Summary
Têtards de Xenopus laevis préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir noir / blanc. Ce comportement est guidé par la vision. Sur la base de ce comportement, nous présentons un test simple pour tester la fonction visuelle des têtards.
Abstract
Mesure de la fonction visuelle chez les têtards de la grenouille Xenopus laevis, permet le dépistage de la cécité chez les animaux vivants. La réponse optocinétique est un comportement réfléchi basé sur la vision qui a été observée chez tous les vertébrés testés. Tadpole yeux sont petits, la réponse queue de bascule a été utilisé comme mesure de rechange, ce qui nécessite un technicien qualifié pour enregistrer la réponse subtile. Nous avons développé un test de comportement alternatif basé sur le fait que les têtards préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir lorsqu'il est placé dans une cuve avec des côtés à la fois en noir et blanc. L'analyse présentée ici est une alternative simple peu coûteux qui crée une réponse qui est facilement mesurable. L'installation se compose d'un trépied, d'une webcam et bacs de test imbriqués, facilement disponibles dans la plupart des laboratoires de Xenopus. Cet article comprend un film montrant le comportement des têtards, avant et après le sectionnement du nerf optique. Afin de tester la fonction d'un oeil, on inclut également reprérésultats représentatifs d'un têtard dans lequel chaque œil a subi axotomy rétinienne sur plusieurs jours consécutifs. Les études futures pourraient développer une version automatisée de ce test pour tester la vision de nombreux têtards à la fois.
Introduction
Xenopus laevis ont été utilisés comme un organisme modèle pour étudier la formation des yeux. Les yeux se développent rapidement, de plus en plus de maturité dans moins d'une semaine des gènes ou des voies d'essai qui ont un effet sur le développement et la fonction visuelle. Pour tester la fonction visuelle, la réponse optocinétique et optomoteur a été utilisée dans le poisson-zèbre et les têtards de Xenopus, respectivement 1,2. Parce que les yeux de têtards de Xenopus sont relativement plus petit que le poisson-zèbre, ce test nécessite l'utilisation d'équipement spécialisé et de personnel qualifié pour détecter le comportement subtil queue-flip et mouvements oculaires chez Xenopus. Un comportement plus robuste chez Xenopus est la préférence pour la natation dans un réservoir avec un fond blanc, ce qui est décrit ici 3. Lorsque vous placez un têtard dans un réservoir à moitié noir / moitié blanc, le têtard pré-métamorphique nage rapidement sur le côté blanc de la cuve. Nous avons déjà utilisé ce test pour déterminer si pluripotentes dérivé des cellulesyeux étaient fonctionnels 4. Nous rapportons ici une version détaillée de ce test, qui peut être utilisé pour tester la fonction visuelle des têtards de Xenopus prémétamorphique.
Ce test est plus simple que le test de réponse optomoteur, car il ne nécessite un caméscope monté numérique, logiciel d'appareil photo numérique et un équipement standard dans la plupart des laboratoires de Xenopus. En outre, la réponse enregistrée ne nécessite aucune formation particulière aux résultats de pointage. Nos résultats représentatifs montrent que le même groupe de têtards, ayant subi deux axotomy rétinienne, nagent aléatoirement autour du réservoir. Nous avons également inclus les résultats d'analyse du comportement d'un têtard représentant, en montrant comment un oeil peut être testé pour la réponse visuelle. Une feuille de calcul a été inclus afin que les numéros acquises au cours de l'essai peuvent être insérés et analysés. Cette feuille peut être utilisée pour déterminer si les têtards testés ont une réponse visuelle.
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Protocol
Protection des animaux
Le têtards de Xenopus laevis utilisées dans cette étude ont été cultivés, élevés et traités conformément aux procédures approuvées par Upstate Medical University IACUC et le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire.
. 1 Configuration Pré-comportement: têtards
- Obtenir des embryons de xénope fécondés provenant d'une source disponible dans le commerce ou in vitro féconder les ovocytes, comme décrit précédemment 6.
- Placez blastula des embryons de neurones de la scène de la plaque à 18 ˚ C en 60 mm boîtes de Pétri contenant 0,1 X MMR [10 modifié (ROR) solution mère de Ringer X Marc (10 mM MgCl 2, 20 mM de KCl, 20 mM de CaCl2; HEPES 50 mM; NaCl 1 M; ajusté à pH 7,5, passé à l'autoclave à température ambiante et stockées)] avec 50 ug / ml de l'antibiotique gentamicine. Changez 0,1 X MMR chaque jour et éliminer les embryons morts.
