Abstract
几个细菌种类具有附着到表面并殖它们在薄膜中称为生物膜的形式的能力。生长在多孔介质生物膜有关的几个工业和环境过程，如污水处理和CO 2封存。我们使用荧光假单胞菌 ，革兰氏阴性好氧性细菌，调查生物膜形成中的微流体装置，模仿多孔介质。微流体装置由微型职位的阵列，它是用软光刻技术制造的。接着，生物膜形成中这些设备具有流量进行了调查，我们证明被称为我们的设备幡丝状生物膜的形成。此处提供的制作与微流体器件组装的详细协议以及细菌培养协议。是为实验与微流体器件的详细过程还伴随着代表介绍结果。
Introduction
最近，我们展示了模仿多孔介质1的微流体器件细菌生物膜形成动态。细菌生物膜基本上是由胞外聚合物（EPS）2-4包裹表面聚集的细菌菌落。这些薄膜的细菌可以形成在几乎每一个可以想象小生从光滑表面的更复杂的生境的多孔介质。 Valiei 等人 1所用的微流体装置与微柱阵列来模拟多孔介质结构和研究生物膜形成在该装置的流体流速的函数。他们发现，在一定的水流流态，被称为幡丝状生物膜开始不同柱子之间出现。缆可在同一被拴或两端固体表面上，但是该结构的其余部分被悬浮在液体中。流光形成通常开始后生物膜的初始层已经形成，它的格式离子可支配生物膜的长期演变在这样复杂的栖息地。最近，一些研究人员调查了流光形成的过程中。亚兹迪等 5表明，幡可以在旋涡流从一个振荡的泡沫起源形成。在另一个实验中，RUSCONI 等 6研究了拖缆的形成信道的曲率和通道几何形状的影响。他们发现，该拖缆可在微通道的弯曲部分构成，并流光形态涉及蠕动。最近的研究已经表明，拖缆可以有各种天然的和人造的场景广泛影响，因为它们可以作为前体到成熟的结构中的多孔界面的形成，导致迅速和灾难性的生物膜增殖的生物医学系统，并且还造成实质性的流量 - 结构相互作用等 1,7-9。
生物膜幡常常表格IN复合栖息地，如多孔介质。理解生物膜生长在多孔介质中的环境相关的几个环境和工业过程，如污水生物处理10，保持在情况井筒的完整性，如CO 2的捕获11和在土壤中12堵孔。观察在如此复杂的栖息地生物被膜的形成往往是具有挑战性的，由于多孔介质的透明度。在这种情况下，基于微流体的多孔介质的平台可以证明非常有利的，因为它们允许实时和原位监测。微流体的另一个优点是，建立多个生物反应器在一个单一的生物微流体平台，同时允许在线监测和/或传感器的结合的能力。为执行在一个设备和收集显著相关数据进行准确的统计分析的能力，多个实验室实验的灵活性是重要的副词antage微流体系统13,14。
在上述讨论的范围内，在多孔介质环境理解流光形成动力学是将多个应用程序是有益的。在这项研究中，我们开发的协议，用于在设备模拟多孔介质调查流光形成。微流体平台的制造中，描述了用于细胞培养和实验所需的步骤。在我们的实验中， 荧光假单胞菌的野生型细菌菌株被使用。P.荧光假单胞菌，在土壤中自然存在，对维持土壤生态15了关键作用。该菌株采用已被基因工程改造以表达绿色荧光蛋白（GFP）组成。
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Protocol
这里进行的实验方案在下面描述的顺序。微细加工的协议，用于创建微流体平台在步骤讨论1。步骤2中记载的细菌培养协议（ 图2），和第三步涉及到的实验配置（ 图3）的装配。最后，实际的实验步骤是在步骤4中描述。
1，芯片制造过程
注意：适当的安全程序必须遵循下面描述的过程。咨询机构安全官员的详细资料。
- 设计与适当的软件（ 例如 ，L-EDIT）面具。该通道的设计由一个主微通道宽度625微米。的信道的中心区域包含的微柱体的阵列50微米的直径，间距25μm的间隔（参见参考文件）。
- 打印当前设计上的玻璃（5“×5”的钠钙玻璃），它的厚度为0.09“，并且由约70纳米厚的一层铬（Cr）的涂布，使用以制备光掩模掩蔽。使用AZ400K显影剂，持续1分钟，然后，蚀刻使用铬蚀刻剂Cr层约1分钟用丙酮剥离光刻胶，用冷食人鱼溶液清洗。（H 2 SO 4和H 2 O 2的比例为3：1）。
- 光刻
- 化学清洁标准4“硅片20分钟食人鱼的解决方案。
- 用去离子水清洗晶圆，并擦干。
- 加热晶片的热板上（200℃，15分钟）。
- 大衣的硅片光致抗蚀剂。这里，在正性光刻胶AZ4620旋涂在硅晶片上以2000rpm，持续25秒，得到12.5微米厚的层。
- 由浮动的晶片90秒的在100℃氮气流下除去通过在热板上的晶片的软烘烤所有的溶剂。然后，保持在真空中在t他相同的温度，持续60秒。
- 将晶圆在黑暗中24小时进行脱水。
- 暴露晶片于UV光以所设计的图案转移到光致抗蚀剂。
- 沉浸在光致抗蚀剂显影剂溶液（AZ400K）为240秒的晶片。然后，用异丙醇冲洗晶片并通过放置在氮气流中干燥。
