Summary
Xenopus laevis renacuajos prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro. Este comportamiento es guiado por su visión. Sobre la base de este comportamiento, se presenta un ensayo simple para probar la función visual de los renacuajos.
Abstract
La medición de la función visual en los renacuajos de la rana Xenopus laevis, permite la detección de la ceguera en los animales vivos. La respuesta es un optocinético, comportamiento reflexivo basado en visión que se ha observado en todos los vertebrados examinados. Tadpole ojos son pequeños, así que utiliza la respuesta flip cola como medida alternativa, que requiere de un técnico capacitado para registrar la respuesta sutil. Hemos desarrollado un ensayo alternativo comportamiento basado en el hecho de que los renacuajos prefieren nadar en el lado blanco de un tanque cuando se coloca en un tanque con lados negros y blancos. El ensayo que aquí se presenta es una alternativa de bajo costo, simple que crea una respuesta que se mide fácilmente. La instalación consiste en un trípode, cámara web y tanques de prueba anidados, fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Este artículo incluye una película que muestra el comportamiento de los renacuajos, antes y después de cortar el nervio óptico. Con el fin de probar la función de uno de los ojos, también incluimos repreresultados representativos de un renacuajo en la que cada ojo se sometió a la axotomía de la retina en días consecutivos. Los estudios futuros podrían desarrollar una versión automatizada de este ensayo para probar la visión de muchos renacuajos a la vez.
Introduction
Xenopus laevis se han utilizado como un organismo modelo para estudiar la formación del ojo. Los ojos se desarrollan rápidamente, creciendo hacia la madurez en menos de una semana para los genes de prueba o vías que tienen un efecto sobre el desarrollo visual y la función. Para probar la función visual, la respuesta optocinético y optomotor se ha utilizado en el pez cebra y los renacuajos Xenopus, respectivamente 1,2. Debido a que los ojos de los renacuajos Xenopus son relativamente más pequeño que el pez cebra, este ensayo requiere el uso de equipo especializado y personal entrenado para detectar el comportamiento sutil cola-flip y de movimiento ocular en Xenopus. Un comportamiento más robusto en Xenopus es la preferencia para nadar en un tanque con un fondo blanco, que se describe en el presente documento 3. Al colocar un renacuajo en un medio tanque negro / mitad blanco, el renacuajo pre-metamórfica nada rápidamente hacia el lado blanco del tanque. Se utilizó previamente este ensayo para determinar si derivado de células pluripotentesojos eran funcionales 4. Aquí, se presenta una versión detallada de este ensayo, que se puede utilizar para probar la función visual de los renacuajos de Xenopus premetamórficas.
Este ensayo es más sencillo que el ensayo de respuesta optomotor, ya que sólo requiere una cámara de vídeo montada digitales, software de la cámara digital y el equipo estándar en la mayoría de los laboratorios de Xenopus. Además, la respuesta registrada no requiere una formación especial a los resultados de conteo. Nuestros resultados representativos muestran que el mismo grupo de renacuajos, después de haber sido sometidos a axotomía de la retina doble, nadar al azar alrededor del tanque. También hemos incluido los resultados del ensayo de comportamiento de un renacuajo representante, mostrando como uno de los ojos puede ser probado para la respuesta visual. Una hoja de cálculo se ha incluido para que los números adquiridos durante el ensayo pueden ser insertados y se analizaron. Esta hoja de trabajo se puede utilizar para determinar si los renacuajos probados tienen una respuesta visual.
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Protocol
Cuidado de los Animales
La Xenopus laevis renacuajos utilizadas en este estudio fueron cultivados, criados y tratados de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Upstate Medical University IACUC y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
. 1 Configuración Pre-comportamiento: Los renacuajos
- Obtener embriones de Xenopus fertilizados de una fuente disponible comercialmente o in vitro fertilizar oocitos, como se describió anteriormente 6.
- Coloque blástula a embriones en estadio de la placa neural a 18 ˚ C en 60 mm placas de Petri que contienen 0.1X MMR [10 Modificado solución (MMR) de las acciones de Ringer X Marc (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES; 1 M de NaCl; se ajustó a pH 7,5, sometido a autoclave y se almacenó a temperatura ambiente)] con antibiótico gentamicina 50 mg / ml. Cambie 0.1X MMR cada día y quitar cualquier embriones muertos.