- Une fois les embryons atteignent Nieuwkoop et Faber stade ~ 27 au 30 juillet, passer èmee embryons dans 0,1 X MMR sans antibiotique pour permettre la croissance bactérienne de l'intestin.
- Cultiver les têtards jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade d'alimentation (étape 45) et déplacez-les dans des boîtes de Pétri de 100 mm remplis de 0,1 X MMR. Les nourrir ortie poudre surnageant chaque jour pendant une semaine, en changeant le 0,1 X MMR le jour intervenir.
- Après une semaine dans le plat 100 mm Petri, déplacer les animaux de la moitié des réservoirs de gallons remplis d'eau de grenouille [0,5 g / L océan instantanée et 2 mM de phosphate de sodium dibasique (Na 2 HPO 4: mw 141,96) pH 6,8]. Nourrissez-les comme dans l'étape 2.4, mais changer l'eau seulement 2-3 fois par semaine lorsque l'eau est trouble. Maintenir les animaux dans un cycle lumière obscurité de 12 h de lumière/12 avec les lumières allumer à 6 heures.
- Placez le réservoir demi-gallon avec les sujets de test sur une surface blanche, comme un sous-tapis de paillasse, au moins 12 heures O / N, avant le test.
- têtards d'essai aux stades 45 à 50 comme décrit dans l'étape 3 ci-dessous.
. 2 Configuration Pré-comportement: Equipment
- Mettez de côté une zone de laboratoire pour l'analyse du comportement. Il devrait être dans un quartier calme à faible trafic avec l'éclairage fluorescent standard.
- Préparer les bacs de test pour les animaux.
Les bacs de test, un demi-gallon imbriqués sont composées de deux parties: un réservoir interne qui contiendra l'eau et têtards; et un réservoir externe avec le stimulus visuel.- Pour le réservoir interne, faire une petite marque sur les coins extérieurs avec un feutre, 5 cm du fond; il s'agit de la ligne d'eau (figure 1A, la ligne pointillée verte).
- Aussi, pour le réservoir intérieur, remplir les divets dans le réservoir (dans les coins et au centre) avec un composé inerte, comme Sylgard élastomère. NOTE: Les têtards s'attarder dans ces domaines si elles ne sont pas remplis po
- Pour le réservoir externe, couvrir exactement la moitié de l'extérieur d'un réservoir avec du ruban électrique noir et l'autre moitié avec le tissu blanc papier Figure 1B.
- Placez les réservoirs sur leinoculation platine.
- Configuration de la webcam / trépied afin qu'il soit au-dessus des bacs de test. Régler la caméra pour permettre la visualisation de la zone d'essai, comme le montre la figure 1C.
- Connectez la webcam à un ordinateur avec le logiciel QuickTime Player installé 5. Allumez l'appareil photo. Dans QuickTime Player, sous Fichier, sélectionnez "Nouvel enregistrement de séquence. La configuration de test de comportement sera visible sur l'ordinateur tout de suite.
- Drapé d'un chiffon de coton léger sur l'ensemble de la configuration pour réduire indices externes qui pourraient influer sur le comportement des têtards, ainsi que, de réduire la lumière réfléchie sur la surface de l'eau.
- Veiller à ce que la luminance au titre des mesures de tissu entre 35-50 cd / m 2.
3. Comportement Assay
- Remplir le réservoir de test interne pour la marque de 5 cm d'eau fait dans l'étape 1.2.1 avec de l'eau de grenouille.
- L'utilisation d'un petit filet, déplacez doucement l'animal dans le réservoir de test interne.
- Ouvrir QuickTime logiciel sur ordinateur et, à l'aide du réservoir externe comme un guide, assurez-vous que l'appareil est en mesure de visualiser et d'enregistrer la zone de test.
- Écrivez le nom de l'animal, la date et l'heure sur un morceau de papier et d'enregistrer avec la caméra.
- Placez le réservoir de test dans le réservoir extérieur, le côté noir du réservoir vers la droite Figure 2.
- Commencer à enregistrer le film immédiatement après l'organisation du réservoir et réglez la minuterie pendant 2 min.
