sonra film kaydı başlatın ve 2 dakika için zamanlayıcı ayarlayın.
- Zamanlayıcı çalar, iç deney tankı kaldırdığınızda, dış tankı 180 ° döndürmek ve dış tankın içindeki iç deney tankı yerleştirin. Sayacı başlatmak. Not: siyah tarafı şimdi diğer tarafta olmalıdır.
- On denemenin toplamı için adım 3.7, sekiz kez daha tekrarlayın. Her deneme işaretleyerek, bir rehber olarak Şekil 2 kullanın.
- Iki ayrı günlerde davranış testi tekrarlayın.
4. Retina Axotomy
- Onlar tepkisiz kadar% 0.02 tricaine hayvan yerleştirinBir # 3 forseps ile bir kuyruk tutam.
- 0.1x MMR içinde% 1 agaroz eritilir ve daha sonra bir 60 mm Petri kabı ekleyin. Hayvan kısmen sıvı içine daldırılmış, böylece sonra soğutuldu, agaroz küçük dikdörtgen çimen yapmak ve biraz% 0.02 tricaine ile çimen için iribaş ekleyin.
- Pierce 25 G iğne ile, gözün dorsal bölgesi arkasında bir 45 derecelik bir açı ile, deri, karşı tarafta forseps karşı hayvan takviye ise.
- Optik sinir yanındadır ven, makasla kesme özen, dikkatli, # 5 forseps ile deliğe ulaşmak optik sinir kesiyorlar ve yolumdan çevirmek. Şiddetli kanama nedeniyle kaza arteri kırpma var ise, o hızla euthanize% 2 tricaine hayvan. DİKKAT:% 2 tricaine çözüm insanlarda uyuşma neden olabilir. Bu çözüm eldiven ele alınmalıdır.
- Hayvan kurtarmak için ameliyat sonrası, 0.7X MMR ile 100 mm Petri tabağına ve 20 dakika boyunca 50 ug / ml gentamisin içinde hayvan. Next, kurbağa su ile kurtarma tankına transfer iribaş. Hayvan dinlenme O / incelemeleri edelim
- Ertesi sabah, (3,1-3,9 adım) yukarıda tarif edildiği gibi görsel fonksiyonunu test edin.
5.. Sonuçları Analiz
- Çalışmalar bittikten sonra, iribaş tankın siyah tarafında kalır süreyi ölçmek.
- Elle zaman görüntüler ve sık sık duraklamasına izin verir yazılımını kullanarak videoları görüntülemek. Video görüntü zaman bakmak. Tank iç başarıyla dış tankın içinde yuva yapar ve kameranın görünümünde karesi alındığında bir iki dakikalık deneme, başlangıç yazın.
- Hayvanların yüzme tankın hangi tarafı tanımlamak için iribaş gözlerinin konumunu kullanın. Iki gözü siyah / beyaz çizgiyi geçti yalnızca diğer tankın bir tarafında üzerinde geçiş tanımlayın.
- Hayvan siyah tarafta harcıyor (sn) her bir aralığın başlangıcını ve sonunu yazmak. Pause ve yenidendoğruluğunu sağlamak için videoyu rüzgar. Her deneme içinde sn toplam.
- Ekli Davranış çalışma kitabına girdi bu numaraları. Sayfası, hayvan saniyede toplam zaman, toplam 120 sn deneme ve uçurumdan tankın siyah tarafında harcanan zamanı çıkarılarak beyaz tarafta harcanan zamanın oranını hesaplamak [(120 - toplam saniye harcanan Siyah tarafı) / 120 sn]. 10 çalışmalarda üzerinde çalışma ortalamaları bu oran.
- Gün arasında denemeler (P ≤ 0.05) önemli olup olmadığını belirlemek için bir öğrencinin T-testi, eşleştirilmiş iki kuyruklu dağılımı kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki raporlar bu testte, Biz iribaşların gözünde ya görme işlevini test etmek için bu tahlil değişti Arkaplan Renk Tercihi Tahlili 3 premetamorphic Ksenopus tadpoles siyah / beyaz tankın beyaz tarafına yüzmeyi tercih ettiğini göstermiştir ve çağrıda Bir haftadan daha az. Bu şekilde, gözleri histolojik inceleme için toplanabilir.
Bu tepki görsel işaretlerin kaynaklanmaktadır kadar burada gösterir. Film 1, sol ve sağ panellerinde tadpoles aynı hayvandır. Solda ameliyattan önce ve sağda hayvanlar, her iki optik sinirler ayrıştırılmasından sonra hayvanlar bulunmaktadır. Biz hiçbir şey siyah taraftan hayvanları püskürtmek ya da beyaz tarafa çekmek eklenir olduğunu göstermek için su döndürülmüştür. Filmde, Hayvanların her bir grubu için optik sinirin durumunu gösterir alt köşelerinde iribaşlara bir şemasını sağlamaktır. Film 1, Normal, ukör tadpoles tankı etrafında amaçsızca yüzmek ise n-işletilen tadpoles test tankı az 30 saniye içinde arka plan rengi yanıt. Film hızı sağ üst köşesindeki artmış ve gerçek zaman kaydedildi.
