Summary
Xenopus laevis girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco nero. Questo comportamento è guidato dalla loro visione. Sulla base di questo comportamento, vi presentiamo un semplice test per testare la funzione visiva dei girini.
Abstract
Misurazione della funzione visiva nei girini di rana, Xenopus laevis, consente lo screening per la cecità di animali vivi. La risposta optocinetico è una visione-based, un comportamento riflessivo che è stato osservato in tutti i vertebrati esaminati. Occhi girino sono piccole quindi la risposta vibrazione coda è stato usato come misura alternativa, che richiede un tecnico addestrato per registrare la risposta sottile. Abbiamo sviluppato un saggio comportamento alternativo basato sul fatto che girini preferiscono nuotare sul lato bianco di un serbatoio quando posto in una vasca con lati sia in bianco e nero. Il saggio qui presentato è un poco costoso, semplice alternativa che crea una risposta che può essere facilmente misurata. L'installazione consiste in un cavalletto, webcam e serbatoi di prova nidificati, facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Questo articolo include un filmato che mostra il comportamento dei girini, prima e dopo aver tagliato il nervo ottico. Al fine di testare la funzione di un occhio, includiamo anche rappresentantirisultati rappresentative di un girino in cui ogni occhio ha subito assotomia retinica in giorni consecutivi. Studi futuri potrebbero sviluppare una versione automatizzata di questo test per verificare la visione di molti girini in una volta.
Introduction
Xenopus laevis sono stati utilizzati come organismo modello per studiare la formazione dell'occhio. Gli occhi si sviluppano rapidamente, crescita verso la maturità in meno di una settimana per i geni di prova o percorsi che hanno un effetto sullo sviluppo visivo e la funzione. Per testare funzione visiva, la risposta optocinetico e optomotor è stato usato in zebrafish e girini Xenopus rispettivamente 1,2. Perché gli occhi dei girini di Xenopus sono relativamente più piccolo di zebrafish, questo test richiede l'uso di attrezzature specializzate e personale addestrato per rilevare la coda-flip e movimenti oculari comportamento sottile in Xenopus. Un comportamento più robusto in Xenopus è la preferenza per il nuoto in un serbatoio con uno sfondo bianco, che viene qui descritto 3. Quando si posiziona un girino in mezzo serbatoio nero / mezzo bianco, il girino pre-metamorfica nuota rapidamente al lato bianco del serbatoio. Abbiamo già usato questo test per determinare se pluripotenti cellule derivategli occhi erano funzionali 4. Qui riportiamo una versione dettagliata di questo saggio, che può essere utilizzato per testare la funzione visiva di premetamorphic girini Xenopus.
Questo test è più semplice del saggio risposta optomotor, dal momento che richiede solo una videocamera montata digitale, software fotocamera digitale e dotazione standard trovata nella maggior parte dei laboratori di Xenopus. Inoltre, la risposta registrata richiede alcuna formazione specifica ai risultati ottenuti. I nostri risultati rappresentativi mostrano che lo stesso gruppo di girini, che hanno subito doppio assotomia retinica, nuotano attorno al serbatoio. Abbiamo anche incluso i risultati del test comportamento di un girino rappresentante, mostrando come un occhio può essere testato per la risposta visiva. Un foglio di lavoro è stato incluso in modo che i numeri acquisiti durante il dosaggio possono essere inseriti e analizzati. Questo foglio può essere utilizzato per determinare se i girini testati hanno una risposta visiva.
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Protocol
Animal Care
Il Xenopus laevis girini utilizzati in questo studio sono stati coltivati, allevati e trattati secondo le procedure approvate dal Upstate Medical University IACUC e la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Impostazione Pre-comportamento: Girini
- Ottenere fecondati embrioni di Xenopus da una sorgente disponibile in commercio o in vitro fecondare ovociti, come descritto in precedenza 6.
- Posizionare blastula a neurali embrioni stadio piastra a 18 ˚ C in 60 millimetri piastre Petri contenenti 0,1 X. MMR [10 X Marc Modificato soluzione (MMR) stock Ringer (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2; 50 HEPES mM; 1 M NaCl, regolata a pH 7,5, autoclavato e conservati a RT)] con 50 ug / ml di gentamicina antibiotico. Cambiare 0,1 X. MMR ogni giorno e rimuovere eventuali embrioni morti.
