Summary
제노는 올챙이가 검은 색 / 흰색 탱크의 흰색 측면에서 수영을 선호 laevis의. 이 동작은 자신의 비전에 의해 유도된다. 이 동작을 바탕으로, 우리는 올챙이의 시각 기능을 테스트 할 수있는 간단한 분석을 제시한다.
Abstract
개구리의 올챙이의 시각 기능의 측정은,는 Xenopus laevis의, 살아있는 동물의 실명에 대한 검사를 할 수 있습니다. optokinetic 응답은 테스트 한 모든 척추 동물에서 관찰 된 비전 기반의 재귀 동작입니다. 그래서 꼬리 플립 응답이 미묘한 반응을 기록 할 수있는 숙련 된 기술자를 필요로 다른 측정으로 사용 된 올챙이의 눈은 작은 수 있습니다. 우리는 올챙이가 검은 색과 흰색 양면 모두 탱크에 주입 할 때 탱크의 백색 옆에 수영하는 것을 선호한다는 사실에 따라 다른 행동 분석을 개발했다. 여기에 제시된 분석은 쉽게 측정 된 응답을 만들어 저렴하고 간단한 대안입니다. 설치는 대부분의 Xenopus의 실험실에서 쉽게 사용할 수 삼각대, 웹캠과 중첩 된 시험 탱크로 구성되어 있습니다. 이 문서는 이전과 시신경을 단절 한 후, 올챙이의 동작을 보여주는 동영상이 포함되어 있습니다. 한쪽 눈의 기능을 테스트하기 위해, 우리는 또한 스와 템포 포함각각의 눈은 연속적인 일에 망막 axotomy을 시행하는 올챙이의 sentative 결과. 미래 연구는 한 번에 여러 올챙이의 비전을 테스트하기 위해이 분석의 자동화 된 버전을 개발할 수 있습니다.
Introduction
는 Xenopus laevis의 눈 형성을 연구하는 모델 생물로 사용되었습니다. 눈은 시각 발달과 기능에 영향을 테스트하는 유전자 또는 경로에 대한보다 주에 만기 성장하고, 신속하게 개발할 수 있습니다. 시각 기능을 테스트하기 위해 optokinetic 및 optomotor 응답은 각각 1, 2, 제브라 피쉬와는 Xenopus 올챙이에서 사용되었다. Xenopus의 올챙이의 눈이 제브라 피쉬에 비해 상대적으로 작은이기 때문에,이 분석은 Xenopus의 미묘한 꼬리 플립과 눈 운동 동작을 감지하는 특수 장비의 사용과 훈련 된 인력이 필요합니다. Xenopus의의보다 강력한 행동은 여기에 3 설명 흰색 배경에 탱크에서 수영에 대한 기본 설정입니다. 반 블랙 / 반 흰색 탱크에서 올챙이를 배치 할 때 미리 변성 올챙이 신속하게 탱크의 백색 옆에 수영. 우리는 이전에 다 능성 세포 유래 여부를 확인하기 위해이 분석을 사용눈은 4 기능이었다. 여기, 우리는 premetamorphic Xenopus의 올챙이의 시각 기능을 테스트하는 데 사용할 수있는이 분석의 세부 버전을보고합니다.
그것은 단지 대부분의 Xenopus의 실험실에서 발견 탑재 디지털 캠코더, 디지털 카메라 소프트웨어 및 표준 장비를 필요로하기 때문에이 분석은 optomotor 응답 분석보다 간단합니다. 또한, 기록 된 반응은 집계 결과에 특별한 훈련이 필요하지 않습니다. 우리의 대표적인 결과는 두 번 망막 axotomy을 시행 한 올챙이 같은 그룹, 탱크 주위에 무작위로 수영을 보여줍니다. 우리는 또한 하나의 눈은 시각적 인 반응을 테스트 할 수있는 방법을 보여주는 대표적인 올챙이의 행동 분석 결과를 포함했다. 분석 기간 동안 획득 한 숫자를 삽입하고 분석 할 수 있도록 워크 시트가 포함되어 있습니다. 이 워크 시트 테스트 올챙이가 시각적 응답을 가지고 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수있다.