- Quand le minuteur sonne, retirer le réservoir de test interne, tourner le réservoir externe de 180 ° et placez le réservoir de test interne à l'intérieur du réservoir externe. Démarrer la minuterie. Remarque: le côté noir devrait maintenant être de l'autre côté.
- Répétez l'étape 3.7, huit fois plus pour un total de dix essais. Utilisez la figure 2 comme un guide, en cochant chaque essai.
- Répétez le test de comportement sur deux jours différents.
4. Rétinienne axotomie
- Placez l'animal dans 0,02% tricaine jusqu'à ce qu'ils ne répondent pasà une pincée de queue avec un # 3 forceps.
- Faire fondre 1% d'agarose dans 0,1 X MMR puis ajouter à une boîte de Pétri de 60 mm. Une fois refroidie, une petite motte de terre rectangulaire dans l'agarose et ajouter le têtard de la motte de terre avec un peu de tricaïne 0,02%, de sorte que l'animal est partiellement immergé dans le liquide.
- Pierce la peau à un angle de 45 degrés derrière la région dorsale de l'oeil avec une aiguille 25 G, tout en s'agrippant de l'animal contre la pince sur le côté opposé.
- Prendre soin de ne pas couper la veine, qui se trouve à côté du nerf optique, atteindre soigneusement dans le trou avec # 5 pinces, couper le nerf optique et le retourner à l'écart. Si il ya une hémorragie sévère en raison de la biopsie accidentellement l'artère, puis placer rapidement l'animal dans 2% tricaïne à euthanasier. ATTENTION: solution de tricaine 2% peut provoquer un engourdissement dans les humains. Cette solution doit être manipulé avec des gants.
- Pour récupérer l'animal après la chirurgie, placer l'animal dans 100 mm boîte de Petri avec 0.7X ROR et 50 pg / ml de gentamicine pendant 20 min. Next, transfert têtard à la cuve de récupération d'eau de grenouille. Laisser reposer animale O / N.
- Le lendemain matin, tester la fonction visuelle comme décrit ci-dessus (étapes 3.1 à 3.9).
5. Analyser les résultats
- Après les essais sont terminés, mesurer la quantité de temps le têtard reste sur le côté noir de la cuve.
- Voir manuellement les vidéos en utilisant un logiciel qui affiche l'heure et permet des pauses fréquentes. Regardez le temps d'affichage de la vidéo. Notez le début du procès de deux minutes, ce qui est quand le réservoir interne niche avec succès à l'intérieur du réservoir externe et est carré en vue de la caméra.
- Utilisez la position des yeux du têtard à définir de quel côté de la cuve les animaux nagent sur. Définir la traversée d'un côté de la cuve à l'autre que lorsque les deux yeux ont franchi la ligne noir / blanc.
- Notez le début et la fin de chaque intervalle (en secondes) que l'animal passe sur le côté noir. Faites une pause et reenrouler la vidéo pour assurer l'exactitude. Additionner le sec dans chaque essai.
- Entrée ces nombres dans la feuille de calcul du comportement joint. La feuille de calcul calcule le rapport entre le temps que l'animal a passé sur le côté blanc en soustrayant le temps passé sur le côté noir de la cuve de l'essai sec 120 au total et le diviser par le temps total en secondes [(120 - nombre total de secondes consacrées à le côté noir) / 120 sec]. Les moyennes de feuille de calcul de ce ratio sur l'ensemble des 10 essais.
- Utilisez le T-test de Student, jumelé, distribution bilatérale afin de déterminer si les essais entre les jours sont significatives (P ≤ 0,05).
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Representative Results
Les rapports précédents ont montré que les têtards de Xenopus prémétamorphique préfèrent nager sur le côté blanc d'un réservoir noir / blanc et a appelé cet essai, l'arrière-plan de couleur préférée de dosage 3 Nous avons changé ce test afin de tester la fonction visuelle des deux yeux de têtards dans moins d'une semaine. De cette manière, les yeux peuvent être collectées pour un examen histologique.