- Una volta che gli embrioni raggiungono Nieuwkoop e Faber fase ~ 27-30 Luglio, passare the embrioni in 0,1 X. MMR senza antibiotico per permettere la crescita batterica intestinale.
- Crescere i girini fino a raggiungere lo stadio di alimentazione (fase 45) e spostarli in 100 millimetri piastre di Petri riempite con 0,1 X. MMR. Alimentarli ortica surnatante polvere ogni altro giorno per una settimana, cambiando il 0,1 X. MMR il giorno intermedio.
- Dopo una settimana in piatto 100 millimetri Petri, spostare gli animali per mezzo gallone vasche piene d'acqua rana [0.5 g / L oceano immediata e 2 mM sodio fosfato bibasico (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Dar loro da mangiare come al punto 2.4, ma cambiare l'acqua solo 2-3 volte a settimana quando l'acqua è torbida. Mantenere gli animali in una 12 ore light/12 ciclo di luce buio con le luci accendere alle 06:00.
- Posizionare il serbatoio mezzo gallone con i soggetti del test su una superficie bianca, come un underpad banco di laboratorio, almeno 12 ore O / N, prima del test.
- Girini di prova nelle fasi 45-50 come descritto nel passaggio 3 di seguito.
. 2 Setup Pre-comportamento: Equipment
- Mettere da parte una zona del laboratorio per il saggio comportamento. Dovrebbe essere in una tranquilla zona a traffico limitato con l'illuminazione fluorescente standard.
- Preparare le vasche di prova per gli animali.
I nidificate, serbatoi di test mezzo gallone sono composti da due parti: un serbatoio interno che conterrà l'acqua e girini; e un serbatoio esterno con stimolo visivo.- Per il serbatoio interno, fare un piccolo segno sugli angoli esterni con un pennarello, 5 cm dal fondo; questa è la linea di galleggiamento (Figura 1A, linea tratteggiata verde).
- Inoltre, per il serbatoio interno, riempire le divets nel serbatoio (agli angoli e al centro) con un composto inerte, come Sylgard elastomero. NOTA: I girini si soffermerà in queste aree se non vengono riempiti dentro
- Per il serbatoio esterno, coprire esattamente la metà della parte esterna di un serbatoio con nastro isolante nero e l'altra metà con il bianco fazzoletto di carta Figura 1B.
- Posizionare i carri armati sulinoculando giradischi.
- Setup la webcam / treppiede in modo che sia sopra le vasche di prova. Regolare la telecamera per permettere la visualizzazione della zona test, come mostrato nella Figura 1C.
- Collegare la webcam di un computer con software QuickTime Player installato 5. Accendere la fotocamera. In QuickTime Player, in File, selezionare 'Nuova registrazione filmato.' Il setup del test comportamento sarà visibile sul computer subito.
- Drappo un panno di cotone leggero su tutta la configurazione di ridurre stimoli esterni che potrebbero influenzare il comportamento girino, nonché, ridurre la luce riflessa sulla superficie dell'acqua.
- Assicurarsi che la luminanza nel quadro delle misure di stoffa tra 35-50 cd / m 2.
3. Assay Comportamento
- Riempire il serbatoio di test interno al segno cinque centimetri di acqua fatta al passo 1.2.1 con acqua rana.
- Usando una piccola rete, spostare delicatamente l'animale nel serbatoio testing interno.
- Aperto QuickTime software sul computer e, con il serbatoio esterno come una guida, assicurarsi che la fotocamera è in grado di visualizzare e registrare l'area di prova.
- Scrivere il nome dell'animale, la data e l'ora su un pezzo di carta e registrare con la macchina fotografica.
- Posizionare il serbatoio di prova nel serbatoio esterno con il lato nero del serbatoio a destra Figura 2.
- Avviare la registrazione del filmato subito dopo aver sistemato il serbatoio e impostare timer per 2 min.