Bir gözün görme test etmek için, optik sinir bir gözüne kopmuş ve tahlilinde test edildi, bir hayvandan alınan sonuçları dahil ettik. Diğer gözde optik sinir test iki gün sonra kopmuş ve vizyon güdümlü davranışı tekrar şu günlerde test edilmiştir. Şekil 3'te, bir grafik larva tankın kara tarafında yüzmek için tercih süreyi göstermektedir. Bu altı gün üst üste Şekil 3A ile ölçülmüştür. Yukarıda tarif edildiği gibi davranış, 2. günde ve solda test sonra, sağ optik sinir, 4. günde davranış testi sonra kesildi. Larva zaman Şekil 3C% 50 seviyesinde rasgele tankın beyaz yan tercih edilir. Dikkat edin, birsimal 1 ile 4 gün son 6 denemeleri sırasında tankın beyaz tarafında daha fazla zaman geçirdim. siyah tarafta harcanan miktarı hayvan iki gözü de kör oldu günde 5 ve 6, daha bile oldu. Iki gün, her gelen sonuçlar birlikte ortalaması ve bir grafiktir biçimi Şekil 3C'de sunulmuştur.
Şekil 1. Vizyon eşliğinde davranış testinin set-up Deneysel. (A) iç Test tankı şeffaf kalır ve (yeşil köşede kesik çizgiler) su seviyelerini göstermek için işaretlenir. (B) Dış testi tank siyah kaplı diğer yarısı beyaz kağıt mendil üzerine elektrik bandı. (C) tadpoles bir tripod üzerine yerleştirilen ve taşınabilir bir bilgisayara bağlı bir web kamerası kullanılarak görüntülendi. Test tankıdenemeler arasında kolay tornalama için izin verecek bir inokülasyon pikap s dinlenme. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Vizyon eşliğinde davranış deneyi nasıl yapılır şematik. Dikdörtgenler her deneme ile nasıl yarısı beyaz / yarı siyah alan değişiklikleri gösteren, deney tankı temsil eder. Bu durum, deneme sayısı işaretlemek için davranış tahlilinde sırasında kullanılabilir. Sağdaki testi tankı iki dakika tahlil sırasında tadpole ve beklenen bir davranış yakın-up. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
hin-page = "always"> 
Şekil 3,. Temsili bir deney, test tankın beyaz yanı üzerinde yüzerek larva zamanın yüzdesi Sayım. (A) saniye miktarı tankın siyah tarafı için harcanan larva bir tablo olarak ölçüldü ve yerleştirilir. (B A) da tablo tankın beyaz tarafının harcanan zamanın yüzdesi dönüştürülür. Bu toplam deneme süresi (120 sn) gelen siyah tarafta harcanan saniye çıkarılarak ve 120 saniye bölerek yapılır. (U) tedavi edilmemiş Tadpoles, bir tek axotomy (SA) vardı ve daha sonra bir çift aksotomi (DA) test edildi. (C) grafiği (beyaz tarafı (beyaz bar) ve siyah tarafında harcanan süre ortalama yüzdesini temsil siyah bar). Yapmak için kullanılan grafik tablo aşağıda gösterilmiştir.g3highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Film 1. Sağ ve sol panellerde beyaz arka plan tercihi tahlilde. Tadpoles olarak gören ve görmeyen hayvanların Davranış tepkisi aynıdır, ancak sağda olanları çift retina axotomy uğramıştır. Alt köşelerinde bir şematik optik sinir sağlam kopmuş veya (mavi bar) olup olmadığını gösterir. Sağ üst köşesindeki zamanlayıcı süresini gösterir. Film daha kolay görüntüleme için hızlandırdı. Bir kez beyaz alanda, tadpoles yakın beyaz ve siyah ve ters yönde arasındaki sınıra yüzmeyi nasıl fark. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.