- Una vez que los embriones alcanzan el estadio Nieuwkoop y Faber ~ 27 al 30 julio, cambiar the embriones en 0.1X MMR sin antibiótico para permitir el crecimiento bacteriano intestinal.
- Crecer los renacuajos hasta que alcanzan la etapa de alimentación (etapa 45) y moverlos a 100 mm placas de Petri llenas de 0.1X MMR. Aliméntelos sobrenadante polvo de ortiga cada dos días durante una semana, el cambio de la 0,1 X MMR en el día intermedio.
- Después de una semana en el plato de Petri de 100 mm, desplazar a los animales a medio galón tanques llenos de agua rana [0,5 g / L océano instantánea y 2 mM de sodio fosfato dibásico (Na 2 HPO 4: mw 141.96) pH 6,8]. Darles de comer como en el paso 2.4, pero cambie el agua sólo 2-3 veces por semana, cuando el agua está turbia. Mantener a los animales en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas light/12 con las luces de encender a las 6 am.
- Coloque el depósito de medio galón con los sujetos de prueba en una superficie blanca, como un underpad mesa de laboratorio, por lo menos 12 hr O / N, antes de la prueba.
- Renacuajos de prueba en las etapas 45 y 50 tal como se describe en el paso 3 a continuación.
. 2 Configuración Pre-comportamiento: Equipot
- Ponga a un lado un área de laboratorio para el ensayo de comportamiento. Debe estar en una zona tranquila y con poco tráfico con iluminación fluorescente estándar.
- Preparar los bancos de ensayo para los animales.
Los tanques de prueba de medio galón anidados se componen de dos partes: un tanque interno que contendrá el agua y renacuajos; y un tanque exterior con el estímulo visual.- Para el interior del tanque, hacer una pequeña marca en las esquinas exteriores con un Sharpie, 5 cm desde la parte inferior; esta es la línea de agua (Figura 1A, línea punteada verde).
- También, para el tanque interior, llena los divets en el tanque (en las esquinas y el centro) con un compuesto inerte, como Sylgard elastómero. NOTA: Los renacuajos se quedarán en estas zonas si no se llenan pulg
- Para el tanque exterior, cubra exactamente la mitad de la parte exterior de un tanque con cinta aislante color negro y la otra mitad con el tejido blanco de papel Figura 1B.
- Coloque los tanques en ella inoculación de la placa giratoria.
- Configuración de la cámara web / trípode de modo que está por encima de los bancos de ensayo. Ajustar la cámara para permitir la visualización de la zona de pruebas, como se muestra en la figura 1C.
- Conecte la cámara web a un ordenador con el software QuickTime Player instalado 5. Encienda la cámara. En QuickTime Player, en Archivo, seleccione 'Nueva grabación de la película. " La configuración del ensayo de comportamiento será visible en el equipo de inmediato.
- Coloque un paño de algodón ligero en toda la instalación para reducir las señales externas que podrían afectar el comportamiento de renacuajo, así como, reducir la luz reflejada en la superficie del agua.
- Asegúrese de que la luminancia bajo las medidas de tela entre 35-50 cd / m 2.
3. Ensayo de Comportamiento
- Llene el tanque de pruebas interior para la marca de 5 cm de agua realizada en el paso 1.2.1 con agua rana.
- El uso de una pequeña red, mover suavemente al animal en el tanque de pruebas interno.
- Abrir QuickTime software en la computadora y, usando el tanque exterior como guía, asegúrese de que la cámara es capaz de visualizar y grabar la zona de pruebas.
- Escriba el nombre de un animal, la fecha y la hora en un pedazo de papel y grabar con la cámara.
- Coloque el tanque de prueba en el tanque exterior con el lado negro de la cisterna a la derecha Figura 2.
- Comience a grabar la película inmediatamente después de arreglar el tanque y ajustar el temporizador durante 2 min.