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Protocol
동물 관리
Xenopus의이 연구에 사용 된 올챙이는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 북부 의과 대학 IACUC 및 가이드에 의해 승인 된 절차에 따라, 성장 제기 및 처리 하였다 laevis의.
. 1 전 동작 설정 : 올챙이
- 시판 소스에서 수정 된 Xenopus의 배아를 얻거나 이전에 6 바와 같이 체외에서 난자를 비옥.
- 20 mM의 KCl을,, 20 mM의 염화칼슘, 50 mM의 HEPES 0.1X MMR [10 X 마크의 수정 링거 (MMR) 솔루션 주식 (10 mM의 MgCl2를 2를 포함 60mm 배양 접시에 18 ˚ C에서 신경 판 단계의 배아에 blastula를 놓고; 1 M의 NaCl, 50 ㎍ / ml의 젠타 마이신 항생제), pH를 7.5로 조정하고 오토 클레이브 RT에서 보관. 매일 0.1X MMR을 변경하고 죽은 태아를 제거합니다.
- 배아 ~ 27 Nieuwkoop와 페이버 단계에 도달하면 - 30 7 번째 전환항생제없이 0.1X MMR에 전자 배아 장내 박테리아의 성장을 허용합니다.
- 그들은 먹이 단계 (단계 45)에 도달 할 때까지 올챙이 성장과 0.1X MMR 가득 100mm 배양 접시로 이동합니다. 그 사이 날에 0.1X MMR을 변경, 일주일 동안 매일 그들에게 쐐기 분말 상층 액을 넣습니다.
- 100mm 페트리 접시에 한 주 후에, 개구리 물이 가득 반 갤런 탱크에 동물 이동 [0.5 g / L 즉시 바다와 2 ㎜ 2 인산 나트륨 (나 2 HPO 4 : 141.96 MW)의 pH 6.8]. 단계 2.4로 피드,하지만 물이 흐린 경우 물에게 일주일에 2-3 시간을 변경합니다. 빛이 오전 6시에 점등과 12 시간의 light/12 어두운 빛의주기에서 동물을 유지합니다.
- 실험실 벤치있는 underpad, 적어도 12 시간의 O / N, 시험 전에 같은 흰색 표면에 시험 과목으로 하프 갤런 탱크를 배치합니다.
- 단계 45-50에서 테스트 올챙이은 아래 3 단계에서 설명.
. 2 전 동작 설정 : 기술 장비티
- 동작 분석을위한 실험실의 영역을 따로 설정합니다. 그것은 표준 형광 조명 조용하고, 트래픽이 낮은 지역에 있어야합니다.
- 동물 시험 탱크를 준비합니다.
중첩, 하프 갤런 테스트 탱크는 두 부분으로 구성되어있다 : 물과 올챙이를 개최한다 내부 탱크; 그리고 시각적 인 자극과 외부 탱크.- 내부 탱크, 빈틈없는, 바닥에서 5cm와 외부 코너에 작은 표시를합니다; 이 물 라인 (그림 1A, 녹색 점선)입니다.
- 또한, 내조에 대해, 실 가드 엘라스토머와 같은 불활성 화합물로 (모서리와 중앙) 탱크 디벳 채우기. 참고 : 그들은 채워하지 않는 경우 올챙이는이 지역에 머무르게됩니다
- 외부 탱크, 흰색 조직 종이 그림 1B 검은 전기 테이프, 다른 절반 하나의 탱크의 외부의 정확히 절반을 커버합니다.
- 에 탱크를 배치턴테이블을 접종.
- 설치 웹캠 / 삼각대는 테스트 탱크 위에 있도록. 도 1C에 도시 된 바와 같이, 테스트 영역의 시각화를 허용하도록 카메라를 조정.
- 5를 설치 퀵타임 플레이어 소프트웨어를 컴퓨터에 웹캠을 연결합니다. 카메라의 전원을 켭니다. QuickTime 플레이어에서 파일에서, '새 동영상 저장'을 선택합니다. 행동 분석 설정은 바로 컴퓨터에 표시됩니다.