Nous montrons ici comment la réponse est due à des indices visuels. Dans le film 1, les têtards dans les panneaux gauche et droit sont les mêmes animaux. Sur la gauche sont les animaux avant l'opération et sur le droit, les animaux après séparation des deux nerfs optiques. Nous tourbillonnait l'eau pour montrer que rien n'est ajouté à repousser les animaux du côté noir ou les attirer vers le côté blanc. Dans le film, nous fournissons un schéma des têtards dans les coins inférieurs, ce qui indique l'état du nerf optique pour chaque lot d'animaux. Dans le film 1, la normale, utêtards n-exploités réagissent à la couleur de fond en moins de 30 secondes dans le réservoir d'essai tandis que les têtards morts nagent sans but autour du réservoir. La vitesse des films a été augmenté et le temps réel enregistré dans le coin supérieur droit.
Pour tester la vision d'un œil, nous avons inclus les résultats d'un animal dont le nerf optique a été sectionné dans un oeil et testé dans notre test. Le nerf optique dans l'autre œil a été rompu après deux jours d'essais, et le comportement guidé par la vision testé les jours suivants à nouveau. Dans la figure 3, un graphique montre la quantité de temps le têtard a choisi de nager sur le côté noir de la cuve. Cela a été mesurée sur six jours consécutifs figure 3A. Comme décrit ci-dessus, le nerf optique droit a été sectionné après le comportement a été testé sur 2 jours et la gauche, après l'essai de comportement au jour 4. L'têtard préfère le côté blanc du réservoir de façon aléatoire à 50% du temps la figure 3C. Notez que l'uniMAL a passé plus de temps sur le côté blanc du réservoir au cours des 6 derniers essais, les jours 1 à 4. La quantité de temps passé sur le côté noir était plus même aux jours 5 et 6, lorsque l'animal était aveugle des deux yeux. Les résultats de chacune des deux journées ont été moyennées et présentées sous une forme graphique figure 3C.
Figure 1. Expérimental de test de comportement guidé par la vision. (A) Le réservoir de test interne reste transparent et est marqué pour indiquer les niveaux d'eau (tirets verts dans le coin). (B) Le réservoir de test externe est recouverte en noir ruban électrique sur une moitié et le tissu papier blanc sur l'autre. (C) Les têtards sont visualisés à l'aide d'une webcam placée sur un trépied et reliée à un ordinateur portable. Le réservoir d'essaiss reste sur un plateau inoculation pour permettre la rotation facile entre les essais. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Schéma de la façon dont le test de comportement guidé par la vision est effectuée. Les rectangles représentent le réservoir d'essai, montrant comment la moitié blanc / noir demi région change à chaque essai. Ceci peut être utilisé pendant le test de comportement pour marquer le nombre de procès. Le réservoir d'essai sur la droite est un gros plan du têtard et son comportement attendu lors de l'essai de deux minutes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Une expérience représentative compter le pourcentage de temps de nage des têtards sur le côté blanc de la cuve d'essai. (A) Le montant de sec le têtard passé sur le côté noir du réservoir est mesuré et placé dans une table. (B ) Le tableau de l'A est converti en un pourcentage de temps passé de la partie blanche de la cuve. Cela se fait en soustrayant la seconde passé sur le côté noir du temps d'essai totale (120 s) et en divisant par 120 sec. Les têtards qui étaient non traitée (U), avaient un seul axotomie (SA), puis une double axotomie (DA) ont été testés. (C) Le graphique représente le pourcentage moyen de temps passé dans le côté blanc (barre blanche) et le côté noir ( barre noire). Le tableau utilisé pour rendre le graphique est illustré ci-dessous.g3highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. Réponse comportementale des animaux voyants et aveugles dans le blanc test de préférence de fond. Têtards dans les panneaux gauche et droit sont les mêmes, mais celles sur le droit ont subi deux axotomie de la rétine. Un schéma dans les coins inférieurs indique si le nerf optique est intacte ou séparée (barre bleue). La minuterie dans le coin supérieur droit indique l'heure. Le film est accéléré pour faciliter la visualisation. Une fois dans la zone blanche, remarquez comment les têtards nagent près de la frontière entre la direction blanc et noir et inverse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
| Day 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | Jour 5 | Jour 6 | |
| Essai 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ Td> | 0 |
| Essai de 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai de 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Essai 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Ratio de temps passé sur le côté blanc | ||||||
| Ratio 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Ratio 10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| Moyenne | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <td> 1,00|
| Jour 1 | Jour 2 | Jour 3 | Jour 4 | Jour 5 | Jour 6 | |
| Essai 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| Essai 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| Essai 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| Essai 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| Essai 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| Essai de 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| Essai de 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| Essai 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| Essai 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| Essai 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| Ratio de temps passé sur le côté blanc > | ||||||
| Ratio 1 | 100% | 100% | 100% | 100% | 43% | 43% |
| Ratio 2 | 100% | 98% | 100% | 27% | 43% | 52% |
| Ratio 3 | 94% | 100% | 77% | 100% | 52% | 61% |
| Ratio 4 | 100% | 100% | 91% | 100% | 51% | 40% |
| Ratio 5 | 100% | 100% | 94% | 82% | 53% | 53% |
| 99% | 18% | 97% | 53% | 43% | 56% | |
| Ratio 7 | 100% | 89% | 73% | 80% | 63% | 53% |
| Ratio 8 | 100% | 6% | 68% | 80% | 70% | 47% |
| Ratio 9 | 100% | 100% | 97% | 64% | 50% | 53% |
| Ratio 10 | 99% | 83% | 100% | 73% | 48% | 33% |
| Moyenne | 99% | 79% | 90% | 76% | 51% | 49% |
Feuille de travail 1. Fond blanc préférence dosage feuille de calcul. Cette feuille de calcul comporte les calculs intégrés dans de sorte qu'il peut être utilisé pour saisir des chiffres et des résultats de pointage.