- Cuando el temporizador de pitidos, retire el tanque de prueba interno, gire el depósito exterior 180 ° y coloque el tanque de prueba interna en el interior del tanque externo. Inicie el temporizador. Nota: el lado negro debe estar ahora en el otro lado.
- Repita el paso 3.7, ocho veces más para un total de diez pruebas. Utilice la Figura 2 como guía, marcando cada ensayo.
- Repita el ensayo de comportamiento en dos días separados.
4. Retina Axotomía
- Coloque animal en 0.02% tricaína hasta que no respondena una pizca de la cola con un # 3 pinzas.
- Derretir 1% de agarosa en 0.1X MMR y luego añadir a un 60 mm placa de Petri. Una vez enfriado, hacer una pequeña chuleta rectangular en la agarosa y añadir el renacuajo a la chuleta con un poco de 0,02% tricaína, de modo que el animal está parcialmente sumergido en el líquido.
- Pierce la piel en un ángulo de 45 grados detrás de la región dorsal del ojo con una aguja de 25 G, mientras sostiene el animal contra el fórceps sobre el lado opuesto.
- Teniendo cuidado de no cortar la vena, que se encuentra al lado del nervio óptico, el alcance cuidadosamente en el agujero por el n º 5 de fórceps, cortar el nervio óptico y darle la vuelta a un lado. Si hay sangrado grave por accidente cortando la arteria, luego coloque rápidamente al animal en un 2% tricaína la eutanasia. PRECAUCIÓN: solución tricaína 2% puede causar entumecimiento en los seres humanos. Esta solución debe ser manejado con guantes.
- Para recuperar el animal después de la cirugía, colocar animal en 100 mm de placa de Petri con 0.7X MMR y 50 mg / ml de gentamicina durante 20 min. Next, transferencia de renacuajo a depósito de recuperación con agua rana. Deje reposar animales O / N.
- A la mañana siguiente, probar la función visual como se describió anteriormente (pasos 3.1 a 3.9).
5. Analizar Resultados
- Después de que se completen los ensayos, medir la cantidad de tiempo que el renacuajo se queda en el lado negro de la cisterna.
- Ver manual de los vídeos mediante un software que muestra la hora y permite pausas frecuentes. Mira el tiempo de visualización de vídeo. Anote el inicio de la prueba de dos minutos, que es cuando el tanque interior anida con éxito dentro del tanque exterior y se eleva al cuadrado en vista de la cámara.
- Use la posición de los ojos del renacuajo de definir de qué lado del tanque de los animales están nadando en. Definir cruzar de un lado del tanque al otro sólo cuando ambos ojos han cruzado la línea de negro / blanco.
- Anote el comienzo y el final de cada intervalo (en segundos) que el animal pasa en el lado negro. Haga una pausa y volverenrollar el video para asegurar la exactitud. Sume el sec dentro de cada ensayo.
- Entrada estos números en la hoja de trabajo Comportamiento adjunto. La hoja de trabajo calcula la relación entre el tiempo que el animal pasó por el lado blanco, restando el tiempo invertido en el lado negro del tanque de la prueba total de 120 segundos y se divide por el tiempo total en segundos [(120 - total gastado en segundos el lado negro) / 120 seg]. Los promedios de hoja de cálculo de este ratio de más de los 10 ensayos.
- Utilice la prueba T de un estudiante, a la par, dos colas de distribución para determinar si los juicios entre los días son significativas (P ≤ 0,05).
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Representative Results
Informes anteriores han demostrado que los renacuajos de Xenopus premetamórficas prefieren nadar en la parte blanca de un / tanque blanco negro y llamado a este ensayo, el fondo del ensayo preferencia de color 3 Hemos cambiado este ensayo con el fin de probar la función visual de uno de los ojos de los renacuajos en menos de una semana. De esta manera, sus ojos se pueden recoger para el examen histológico.