- 올챙이 동작에 영향을 미칠 수있는 외부 신호를 줄일뿐만 아니라, 물의 표면에서의 반사광을 감소시키는 전체 셋업 위에 경량 면천 드레이프.
- 확인이 35-50 CD / m 2 사이 피복 대책 하에서 휘도.
3. 행동 분석
- 개구리 물 단계 1.2.1 제 5 cm 물 표시로 내부 테스트 탱크를 채우십시오.
- 작은 그물을 사용하여 조심스럽게 내부 테스트 탱크로 동물을 이동합니다.
- 오픈 Q컴퓨터와 가이드로 외부 탱크를 사용하는 방법에 대한 uickTime 소프트웨어는 카메라 테스트 영역을 시각화하고 기록 할 수 있는지 확인합니다.
- 카메라로 종이와 기록의 조각에 동물 이름, 날짜와 시간을 기록합니다.
- 오른쪽 그림 2 탱크의 검은면이 외부 탱크에 시험 탱크를 배치합니다.
- 탱크를 배치 한 후 바로 동영상 촬영을 시작하고 2 분 동안 타이머를 설정합니다.
- 타이머 비프, 내부 시험 탱크를 제거하면, 외부 탱크를 180도 회전과 외부 탱크 내부의 내부 시험 탱크를 배치합니다. 타이머를 시작합니다. 참고 : 검은 색면 지금 다른 측면에 있어야합니다.
- 열 시험의 총 단계 3.7, 여덟 번 이상 반복합니다. 각 시험을 확인, 가이드로 그림 2를 사용합니다.
- 두 개의 분리 된 일에 행동 분석을 반복합니다.
4. 망막 Axotomy
- 그들은이 응답 할 때까지 0.02 %의 tricaine에 동물을 배치# 3 집게로 꼬리 핀치에.
- 0.1X MMR 1 % 아가로 오스를 용융 한 후 60mm 페트리 접시에 추가합니다. 동물의 일부가 액체에 빠져들도록 냉각되면, 아가로 오스의 작은 직사각형의 잔디를 만들어 작은 0.02 %의 tricaine와 잔디에 올챙이를 추가합니다.
- 피어스 25 G 바늘을 눈의 등쪽 영역 뒤에 45도 각도로 피부, 반대편 집게 대하여 동물을 보강하면서.
- 시신경 옆에 자리 잡고 정맥을 자르지 않도록주의하면서 조심스럽게 # 5 집게로 구멍에 도달 시신경을 싹둑 꺼 그것을 뒤집어. 심한 출혈로 인해 실수로 동맥을 자르는에있는 경우, 다음 신속하게 안락사에 2 % tricaine에 동물을 배치합니다. 주의 : 2 % tricaine 솔루션은 인간의 마비를 일으킬 수 있습니다. 이 솔루션은 장갑으로 취급되어야한다.
- 동물을 복구하기 위해 수술 후, 0.7X MMR과 100mm 배양 접시에 20 분 동안 50 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신에 동물을 배치합니다. 네브라스카XT, 개구리 물 회수 탱크로 전송 올챙이. 동물 나머지 O / N.에게하자
- 다음날 아침, (3.1-3.9 단계) 전술 한 바와 같이 시각 기능을 테스트합니다.
5. 결과 분석
- 시험이 종료 된 후, 올챙이는 탱크의 검은면에 남아있는 시간의 양을 측정합니다.
- 수동으로 시간을 표시하고 자주 일시 중지 할 수 있습니다 소프트웨어를 사용하여 비디오를 볼 수 있습니다. 비디오 디스플레이 시간을 본다. 내부 탱크가 성공적으로 외부 탱크 내부에 둥지와 카메라의 관점에서 제곱 때입니다 두 분 재판의 시작을 기록합니다.
- 동물에 수영 탱크의 어느 쪽이 정의하는 올챙이의 눈의 위치를 사용합니다. 두 눈은 검은 색 / 흰색 선을 넘은 경우에만 다른 탱크의 한쪽면에 교차 정의합니다.