- Quando i segnali acustici del timer, rimuovere il serbatoio di prova interno, ruotare il serbatoio esterno di 180 ° e posizionare il serbatoio di prova interno all'interno del serbatoio esterno. Avviare il timer. Nota: il lato nero dovrebbe essere sull'altro lato.
- Ripetere passo 3.7, più otto volte per un totale di dieci prove. Utilizzare la figura 2 come una guida, controllando fuori di ogni prova.
- Ripetere l'analisi condotta in due giorni separati.
4. Retinica assotomia
- Mettere animali a 0,02% tricaine fino a che non rispondonoad un pizzico di coda con un # 3 pinze.
- Sciogliere 1% agarosio in 0,1 X. MMR e quindi aggiungere ad una piastra di Petri 60 millimetri. Una volta raffreddato, fare un piccolo incavo rettangolare in agarosio e aggiungere il girino a incavo con un po '0,02% tricaine, in modo che l'animale è parzialmente immersa nel liquido.
- Ago nella pelle ad un angolo di 45 gradi dietro la regione dorsale dell'occhio con un ago 25 G, mentre il rinforzo animale contro pinza sul lato opposto.
- Facendo attenzione a non tagliare la vena, che si trova accanto al nervo ottico, raggiungono attenzione nel foro con # 5 pinze, tagliare il nervo ottico e capovolgere fuori strada. Se c'è sanguinamento grave a causa accidentalmente snipping l'arteria, quindi posizionare rapidamente l'animale in 2% tricaine di eutanasia. ATTENZIONE: Soluzione tricaine 2% può causare intorpidimento negli esseri umani. Questa soluzione deve essere maneggiato con i guanti.
- Per recuperare l'animale dopo l'intervento chirurgico, collocare animale da 100 mm piastra di Petri con 0,7 X MMR e gentamicina 50 mg / ml per 20 min. Next, trasferimento girino al serbatoio di recupero con acqua rana. Lasciate riposare animale O / N.
- La mattina successiva, testare la funzione visiva come descritto sopra (punti 3,1-3,9).
5. Analisi dei risultati
- Dopo le prove sono finite, misurare la quantità di tempo girino rimane sul lato nero del serbatoio.
- Visualizzare manualmente i video utilizzando un software che visualizza l'ora e permette frequenti pausa. Guardate il tempo di visualizzazione video. Annotare l'inizio della prova di due minuti, che è quando il recipiente interno nidi successo all'interno della vasca esterna e viene squadrato in vista della telecamera.
- Utilizzare la posizione degli occhi del girino per definire quale lato della vasca gli animali sono il nuoto su. Definire attraversando da un lato del serbatoio all'altro solo quando entrambi gli occhi hanno attraversato il / linea bianca nera.
- Annotare l'inizio e la fine di ciascun intervallo (in secondi) che l'animale trascorre sul lato nero. Pausa e riavvolgere il video per garantire la precisione. Il totale del sec all'interno di ogni prova.
- Ingresso questi numeri nel foglio di lavoro Behavior allegato. Il foglio calcola la proporzione di tempo che l'animale ha speso sul lato bianco sottraendo il tempo speso per il lato nero del serbatoio dal totale 120 prova sec e dividere per il tempo totale in sec [(120 - secondi totali spesi il lato nero) / 120 sec]. Le medie del foglio di lavoro questo rapporto su tutte le 10 prove.
- Usa T-test di uno studente, in coppia, distribuzione a due code per determinare se le prove tra le giornate sono significative (P ≤ 0,05).
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Representative Results
I rapporti precedenti hanno dimostrato che premetamorphic girini Xenopus preferiscono nuotare sul lato bianco di un / serbatoio bianco e nero chiamato questo test, sullo sfondo Preferenza colore Assay 3 Abbiamo modificato questo test per testare la funzione visiva di entrambi gli occhi di girini in meno di una settimana. In questo modo, i loro occhi possono essere raccolti per l'esame istologico.