| Day 1 | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | 5. Gün | 6. Gün | |
| Deneme 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Deneme 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Deneme 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Zaman Oranı beyaz tarafında harcanan | ||||||
| Oranı 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oran 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oran 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Oranı 10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ortalama | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1.00|
| Gün 1 | 2. Gün | 3. Gün | 4. Gün | 5. Gün | 6. Gün | |
| Deneme 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Deneme 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Deneme 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Deneme 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Deneme 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Deneme 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Deneme 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Deneme 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Deneme 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Deneme 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Zaman Oranı beyaz tarafında harcanan > | ||||||
| Oranı 1 | % 100 | % 100 | % 100 | % 100 | 43% | 43% |
| Oran 2 | % 100 | % 98 | % 100 | % 27 | 43% | % 52 |
| Oranı 3 | 94% | % 100 | 77% | % 100 | % 52 | % 61 |
| Oran 4 | % 100 | % 100 | % 91 | % 100 | % 51 | % 40 |
| Oranı 5 | % 100 | % 100 | 94% | 82% | % 53 | % 53 |
| % 99 | % 18 | 97% | % 53 | 43% | % 56 | |
| Oranı 7 | % 100 | % 89 | % 73 | % 80 | % 63 | % 53 |
| Oranı 8 | % 100 | % 6 | % 68 | % 80 | % 70 | 47% |
| Oranı 9 | % 100 | % 100 | 97% | % 64 | % 50 | % 53 |
| Oranı 10 | % 99 | 83% | % 100 | % 73 | % 48 | % 33 |
| Ortalama | % 99 | % 79 | % 90 | % 76 | % 51 | 4% 9 |
Çalışma 1. Beyaz arka plan tercih tahlil çalışma. Bu çalışma bu numaraları ve taksitli sonuçlar girmek için kullanılabilir böylece inşa hesaplamaları sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada kolayca az eğitimli laboratuvar personeli tarafından bir hafta altında yapılabilir basit bir vizyon eşliğinde davranış deneyi rapor. Diğer deneyler hayvan davranışları, özel ekipman ve uzmanlık gerektiren, bu tahlil hızlı bir test görme fonksiyonunu belirlemenize olanak sağlar. Başka bir davranışsal deney, Görsel Kaçınma tahlil, TECTUM Xenopus'ta 10 görsel algı nasıl katkıda belirlemek için geliştirilmiştir. Istikrarlı bir arka plan karşı hareketli, ve böylece, basit deneyinden daha özelleşmiş vizyon-temelli davranış ölçebilirsiniz cevaben Bu tahlil mekansal ayarlama ve kontrast duyarlılık burada bildirdi. Otomatik bir davranış sistemi, tank 8 bir tarafında harcanan süreyi ölçmek olduğu bildirilmiştir. Karanlık veya aydınlık ortamlarda 9 geçirdikleri zaman Zebra balığı miktarını ölçmek için kullanılır olmuştur piyasada mevcut yazılım (örn. ANY-labirent yazılım) da vardır. Birssay Biz pahalı donanım veya yazılım bu tür satın gerektirmez burada rapor, ancak bunun yerine, görme fonksiyonunu ölçmek için günlük reaktifler ve ekipman dayanır.
Vizyon eşliğinde tahlil görsel fonksiyonunu test etmek için bir hayvan üzerinde gerçekleştirilir. Birbirlerine çeşitli iribaşların davranışsal tahlil sonuçlarını karşılaştırarak, biz tedavi grupları içinde hayvanlar arasında istatistiksel fark gözlenmiştir. Biz altı gün üst üste üç tetarlar test edilmiş ve ayrıca günde on denemeler çalışan, üç gün üst üste başka beş hayvanları test. Her iki durumda da, biz tedavi edilmemiş veya tek aksotomi gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik (p = 0,2067) bulundu, ancak bu hayvanların çift aksotomi grubunda (p = 0.002) kıyaslandığında istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik elde. Bu bir Tukey çoklu karşılaştırma testi (n = 8 tadpoles) ile 2-yönlü ANOVA istatistiksel test çalışan Prism 6.0c yazılımı kullanılarak ölçüldü. Maksimal olması içinveri noktaları miktarı ameliyattan önce, altı günlük davranış deneyi kullanmanızı öneririz. Sonuçlar dokusunun daha az dejenerasyonu ile daha hızlı elde edilmesi gerekiyorsa, biz üç günlük sistemini kullanmanızı öneririz.
Bu deney, bir seferde bir hayvan test eder. Biz iki tadpoles veya daha fazla eş zamanlı olarak ölçülen olabilir eğer görmek için pilot çalışmalar yapılmaktadır. Bir tankta iki tetarlar olan tankın beyaz tarafı için kendi tercihlerini etkileyip etkilemediğini belirlemek için, ayrı ayrı, sonra her iribaş test. Görüntüler tankı üzerinde alınmıştır beri tadpoles herhangi bir süre için birbirlerine üstünde veya altında yüzdü eğer, biz zor ayrı anlatmak bulundu. Farklı boyutlarda tetarlar kullandıysanız, biz daha büyük bir yerde küçük bir yüzerek etkileyeceğini görülmektedir. Geleceğin teknolojileri aynı boyutta birden hayvanların daha iyi izlenmesini sağlayacak genetik işareti, kurbağa yavruları, için geliştirilmiş olabilir.