Mostramos aquí cómo la respuesta se debe a las señales visuales. En la película 1, los renacuajos en los paneles izquierdo y derecho son los mismos animales. A la izquierda están los animales antes de la cirugía y de la derecha, los animales después de la ruptura de ambos nervios ópticos. Nos hizo girar el agua para demostrar que no se agrega nada para repeler a los animales desde el lado negro o atraerlos hacia el lado blanco. En la película, proporcionamos un esquema de los renacuajos en las esquinas inferiores, que muestra el estado del nervio óptico para cada conjunto de animales. En la película 1, la normal, urenacuajos operados-n responden al color de fondo en menos de 30 segundos en el tanque de prueba, mientras que los renacuajos ciegos nadando sin rumbo alrededor del tanque. La velocidad de las películas se incrementó y el tiempo real registrado en la esquina superior derecha.
Para poner a prueba la visión de un ojo, se han incluido los resultados de un animal cuyo nervio óptico fue cortada en un ojo y probado en nuestro ensayo. El nervio óptico en el otro ojo se rompió después de dos días de pruebas, y el comportamiento guiado por visión probado en los siguientes días de nuevo. En la Figura 3, un gráfico que muestra la cantidad de tiempo que el renacuajo eligió para nadar en el lado negro de la cisterna. Esto se midió en seis días consecutivos Figura 3A. Como se describió anteriormente, el nervio óptico derecho se cortó después de comportamiento se analizaron en el día 2 y la izquierda, después de prueba de comportamiento en el día 4. El renacuajo prefiere el lado blanco del tanque al azar en 50% del tiempo de la Figura 3C. Observe que la unaIMAL pasó más tiempo en el lado blanco del tanque durante los últimos 6 ensayos en los días 1 al 4. La cantidad de tiempo invertido en el lado negro era más aún en los días 5 y 6, cuando el animal estaba ciego de ambos ojos. Los resultados de cada uno de los dos días se promediaron juntos y presentarse de forma gráfica la figura 3C.
Figura 1. Estructura del ensayo del ensayo de comportamiento guiado por visión. (A) El tanque de prueba interior permanece transparente y está marcado para indicar el nivel del agua (verde líneas discontinuas en la esquina). (B) El tanque de prueba exterior está cubierto de negro cinta aislante en una mitad y el tejido blanco de papel en el otro. (C) Los renacuajos se visualizan usando una cámara web colocada en un trípode y conectada a un ordenador portátil. El tanque de pruebass descansan sobre una plataforma giratoria inoculación para permitir la fácil de inflexión entre los ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Esquema de la forma en que se realiza el ensayo de comportamiento guiado por visión. Los rectángulos representan el tanque de prueba, que muestra cómo el medio de color blanco / negro de la zona media cambia con cada ensayo. Esto puede ser usado durante el ensayo de comportamiento para marcar el número de prueba. El tanque de prueba de la derecha es un primer plano del renacuajo y su comportamiento esperado durante el ensayo de dos minutos. Haz clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Un experimento representativo tasar el porcentaje de tiempo que el renacuajo nadó en el lado blanco del tanque de prueba. (A) La cantidad de segundos el renacuajo se gasta en el lado negro del tanque se mide y se coloca en una mesa. (B ) La tabla en A se convierte en el porcentaje de tiempo gastado del lado blanco del tanque. Esto se realiza restando la SEC gastado en el lado negro desde el momento total del ensayo (120 seg) y dividiendo por 120 seg. Los renacuajos que estaban sin tratar (U), tenían un solo axotomía (SA) y luego una axotomía doble (DA) se pusieron a prueba. (C) El gráfico representa el porcentaje medio de tiempo invertido en el lado blanco (barra blanca) y el lado negro ( barra de color negro). La tabla que se utiliza para hacer el siguiente gráfico se muestra.g3highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1. Comportamiento de respuesta de los animales videntes y ciegos en el fondo blanco preferencia ensayo. Renacuajos en los paneles izquierdo y derecho son los mismos, pero los de la derecha han sido sometidos a axotomía retina doble. Un esquema en las esquinas inferiores indica si el nervio óptico está intacto o cortado (barra azul). El contador de tiempo en la esquina superior derecha indica el tiempo. La película se acelera para facilitar la visualización. Una vez en la zona blanca, observe cómo los renacuajos nadan cerca de la frontera entre la dirección en blanco y negro y el reverso. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
| Day 1 | Día 2 | Día 3 | Día 4 | Día 5 | Día 6 | |
| Prueba 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Prueba 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Prueba 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Relación entre el tiempo dedicado a lado blanco | ||||||
| Ratio 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Relación de 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Relación de 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 6 victorias | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 7 victorias | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Relación de 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 9 victorias | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| 10 Ratio | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Promedio | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1,00|
| Día 1 | Día 2 | Día 3 | Día 4 | Día 5 | Día 6 | |
| Prueba 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Prueba 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Prueba 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Prueba 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Prueba 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Trial 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Prueba 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Prueba 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Relación entre el tiempo dedicado a lado blanco > | ||||||
| Ratio 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Ratio 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Ratio 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Relación de 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Relación de 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| 7 victorias | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Relación de 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| 9 victorias | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| 10 Ratio | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Promedio | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Hoja de trabajo 1. Fondo blanco preferencia hoja de trabajo del ensayo. Esta hoja de trabajo tiene los cálculos construidos en forma que se puede usar para introducir números y resultados de conteo.