Mostriamo qui come la risposta è dovuta a stimoli visivi. In Movie 1, i girini nei pannelli sinistro e destro sono gli stessi animali. Sulla sinistra sono gli animali prima della chirurgia e sulla destra, gli animali dopo aver tagliato entrambi i nervi ottici. Abbiamo roteato l'acqua per dimostrare che nulla viene aggiunto a respingere gli animali dal lato nero o attirarli verso il lato bianco. Nel film, forniamo una schematica dei girini negli angoli inferiori, che mostra lo stato del nervo ottico per ogni gruppo di animali. In Movie 1, il normale, ugirini n-operati rispondono al colore di sfondo in meno di 30 secondi in vasca prova, mentre i girini ciechi nuotare senza meta attorno al serbatoio. La velocità dei film è stata aumentata e il tempo effettivo registrato nell'angolo superiore destro.
Per testare la visione di un occhio, abbiamo incluso i risultati di un animale il cui nervo ottico è reciso in un occhio e testato nel nostro test. Il nervo ottico nell'altro occhio è stato reciso, dopo due giorni di test, e il comportamento di visione guidata testato nei giorni seguenti di nuovo. In Figura 3, un grafico mostra la quantità di tempo che il girino scelto di nuotare sul lato nero del serbatoio. Questo è stato determinato per sei giorni consecutivi Figura 3A. Come descritto sopra, il nervo ottico è stato reciso destra dopo comportamento è stato testato su giorno 2 e sinistra, dopo prova di comportamento al giorno 4. L'girino preferito il lato bianco del serbatoio in modo casuale al 50% della Figura 3C tempo. Si noti che l'unaimal trascorso più tempo sul lato bianco del serbatoio durante gli ultimi 6 prove nei giorni da 1 a 4. La quantità di tempo speso per il lato nero era più anche nei giorni 5 e 6, quando l'animale era cieco da entrambi gli occhi. I risultati di ciascuno dei due giorni sono stati mediati insieme e presentati in forma grafica Figura 3C.
Figura 1. Set-up sperimentale della visione guidata test comportamento. (A) Il serbatoio di prova interno rimane trasparente ed è contrassegnato per indicare i livelli di acqua (linee verdi in un angolo tratteggiato). (B) Il serbatoio di prova esterno è rivestito in nero nastro elettrico su una metà e tessuto carta bianca dall'altro. (C) I girini vengono visualizzati utilizzando una webcam posta su un treppiede e collegato a un computer portatile. Il serbatoio tests riposo su un giradischi inoculazione per consentire un facile svolta tra prove. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Schema di come viene eseguito il test comportamento visione-guida. I rettangoli rappresentano il serbatoio di prova, mostrando come il semestre bianco / mezzo cambiamenti zona nera con ogni prova. Questo può essere usato durante il saggio comportamento per contrassegnare il numero di prova. Il serbatoio di prova sulla destra è un primo piano del girino e il suo comportamento previsto durante i due minuti dosaggio. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Un esperimento rappresentativo conteggio la percentuale di tempo nuotavano girino sul lato bianco del serbatoio di prova. (A) La quantità di sec girino trascorso sul lato nero del serbatoio è misurata e posizionato in una tabella. (B ) La tabella A viene convertito nella percentuale di tempo trascorso del lato bianco del serbatoio. Questo viene fatto sottraendo il sec trascorso sul lato nero dal tempo di prova totale (120 sec) e dividendo per 120 sec. Girini che sono stati trattati (U), ha avuto un unico assotomia (SA) e poi un doppio assotomia (DA) sono stati testati. (C) Il grafico rappresenta la percentuale media di tempo trascorso nel lato bianco (barra bianca) e lato nero ( barra nera). Di seguito si riporta la tabella utilizzata per fare il grafico.g3highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1. Risposta comportamentale degli animali vedenti e non vedenti sullo sfondo bianco preferenza saggio. Girini nei pannelli destra e sinistra sono la stessa cosa, ma quelli a destra sono stati sottoposti a doppia assotomia retina. Uno schema negli angoli in basso indica se il nervo ottico è integro o tagliato (barra blu). Il timer in alto a destra indica il tempo. Il film è accelerato per facilitare la visione. Una volta nell'area bianca, notate come i girini nuotano vicino al confine tra la direzione bianco e il nero e retromarcia. Cliccate qui per vedere il video.