- 동물 블랙 측에 소비 한 시간 (초 단위) 각 간격의 시작과 끝을 적는다. 일시 정지 및 재정확도를 보장하기 위해 비디오 감는다. 각 시험에서 초 총.
- 연결된 동작 워크 시트에 입력이 숫자를. 워크 시트는 동물이 초 총 시간으로 총 120 초 시행 분열에서 탱크의 검은면에 소요되는 시간을 빼서 흰색면에 소요되는 시간의 비율을 계산합니다 [(120 - 전체 초에 지출 검은면) / 120 초]. 10 시험에 워크 시트의 평균은이 비율.
- 일 사이의 실험 (0.05 ≤ P) 중요한 있는지 확인하기 위해 학생의 T-테스트, 쌍, 양측 분포를 사용합니다.
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Representative Results
이전 보고서는이 분석, 우리는 올챙이의 눈을 하나의 시각적 기능을 테스트하기 위해이 분석을 변경 한 배경 색상 기본 설정 분석 3 premetamorphic Xenopus의 올챙이가 검은 색 / 흰색 탱크의 백색 옆에 수영하는 것을 선호하는 것으로 나타와 호출 한 주 미만. 이러한 방식으로, 자신의 눈 조직 학적 검사를 위해 수집 될 수있다.
우리는 응답이 시각 신호에 의한 방법을 여기에 보여줍니다. 영화 1에서, 좌측 및 우측 패널에 올챙이 같은 동물이다. 왼쪽은 수술 전 오른쪽에 동물, 모두 시신경을 절단하는 후 동물입니다. 우리는 아무것도 검은 측면에서 동물을 격퇴 또는 흰색면에 유치하기 위해 추가되지 않습니다 것을 보여주기 위해 물을 소용돌이. 영화에서, 우리는 동물의 각 세트에 대한 시신경의 상태를 보여줍니다 하단 모서리에있는 올챙이의 개략을 제공합니다. 영화 1, 일반, U에서맹인 올챙이 탱크 유유자적 수영을하면서 N-운영 올챙이는 시험 탱크 미만 30 초에 배경 색상에 응답합니다. 영화의 속도는 오른쪽 상단에있는 증가와 실제 시간을 기록했다.
한쪽 눈의 시력을 테스트하기 위해, 우리는 시신경 한 눈에 절단 및 우리의 분석에서 테스트 된 동물의 결과를 포함했다. 다른 눈의 시신경은 시험 이틀 후 절단하고 비전 가이드 동작은 다시 다음과 같은 일에서 테스트되었습니다. 도 3에서, 그래프는 올챙이가 탱크의 흑측에 수영을 선택하는 시간을 나타낸다. 이것은 여섯 연속 일 그림 3A 측정 하였다. 전술 한 바와 같이 동작을 하루에 2 왼쪽에서 테스트 된 후, 오른쪽 시신경은 4 일에 행동 테스트 후, 절단되었다. 올챙이가 시간도 3c의 50 %에 무작위로 탱크의 흰색면을 선호했다. 주의 그근위은 1 ~ 4 일에 지난 6 시험 중에 탱크의 흰색 측면에 더 많은 시간을 보냈다. 블랙 측에 보낸 시간의 양이 동물은 두 눈에 장님 일 5, 6,에조차했다. 이틀 각각의 결과는 함께 평균 및 그래프 형태의 그림 3C에 발표되었다.