Tadpo onlarca Bu testte gerçekleştirmeles, bazı tadpoles daha tutarlı diğerlerinden daha beyaz tarafını tercih ettikleri gözlenmiştir. Olan davranış, iki gün üst üste fazla% 10 değişmiştir Tadpoles, biz almak ameliyattan önce üçüncü gün tekrar test edildi istiyorum. Bu çünkü başka bir gözlem olabilir: Biz beyaz bir arka plan üzerinde hayvanları yerleştirerek de tankın beyaz tarafı için kendi tercihi bir fark yapılmış olduğunu fark ettim. Bu ekstra gün sahip tankın beyaz tarafını tercih için bazı tetarlar durum yardımcı olabilir. Bu tahlilin bir sınırlama sadece görsel bir fonksiyonu test olmasıdır. Biz gözlenen değişkenlik azalmış görme fonksiyonunun veya körlük dışında diğer gelişimsel kusurlar, nedeniyle olabilir. Bu nedenle, ameliyat öncesi en az% 60 tercih gösterdi hayvanlar daha test edilmedi.
Ayrıca pre-metamorfik iribaşların yaştan bir dizi test. Biz aşamada 45 daha genç tadpoles çok küçük ve gözleri bizim biz kullanarak izlemek zor olduğunu bulmuşlardırBCAM. Eski tadpoles (51 aşamalarında - 55 +) daha deli idi; onlar sonuçta tankın beyaz tarafında daha fazla zaman harcanan, ancak onlar orada yüzmek için daha uzun sürer gibi görünüyor. Bu büyük hayvanlar daha büyük olan ve bu nedenle, daha kolay izlemek için, fakat yukarıda belirtildiği gibi ameliyat öncesi test gereklidir. Beklenen ve bu yaşlarda hayvanlar sonraki çalışmalarda kullanmak için iyi olurdu gibi aksine, 50'ye kadar aşamada 45 de iribaşların çoğunluğu davrandım.
Sirkadiyen ışık değişiklikleri Xenopus'ta 2 vizyon eşliğinde davranışsal yanıtları etkilediği gösterilmiştir. Bu gözlem ile tutarlı, biz hızlı sabah yapılan çalışmalarda deney tankının beyaz tarafına yüzerek aynı hayvan, öğleden sonra davranış testleri sırasında çok daha uzun sürdü fark ettim. 'Aynı hayvan / farklı zaman' çalışmaların bir dizi iletken sonra, biz 06:00-13:00 oldu davranış deneyi için en iyi zaman belirlenir.
Biz de bir dijital Handh kullanmışeld kamera düşük ışık koşullarında 5 altında hayvanların test Firewire ile bağlanır. Gece veya skotopik görme Bu izin test, hangi hayvan görmek için onun çubuk fotoreseptör kullanır. Koşullar sadece görme güdümlü deneyi gerçekleştirmek için bir hayvan için gerekli ışık en az miktarda bularak değiştirildi. Burada sunulan tahlil Fotopik vizyon testleri, hayvan çoğunlukla görmek için onun koni fotoreseptör kullanır hangi. Bu yaklaşımları birleştirerek, vizyon, scotopic ve fotopik iki tip, test edilebilir.
Biz göz alanı doğal olarak ifade edilen transkripsiyon faktörleri ve dış faktör, Noggin aşırı ifade pluripotent hücrelerinden geliştirilen bir dış gözle hayvanların görme fonksiyonunu test etmek için bu tahlil kullanılmıştır. Bu dokulardan elde rengi 4,11 işlevsel. Noggin, aynı zamanda, ön, merkezi sinir sistemi gelişme 12 bir rol oynar, ancak hayvan kap tr ile bağlantılı olarak, bu görüş güdümlü deneyi kullanılarakansplant tahlil, göz gelişiminde rolü ortaya çıkarılmıştır. Erken embriyo oluşumunu etkileyen ancak diğer dış faktörler henüz göz gelişiminde önemli bir rolü pluripotent hayvan kap hücrelerinde 4,11 retina progenitör oluşumuna sebep olabilir olduğu gösterilmiştir değil. Bu davranışsal testte kullanarak, gelecekteki çalışmalar bu yeni oluşturulan gözlerin görme işlevini belirlemek olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından finanse edildi: EY015748, EY017964 (MEZ) ve EY019517 (ASV). Bu çalışma aynı zamanda Göz Hastalıkları Anabilim Dalı ve Orta New York Lions Körlük Serbest Grant Engellenir Research tarafından desteklenmiştir. Biz de hayvanların onun mükemmel bakım için ve bu video yıldız için adım için bizim hayvan teknisyeni, Matthew Mellini, teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