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Discussion
Se presenta aquí un sencillo ensayo de comportamiento guiado por visión que puede ser fácilmente realizado en menos de una semana por personal de laboratorio mínimamente entrenados. Mientras otros ensayos requieren equipo especializado y la experiencia en el comportamiento animal, este ensayo permite una prueba rápida para determinar la función visual. Otro ensayo de comportamiento, el ensayo de evitación de Visual, se ha desarrollado para determinar cómo el tectum contribuye a la percepción visual en Xenopus 10. Este ensayo mide la sintonización espacial y la sensibilidad al contraste en respuesta a un movimiento contra el fondo estable, y por lo tanto, se puede medir el comportamiento más especializada basada en la visión que el simple ensayo informó aquí. Un sistema automatizado comportamiento se ha informado que puede medir la cantidad de tiempo gastado en un lado del depósito 8. También hay software disponible comercialmente (por ejemplo, software CUALQUIER-laberinto) que se ha utilizado para medir la cantidad de pez cebra tiempo que pasan en entornos oscuros o brillantes 9. El unssay informe que aquí no requiere la compra de este tipo de equipo o software caro, sino que se basa en los reactivos y equipos de todos los días para medir la función visual.
El ensayo guiado por visión se lleva a cabo en un animal para probar su función visual. Al comparar los resultados del ensayo de comportamiento de varios renacuajos el uno al otro, se observó ninguna diferencia estadística entre los animales dentro de los grupos de tratamiento. Probamos tres renacuajos en seis días consecutivos y también a prueba otros cinco animales en tres días consecutivos, corriendo diez pruebas por día. En cualquiera de los casos, no se encontraron cambios estadísticamente significativas entre los grupos no tratados o axotomía individuales (P = 0,2067), sin embargo, obtuvimos un cambio estadísticamente significativo cuando estos animales se compararon con el grupo de doble axotomía (P = 0,002). Esta se midió usando el software Prism 6.0c la ejecución de un 2-manera prueba estadística ANOVA con prueba de comparación múltiple de Tukey (n = 8 renacuajos). Para tener la máximacantidad de puntos de datos antes de la cirugía, le sugerimos que utilice el ensayo de comportamiento de seis días. Si los resultados deben ser obtenidos más rápido con menos degeneración de los tejidos, le sugerimos que utilice el sistema de tres días.
Este ensayo pone a prueba un animal a la vez. Se realizaron estudios piloto para ver si dos renacuajos o más podrían ser medidos de forma simultánea. Para determinar si tener dos renacuajos en un tanque afectado su preferencia por el lado blanco del tanque, hemos probado cada renacuajo por separado y luego juntos. Dado que las imágenes fueron tomadas por encima del depósito, si los renacuajos nadando por encima o por debajo de otra por cualquier periodo de tiempo, nos pareció difícil distinguirlos. Si se utilizó renacuajos de diferentes tamaños, se observó que la mayor afectaría donde el uno nadaron más pequeño. Las tecnologías futuras se podrían desarrollar para renacuajos genéticamente marca, lo que permitiría un mejor seguimiento de varios animales del mismo tamaño.