그림 1. 비전 가이드 행동 분석의 셋업 실험. (A) 내부 시험 탱크가 투명 남아 (녹색 모서리에 점선) 물 수준을 나타 내기 위해 표시됩니다. (B) 외부 시험 탱크는 검은 색으로 덮여있다 다른 한 반 및 흰색 조직 종이에 전기 테이프. (C) 올챙이는 삼각대에 배치 휴대용 컴퓨터에 연결된 웹캠을 사용하여 시각입니다. 시험 탱크시험 사이에 쉽게 회전을 허용하는 접종 턴테이블에 관련된 나머지는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 비전 가이드 행동 분석을 수행하는 방법의 개략도. 사각형은 각각의 재판과 방법을 절반 흰색 / 반 검은 영역의 변화를 보여주는 시험 탱크를 나타냅니다. 이 재판의 수를 표시하는 행동 분석 중에 사용할 수 있습니다. 오른쪽의 시험 탱크는 두 분의 분석 중에 올챙이와 예상되는 동작의 근접 촬영입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 3. 대표적인 실험 시험 탱크의 백색 측 올챙이 헤엄 시간의 백분율을 집계. (A) 초의 양은 탱크의 흑측에 소요 올챙이가 나타난 측정 및 배치된다. (B )의 테이블은 탱크의 백색 측의 소요 시간의 백분율로 변환된다. 이는 총 시험 시간 (120 초)에서 검은 측에 소요되는 초를 뺀 120 초로 나누어 수행된다. (U) 치료했다 올챙이는 단일 axotomy (SA)을했다 후 이중 axotomy (DA)를 시험 하였다. (C)의 그래프는 (화이트 사이드 (흰색 막대)과 검은 색 측에서 보낸 시간의 평균 비율을 나타냅니다 검은 색 막대). 그래프를 만드는 데 사용되는 테이블은 다음과 같습니다.g3highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1. 왼쪽과 오른쪽 패널에 흰색 배경 환경 분석. 올챙이의 시력과 눈 먼 동물의 행동 반응은 동일하지만, 오른쪽에있는 사람은 두 번 망막 axotomy을 겪었다. 하단 모서리에있는 도식은 시신경이 손상 또는 절단 (파란색 막대)인지 여부를 나타냅니다. 오른쪽 상단 모서리에있는 타이머가 시간을 나타냅니다. 영화는 쉽게 볼 가속화된다. 일단 흰색 영역에서, 올챙이 가까이 흰색과 검은 색과 반대 방향의 경계에 수영하는 방법을 알 수 있습니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 다Y 1 | 2 일 | 3 일 | 4 일 | 5 일 | 6 일 | |
| 시험 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ TD> | 0 |
| 시험 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시험 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 시간의 비율은 흰색면에 소요 | ||||||
| 비율 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비율 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 비 (10) | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 평균 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <TD> 1.00|
| 1 일 | 2 일 | 3 일 | 4 일 | 5 일 | 6 일 | |
| 시험 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| 시험 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| 시험 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| 시험 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| 시험 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| 시험 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| 시험 7 | 0 | 13 | 33 | (24) | 44 | 57 |
| 시험 8 | 0 | 113 | 38 | (24) | 36 | 64 |
| 시험 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | (60) | 57 |
| 시험 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | (80) |
| 시간의 비율은 흰색면에 소요 > | ||||||
| 비율 1 | 100 % | 100 % | 100 % | 100 % | 43 % | 43 % |
| 비율 2 | 100 % | 98 % | 100 % | 27 % | 43 % | 52 % |
| 비율 3 | 94 % | 100 % | 77 % | 100 % | 52 % | 61 % |
| 비율 4 | 100 % | 100 % | 91 % | 100 % | 51 % | 40 % |
| 비율 5 | 100 % | 100 % | 94 % | 82 % | 53 % | 53 % |
| 99 % | 18 % | 97 % | 53 % | 43 % | 56 % | |
| 비율 7 | 100 % | 89 % | 73 % | 80 % | 63 % | 53 % |
| 비율 8 | 100 % | 6 % | 68 % | 80 % | 70 % | 47 % |
| 비율 9 | 100 % | 100 % | 97 % | 64 % | 50 % | 53 % |
| 비 (10) | 99 % | 83 % | 100 % | 73 % | 48 % | 33 % |
| 평균 | 99 % | 79 % | 90 % | 76 % | 51 % | 49 % |
워크 시트 1. 흰색 배경 환경 분석 워크 시트. 이 워크 시트는 숫자와 집계 결과를 입력 할 수 있도록 내장 된 계산이있다.