| Day 1 | Day 2 | Day 3 | Giorno 4 | Day 5 | Giorno 6 | |
| Prova 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Trial 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Trial 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Rapporto tra tempo speso sul lato bianco | ||||||
| Ratio 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto di 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Rapporto 10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Media | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1.00|
| Giorno 1 | Day 2 | Day 3 | Giorno 4 | Day 5 | Giorno 6 | |
| Prova 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Trial 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Trial 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Trial 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Trial 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Trial 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Trial 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Trial 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Trial 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Trial 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Rapporto tra tempo speso sul lato bianco > | ||||||
| Ratio 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Rapporto 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Rapporto 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Ratio 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Rapporto 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Rapporto 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Rapporto 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Rapporto 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Rapporto 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Media | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Foglio di lavoro 1. Sfondo bianco preferenza foglio di dosaggio. Questo foglio ha i calcoli costruiti in modo che possa essere utilizzato per immettere numeri e risultati del conteggio.
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Discussion
Riportiamo qui un semplice test comportamentale visione-guida che può essere facilmente eseguita in meno di una settimana da personale di laboratorio minimamente addestrato. Mentre altri test richiedono attrezzature specializzate e competenze in comportamento animale, questo test permette un rapido test per determinare la funzione visiva. Un altro test comportamentale, il saggio evitare di Visual, è stato sviluppato per determinare come la Tectum contribuisce alla percezione visiva in Xenopus 10. Questo saggio misura sintonizzazione spaziale e sensibilità al contrasto in risposta ad un movimento contro sfondo stabile, e quindi, in grado di misurare il comportamento di visione basato più specializzato del semplice test riportati qui. Un sistema automatizzato comportamento è stato segnalato in grado di misurare la quantità di tempo trascorso su un lato del serbatoio 8. C'è anche un software disponibile in commercio (ad esempio software QUALSIASI-labirinto) che è stato usato per misurare la quantità di tempo zebrafish trascorrere in ambienti scuri o luminosi 9. L'unassay riportiamo qui non richiede l'acquisto di questi tipi di attrezzature costose o software, ma invece si basa su reagenti e apparecchiature di uso quotidiano per misurare la funzione visiva.
Il saggio visione guidata viene eseguita su un solo animale per testare la sua funzione visiva. Quando si confrontano i risultati del test comportamentali di girini diversi tra loro, abbiamo osservato alcuna differenza statistica tra animali entro gruppi di trattamento. Abbiamo testato tre girini in sei giorni consecutivi e testato anche altri cinque animali per tre giorni consecutivi, l'esecuzione di dieci prove al giorno. In entrambi i casi, abbiamo riscontrato cambiamenti statisticamente significative tra i gruppi assotomia non trattati o singoli (P = 0,2067), ma ottenuto un cambiamento statisticamente significativo quando questi animali sono stati confrontati con il gruppo doppia assotomia (P = 0,002). Questo è stato misurato utilizzando il software 6.0c Prism esecuzione di un test statistico ANOVA a 2 vie con test di confronto multiplo di un Tukey (n = 8 girini). Per avere il massimoquantità di punti dati prima dell'intervento chirurgico, si consiglia di utilizzare il saggio comportamento di sei giorni. Se devono essere ottenuti più veloce con meno degenerazione del tessuto risultati, si consiglia di utilizzare il sistema di tre giorni.
Questo test verifica un animale per volta. Abbiamo eseguito studi pilota per verificare se due girini o più potrebbero essere misurate simultaneamente. Per determinare se avere due girini in un serbatoio influenzata loro preferenza per il lato bianco del serbatoio, abbiamo testato ogni girino separatamente e poi insieme. Dal momento che le immagini sono state scattate sopra il serbatoio, se i girini nuotavano sopra o sotto l'altro per un certo periodo di tempo, abbiamo trovato difficile distinguerli. Se abbiamo usato girini di varie dimensioni, abbiamo osservato che quello più grande inciderebbe in cui il più piccolo nuotato. Le tecnologie del futuro potrebbero essere sviluppati per girini geneticamente marchio, che consentirebbero una migliore tracciabilità dei più animali della stessa dimensione.