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Discussion
Nous rapportons ici un test de comportement guidé par la vision simple qui peut être facilement réalisée en moins d'une semaine par le personnel de laboratoire une formation minimale. Alors que d'autres tests nécessitent un équipement spécialisé et de l'expertise en comportement animal, ce test permet un test rapide pour déterminer la fonction visuelle. Un autre essai de comportement, le test d'évitement visuel, a été développé pour déterminer comment le tectum contribue à la perception visuelle chez Xenopus 10. Ce test mesure le réglage spatiale et la sensibilité au contraste en réponse à un mouvement contre fond stable, et donc, peut mesurer le comportement en fonction de la vision plus spécialisé que le test simple signalés ici. Un système de conduite automatisée a été rapporté qui peut mesurer la quantité de temps passé sur un côté de la cuve 8. Il existe également des logiciels disponibles dans le commerce (par exemple les logiciels TOUT labyrinthe) qui a été utilisé pour mesurer la quantité de poisson zèbre de temps passé dans des environnements sombres ou lumineux 9. L'unéssayé nous présentons ici ne nécessite pas l'achat de ces types d'équipements ou de logiciels coûteux, mais repose plutôt sur des réactifs et de l'équipement de tous les jours pour mesurer la fonction visuelle.
Le test de vision à guidage est réalisée sur un animal pour tester la fonction visuelle. Lorsque l'on compare les résultats d'analyse du comportement de plusieurs têtards à l'autre, nous n'avons observé aucune différence statistiquement significative entre les animaux au sein des groupes de traitement. Nous avons testé trois têtards sur six jours consécutifs et également testé cinq animaux sur trois jours consécutifs, courir dix essais par jour. Dans les deux cas, nous n'avons trouvé aucun changement statistiquement significatives entre les groupes de axotomie non traitées ou simples (P = 0,2067), mais obtenu un changement statistiquement significatif lorsque ces animaux ont été comparés au groupe double axotomie (P = 0,002). Cela a été mesurée en utilisant un logiciel de 6.0c Prism l'exécution d'un test statistique ANOVA à 2 voies avec un test de comparaison multiple de Tukey (n = 8 têtards). Pour avoir le maximumnombre de points de données avant la chirurgie, nous vous conseillons d'utiliser le test de comportement de six jours. Si les résultats doivent être obtenus plus rapidement avec moins de dégénérescence du tissu, nous vous conseillons d'utiliser le système de trois jours.
Cet essai teste un seul animal à la fois. Nous avons effectué des études pilotes pour voir si deux têtards ou plus pourraient être mesurés simultanément. Pour déterminer si avoir deux têtards dans un réservoir affecté leur préférence pour le côté blanc du réservoir, nous avons testé chaque têtard séparément, puis ensemble. Depuis les images ont été prises au-dessus du réservoir, si les têtards ont nagé au-dessus ou en dessous de l'autre, pour toute longueur de temps, nous avons constaté qu'il est difficile de les distinguer. Si nous utilisions les têtards de différentes tailles, nous avons observé que la plus grande affecterait où le plus petit nagé. Technologies futures pourraient être développés pour les têtards génétiquement marque, ce qui permettrait un meilleur suivi de plusieurs animaux de la même taille.