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Discussion
우리는 여기에 쉽게 최소한의 교육을받은 실험실 요원에 의해 주에서 수행 할 수있는 간단한 비전 가이드 행동 분석을보고합니다. 다른 분석은 동물의 행동에 전문 장비와 전문 지식을 필요로하지만,이 분석은 빠른 테스트가 시각 기능을 확인할 수 있습니다. 또 다른 행동 분석, 비주얼 회피 분석은, tectum는 Xenopus의 10에 시각적 인식에 기여하는 방법을 결정하기 위해 개발되었습니다. 안정된 배경 대 이동, 따라서 단순한 분석보다 더 전문적인 비전 기반 동작을 측정 할 수 있습니다에 대한 응답이 분석 측정 공간 조정 및 대비 감도는 여기에보고했다. 자동화 된 동작 시스템은 탱크 (8)의 일측에 소요되는 시간의 양을 측정 할 수있는 것으로보고되었다. 어둡거나 밝은 환경 9에서 보내는 시간 지브라 피쉬의 양을 측정하는 데 사용 된 시판용 소프트웨어 (예 ANY-미로 소프트웨어)도있다.ssay 우리는 고가의 장비 나 소프트웨어의 이러한 유형의 구입을 필요로하지 않습니다 여기보고, 대신에 시각 기능을 측정하기 위해 일상 시약 및 장비에 의존합니다.
비전 가이드 분석은 시각적 기능을 테스트하기 위해 동물에서 수행됩니다. 서로 여러 올챙이의 행동 분석 결과를 비교했을 때, 우리는 치료 그룹 내에서 동물 사이에 통계적으로 유의 한 차이가 관찰되지. 우리는 여섯 일 연속 세 올챙이을 시험하고 또한 하루에 열 시험을 실행하는 세 개의 연속적인 일에 또 다른 5 동물을 시험했다. 각각의 경우에, 우리는 치료 또는 단일 axotomy 그룹 사이에 통계적으로 유의 한 변화 (P = 0.2067)를 찾을 수 없습니다, 그러나이 동물은 두 axotomy 그룹 (P = 0.002)와 비교했을 때 통계적으로 유의 한 변화를 얻을. 이것은 Tukey의 다중 비교 시험 (N = 8 올챙이)와 2 웨이 ANOVA 통계 테스트를 실행 프리즘 6.0c 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. 최대를하려면데이터 포인트의 양을 수술하기 전에, 우리는 여섯 날의 행동 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 결과는 조직의 적은 변성 빨리 얻을 수 할 필요가있는 경우에, 우리는 3 일 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.
이 분석은 한번에 하나의 동물을 테스트한다. 우리는 두 올챙이 이상 동시에 측정 할 수 있는지 확인하기 위해 파일럿 연구를 수행 하였다. 하나의 탱크에 두 올챙이를 갖는 탱크의 흰색 측면에 대한 자신의 선호에 영향을 확인하려면, 우리는 함께 분리 한 다음 각 올챙이을 테스트했습니다. 이미지가 탱크 위에서 찍은 이후 올챙이 시간의 길이에 대한 서로의 위 또는 아래에 수영을하는 경우, 우리는 어려운 구별 할 수 있습니다. 우리는 다른 크기의 올챙이를 사용하는 경우, 우리는 더 큰 하나가 어디 작은 하나 헤엄 영향을 미칠 것을 관찰했다. 미래의 기술은 동일한 크기의 여러 동물을 더 잘 추적을 허용하는 유전자 표시 올챙이로 개발 될 수있다.