En la realización de este ensayo en docenas de TADPOles, se observó que algunos renacuajos prefieren el lado blanco de manera más consistente que otras. Los renacuajos, cuyo comportamiento varía en más de un 10% en dos días consecutivos, se tomarían fueron probados de nuevo el tercer día antes de la cirugía. Esto puede haber sido debido a otra observación: nos dimos cuenta de que la colocación de los animales sobre un fondo blanco también hizo una diferencia en su preferencia por el lado blanco del tanque. Tener ese día extra puede haber ayudado a condicionar algunos renacuajos a preferir el lado blanco del tanque. Una limitación de este ensayo es que sólo se pone a prueba la función visual. La variabilidad se observó podría ser debido a otros defectos de desarrollo, además de reducción de la función visual o ceguera. Por esta razón, los animales que mostraron menos de 60% de preferencia antes de la cirugía no se probaron más.
También hemos probado un rango de edades de los renacuajos pre-metamórficas. Encontramos que los renacuajos menores de fase 45 eran muy pequeñas y sus ojos eran difíciles de seguir utilizando nuestro nosbcam. Renacuajos de Edad (etapas 51 - 55 +) fueron más distraído; a pesar de que en última instancia, pasaron más tiempo en el lado blanco de la cisterna, que parecen tomar más tiempo para nadar allí. Estos animales de más edad eran más grandes, y por lo tanto, más fácil de rastrear, pero necesitan una inspección previa a la cirugía como se ha indicado anteriormente. En contraste, la mayoría de los renacuajos en la etapa 45 hasta el 50 se comportó como se esperaba y los animales de estas edades sería mejor utilizar en futuros estudios.
Cambios de luz circadianos han sido demostrado que afectan a las respuestas de comportamiento guiado por visión en Xenopus 2. En consonancia con esta observación, nos dimos cuenta de que el mismo animal que nadó rápidamente hacia el lado blanco del tanque de prueba en los ensayos llevados a cabo en la mañana, tomó mucho más tiempo durante las pruebas de comportamiento de la tarde. Después de realizar una serie de «los mismos animales / tiempo diferentes" ensayos, se determinó el mejor momento para el ensayo de comportamiento era 06 a.m.-1 p.m..
También hemos utilizado un handh digitaleseld videocámara conectada por Firewire para poner a prueba los animales en condiciones de poca luz 5. Esta prueba permitido de la visión nocturna o escotópica, en el que el animal utiliza sus fotorreceptores de los bastones para ver. Condiciones fueron modificados por simplemente encontrar la menor cantidad de luz necesaria para el animal para realizar el ensayo guiado por visión. El ensayo que aquí se presenta pone a prueba la visión fotópica, en la que el animal utiliza principalmente sus fotorreceptores de los conos para ver. Mediante la combinación de estos enfoques, ambos tipos de visión, escotópica y fotópica, se pueden probar.
Se utilizó este ensayo para probar la función visual de animales con un ojo ectópico crecido a partir de células pluripotentes que sobreexpresan los factores de transcripción ojo de campo intrínsecamente expresadas y el factor extrínseco, Noggin. Ojos generados a partir de estos tejidos eran funcionales 4,11. Noggin también juega un papel en el desarrollo del sistema nervioso central anterior 12, pero utilizando este ensayo guiado por visión en conjunto con la TR casquillo animalensayo ansplant, se descubrió su papel en el desarrollo del ojo. Aún no se ha demostrado que otros factores extrínsecos que afectan a la formación del embrión temprano, pero que tienen un papel en el desarrollo del ojo puede inducida formación progenitoras de la retina en las células animales tapa pluripotentes 4,11. El uso de este ensayo de comportamiento, los estudios futuros podrían determinar la función visual de estos ojos recién generados.
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Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacionales de Salud: EY015748, EY017964 (MEZ), y EY019517 (ASV). Este trabajo también fue apoyado por la investigación para prevenir la ceguera sin restricciones de subvención al Departamento de Oftalmología y los Leones de la central de Nueva York. También nos gustaría dar las gracias a nuestro técnico en animales, Matthew Mellini, por su excelente cuidado de los animales y por intervenir para protagonizar un video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
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