Dans l'exécution de ce test sur des dizaines de tadpoles, nous avons observé que certains têtards préfèrent le côté blanc de manière plus cohérente que d'autres. Têtards, dont le comportement varie de plus de 10% sur deux jours consécutifs, nous prendraient ont été testés à nouveau sur un troisième jour avant la chirurgie. C'est peut-être parce que d'une autre observation: nous avons remarqué que de placer les animaux sur un fond blanc a également fait une différence dans leur préférence pour le côté blanc de la cuve. Ayant cette journée supplémentaire pourrait avoir contribué conditionner certains têtards à préférer le côté blanc de la cuve. Une limitation de ce test est qu'il ne teste que la fonction visuelle. La variabilité, nous avons observé pourrait être dû à d'autres défauts de développement, outre la fonction ou la cécité visuelle réduite. Pour cette raison, les animaux ont montré que moins de 60% de préférence avant l'opération n'ont pas été testées en outre.
Nous avons également testé une gamme d'âges de têtards pré-métamorphiques. Nous avons constaté que les têtards de moins de 45 étapes étaient très petites et leurs yeux étaient difficiles à suivre en utilisant notre nousACSM. Têtards âgés (stades 51 - 55 +) sont plus distraits; mais ils ont finalement passé plus de temps sur le côté blanc de la citerne, ils semblent prendre plus de temps pour y nager. Ces animaux plus âgés étaient plus gros, et donc plus facile à suivre, mais nécessaires tester avant la chirurgie comme indiqué ci-dessus. En revanche, la majorité des têtards au stade 45 à 50 se comportait comme prévu et les animaux de ces âges serait préférable d'utiliser dans de futures études.
Changements circadiens de la lumière ont été montré pour influer sur les réponses comportementales vision guidée dans Xenopus 2. En accord avec cette observation, nous avons remarqué que le même animal que rapidement nagé sur le côté blanc de la cuve d'essai lors d'essais conduits dans la matinée, a pris beaucoup plus de temps lors des essais de comportement de l'après-midi. Après avoir effectué un certain nombre de «mêmes animaux / temps différent 'essais, nous avons déterminé le meilleur moment pour le test de comportement était six heures-13 heures.
Nous avons également utilisé un Handh numériquechamp caméscope connecté par firewire pour tester les animaux dans des conditions de faible luminosité 5. Ce test a permis de vision nocturne ou scotopique, dans lequel l'animal utilise ses photorécepteurs à bâtonnets à voir. Les conditions ont été modifiées en trouvant simplement la moindre quantité de lumière nécessaire à l'animal pour réaliser le dosage de vision guidée. L'analyse présentée ici teste vision photopique, dans lequel l'animal utilise principalement ses cônes photorécepteurs à voir. En combinant ces approches, les deux types de vision, scotopique et photopique, peuvent être testés.
Nous avons utilisé ce test pour tester la fonction visuelle des animaux avec un oeil ectopique développée à partir de cellules pluripotentes surexprimant les facteurs de transcription champ oculaire intrinsèque exprimées et le facteur extrinsèque, caboche. Yeux générés à partir de ces tissus étaient fonctionnels 4,11. Caboche joue également un rôle dans le développement nerveux central antérieure du système 12 mais en utilisant ce dosage guidé par la vision en collaboration avec le chapeau animal trtest ansplant, son rôle dans le développement de l'œil a été découvert. N'ont pas encore été montré d'autres facteurs extrinsèques qui influent sur la formation de l'embryon précoce, mais d'avoir un rôle dans le développement de l'œil peut induit la formation de souches de la rétine dans les cellules de plafonnement des animaux pluripotentes 4,11. L'utilisation de ce test de comportement, les études futures pourraient déterminer la fonction visuelle de ces yeux nouvellement générés.
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Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions des Instituts nationaux de la santé: EY015748, EY017964 (MET), et EY019517 (ASV). Ce travail a également été soutenue par la recherche pour prévenir la cécité sans restriction Grant au département d'ophtalmologie et les Lions de New York Central. Nous tenons également à remercier notre technicien animalier, Matthew Mellini, pour son excellent soin des animaux et pour le renforcement de la vedette dans cette vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
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