tadpo 수십에서이 분석을 수행하기에레는, 우리는 몇 가지 올챙이가 더 지속적으로 다른 사람보다 흰색면을 선호하는 것을 관찰했다. 그 동작이 이틀 연속 10 % 이상에 의해 변화 올챙이, 우리는 가지고 수술 전에 셋째 날에 다시 테스트 한 것입니다. 이 때문에 다른 관측으로되어있는 경우가 있습니다 : 우리는 흰색 배경에 동물을 배치하는 것은 또한 탱크의 흰색 측면에 대한 자신의 선호도에 차이를 만든 것으로 나타났습니다. 그 여분의 하루 갖는 탱크의 흰색면을 선호하는 일부 올챙이을 조절하는 데 도움 수 있습니다. 이 분석의 한계는 시각적 기능을 테스트하는 것입니다. 우리가 관찰 된 변동성이 감소 시각 기능 또는 실명 이외의 다른 발달 결함으로 인해 수 있습니다. 이러한 이유로, 수술 전에 60 % 미만인 환경을 보인 동물은 추가 시험하지 않았다.
우리는 또한 미리 변성 올챙이의 나이의 범위를 테스트했다. 우리는 단 45 세 미만의 올챙이가 매우 작아서 눈이 우리의 우리를 사용하여 추적하기 어려운 사실을 발견BCAM. 이전 올챙이가 (51 스테이지 - 55 +)를 더 산만했다; 그들이 궁극적으로 탱크의 흰색 측면에 더 많은 시간을 할애하지만, 그들은 거기에 수영을 오래 걸릴 것 같다. 이러한 이전 동물 컸다, 따라서 더 쉽게 추적 할 수 있지만, 상기 한 바와 같이 수술 전에 테스트 필요. 예상이 시대의 동물들이 미래 연구에 사용하는 것이 가장 것 같은 반면에, 최대 50 단계 45에서 올챙이의 대부분은 행동했습니다.
주기 빛이 변화는 Xenopus의 2에 비전 가이드 행동 반응에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 관찰과 일치, 우리는 신속 아침에 실시한 시험에서 시험 탱크의 흰색면에 수영 같은 동물, 오후 동작 시험 중에 더 이상 걸렸다 것으로 나타났습니다. '같은 동물 / 서로 다른 시간'시련의 번호를 수행 한 후, 우리는 오전 6시부터 오후 1시까지 한 행동 분석을위한 가장 좋은 시간을 결정.
우리는 또한 디지털 handh을 사용했습니다ELD 캠코더 낮은 조명 조건 5에서 동물을 테스트하는 파이어 와이어로 연결. 야간 또는 암순응 비전이 허용 테스트는, 어떤 동물은 볼의로드 광 수용체를 사용합니다. 조건은 단순히 비전 가이드 분석을 수행하기 위해 동물에 필요한 빛의 최소 금액을 찾아 변경되었다. 여기에 제시된 분석은 포토 픽 비전을 테스트, 동물은 대부분 볼의 콘 광 수용체를 사용하는. 이러한 방법을 조합함으로써, 시각, 암순응 및 포토 픽의 두 종류가 시험 될 수있다.
우리는 본질적으로 표현 눈들 전사 요인과 외적 요인, Noggin의 과다 발현 만능 세포에서 성장 자궁외 눈으로 동물의 시각 기능을 테스트하기 위해이 분석을 사용했다. 이러한 조직에서 생성 된 눈 4,11 기능이었다. 소량도 전방 중앙 신경 시스템 개발 (12)의 역할을하지만, 동물 모자 TR와 함께이 비전 가이드 분석을 사용하여ansplant 분석은, 눈 개발의 역할을 발견했다. 초기 배아의 형성에 영향을 미치지 만, 다른 외부 적 요인은 아직 눈 개발의 역할은 만능 동물 캡 세포 4,11 망막 전구 형성을 유도 할 수 있습니다 가지고 표시되지 않았습니다. 이 행동 적 분석을 이용하여, 미래의 연구는 이러한 새롭게 생성 된 눈의 시각 기능을 결정할 수있다.
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Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 : EY015748, EY017964 (MEZ), 및 EY019517 (ASV). 이 작품은 또한 안과 부서 및 중앙 뉴욕의 사자 실명 무제한 부여를 방지하기 위해 연구에 의해 지원되었다. 우리는 또한 동물의 자신의 우수한 치료를 위해이 비디오에서 주연하는 스테핑에 대한 우리의 동물 기술자, 마 멜리을, 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
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