In esecuzione di questo test su decine di tadpoles, abbiamo osservato che alcuni girini hanno preferito il lato bianco più coerente rispetto ad altri. Girini, il cui comportamento varia di oltre il 10% in due giorni consecutivi, prenderemmo stati testati nuovamente su un terzo giorno prima dell'intervento. Questo può essere stato a causa di un'altra osservazione: abbiamo notato che mettendo gli animali su uno sfondo bianco anche fatto la differenza nella loro preferenza per il lato bianco del serbatoio. Avere quel giorno in più può aver contribuito a condizionare alcuni girini a preferire il lato bianco del serbatoio. Una limitazione di questo saggio è che esso verifica solo funzione visiva. La variabilità abbiamo osservato potrebbe essere dovuto ad altri difetti di sviluppo, oltre a una ridotta funzionalità visiva o cecità. Per questo motivo, gli animali che mostravano meno del 60% preferenza prima dell'intervento non sono stati testati ulteriormente.
Abbiamo anche testato una vasta gamma di età compresa tra i girini pre-metamorfiche. Abbiamo scoperto che i girini più giovani di fase a 45 erano molto piccole ei loro occhi erano difficili da individuare utilizzando il nostro noiBCAM. Girini Anziani (palchi 51-55 +) erano più distratto; anche se in ultima analisi, trascorso più tempo sul lato bianco del serbatoio, sembrano richiedere più tempo per nuotare. Questi animali più vecchi erano più grandi, e quindi più facile da monitorare, ma necessari test prima dell'intervento come indicato sopra. Al contrario, la maggior parte dei girini nella fase 45 fino a 50 comportava come previsto e animali di queste età sarebbe meglio utilizzare in studi futuri.
Cambiamenti di luce circadiani hanno dimostrato di influenzare le risposte comportamentali visione guidata in Xenopus 2. Coerentemente con questa osservazione, abbiamo notato che lo stesso animale che nuotava rapidamente verso il lato bianco del serbatoio di prova in prove condotte in mattinata, ha preso molto più tempo durante le prove di comportamento pomeriggio. Dopo aver condotto una serie di prove «stessi animali / tempo diverso ', abbiamo determinato il momento migliore per il saggio comportamento era 06:00-13:00.
Abbiamo usato anche un Handh digitaleeld videocamera collegata da firewire per testare animali in condizioni di scarsa illuminazione 5. Questo ha permesso la sperimentazione di visione notturna o scotopica, in cui l'animale utilizza i bastoncelli vedere. Condizioni sono stati modificati semplicemente trovando la minor quantità di luce necessaria per l'animale per eseguire il test di visione guidata. Il saggio qui presentato test di visione fotopica, in cui l'animale utilizza principalmente suoi fotorecettori cono di vedere. Combinando questi approcci, entrambi i tipi di visione scotopica e fotopica, possono essere testati.
Abbiamo usato questo test per testare la funzione visiva degli animali con un occhio ectopica cresciuto da cellule pluripotenti che iperesprimono i fattori di eye campo di trascrizione intrinsecamente espresse e il fattore estrinseco, Noggin. Occhi generati da questi tessuti erano funzionali 4,11. Noggin gioca anche un ruolo nella anterior sviluppo del sistema nervoso centrale 12 ma da questo test visione guidata in combinazione con tr tappo animaletest ansplant, il suo ruolo nello sviluppo dell'occhio è stato scoperto. Altri fattori estrinseci che influenzano la formazione dell'embrione precoce, ma non hanno ancora dimostrato di avere un ruolo nello sviluppo dell'occhio può indotto la formazione di cellule progenitrici della retina in cellule pluripotenti protezione degli animali 4,11. Da questo test comportamentale, studi futuri potrebbero determinare la funzione visiva di questi occhi appena generati.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health: EY015748, EY017964 (MEZ), e EY019517 (ASV). Questo lavoro è stato supportato anche dalla ricerca per la prevenzione cecità illimitato Sovvenzione al reparto di Oculistica ed i Lions di Central New York. Vorremmo anche ringraziare il nostro tecnico animali, Matteo Mellini, per la sua eccellente cura degli animali e intervenendo per recitare in questo video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
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