- ICP-DRIE（电感耦合等离子体 - 深反应离子蚀刻）过程
- 应用DRIE蚀刻。根据所需的设备最终深度（50微米在本次调查）选择适当的蚀刻深度。光致抗蚀剂作为在此过程中的掩模层。
- 除去丙酮的残留光致抗蚀剂和清洗晶片。
- PDMS（聚二甲基硅氧烷）铸造
- 对于硅烷化硅模具师傅使用三氯甲基硅烷（TCMS）。倒入2〜3滴三氯甲基硅烷的小瓶，并将其放置在旁边的干燥器硅模具师傅。允许2-3小时的硅烷化过程完成。
- 在一个单独的容器中，混合的Sylgard 184聚硅氧烷基与固化剂以重量比10：1，制备PDMS。通过将其在真空条件下（约2小时）脱气PDMS。
- 把硅母模的持有人。然后，倒在硅原型模具的PDMS形成PDMS压模。确保气泡不会在PDMS在此过程中形成。
- 固化的PDMS 2小时，在80℃。
- 剥去从母模的PDMS印章。然后，切PDMS压模成单独的芯片。最后，使用切割核心钻洞的入口（S）和出口（S）。
- 硅橡胶玻璃的粘接
- 暴露盖玻片和PDMS压模，以氧等离子体进行30秒。债券的PDMS印章的盖玻片。
- 实现PDMS压模和盖玻片之间的适当密封，通过将其在烘箱中在70℃下进行10分钟退火设备。
2，细菌培养
注意：正确的生物安全协议必须遵循的步骤2-4。咨询机构安全官员的详细资料。
- 准备LB琼脂平板
- 添加20克的Luria-Bertani（LB）琼脂（米勒）粉末和500ml超纯水至1升烧瓶中。搅拌使之溶解的粉末。
- 通过高压灭菌在15磅，121℃下进行15分钟杀菌。
- 让烧瓶冷却至50-55℃的长椅上，或在水浴中的生物安全罩。
- 添加抗生素四环素达到50微克/毫升的最终浓度。纷飞拌匀。
- 将该混合物倒入平板上。填写每块板，直到1月2日 - 2月3日已满。
- 火焰气泡简单地弹出他们，如果他们形成。凝固气泡难以普及细菌培养过。
- 将平板在室温下冷却过夜。
- 当他们冷静，放盘放回他们的袖子，封袋，标签（抗生素及日期），并且在4℃商店。
注：盖板用锡箔的股票，轻停用许多抗生素。
- LB培养基的制备
- 添加20克的Luria-Bertani（LB）肉汤（米勒）粉末和1升超纯水至烧瓶中。搅拌使之溶解的粉末。
- 通过高压灭菌在15磅，121℃下进行15分钟杀菌。
- 让烧瓶冷却至50-55℃的长椅上，或在水浴中的生物安全罩。
- 添加抗生素四环素达到50微克/毫升的最终浓度。纷飞拌匀。
- 当冷，可将标记的瓶子在4℃。
注：盖上瓶锡箔，轻停用许多抗生素。
- 在LB琼脂平板上培养细菌（该协议使用荧光假单胞菌 ）
- 以细菌股价从冷冻（-80℃℃），并放置在冰上。
- 放置在-80℃的细菌股票和生物安全罩内的LB琼脂平板上。
- 条纹的细菌菌株上的LB琼脂平板上以Z字形图案。覆盖琼脂平板上，并培育其在30℃过夜。最后，存储盘在冰箱4℃。
- 准备细菌溶液（S1）
- 倒入50毫升LB培养基介质高压灭菌瓶中。生物安全罩内执行此操作。
- 从LB琼脂板烧瓶传输单个菌落。此操作也应生物安全罩内进行。
- 将烧瓶在摇床培养箱中在30℃和150rpm下进行足够时间（4小时）。
- 制备的稀细菌溶液（S2）的
- 倒入5ml的LB肉汤培养基经消毒的塑料管。
- 稀释S1用的LB肉汤培养基混合。接着，旋涡振荡溶液。稀的溶液达到所需的光学人的密度值（OD测定在600nm = 0.1）。
注：生物膜的实验通常采用在这附近的OD值。
3，准备好实验装置
- 使用镊子连接柔性塑料管（0.20“ID）到微芯片的入口（S）和（多个）出口的入口和出口进行了预先钻入微芯片（步骤1.5.5）的PDMS部，在该调查，微芯片包括两个入口和一个出口。
- 填充注射器（S）与细菌溶液（S2解决方案），并删除所有气泡注射器（S）。
- 连接注射器头（S）（30克0.5“钝针）到入口管（S），然后连接出口管（S）废容器。
4，运行实验
- 连接的注射器（S）到注射器尖端（次）。
- 地方和固定注射器（S）到注射泵。然后将光学显微镜的合乎需求的物镜下的微芯片编倍率（ 例如 40倍）。盖上一个活细胞腔室装置，以保持恒定的温度环境细菌生长（30℃， 荧光假单胞菌 ）的微芯片。
- 设置泵以所需流速水平（例如10微升/小时），并启动流体泵送。
- 一旦细菌被引入到室中，生物膜的形成也被启动。生物膜的形成和成熟，通常会发生在一段几小时甚至几天。观察并通过显微镜利用生物膜生长的图像。
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Representative Results
使用上述微细加工协议，PDMS微流体器件构成。 图1示出了扫描型电子显微镜（SEM）的PDMS的图像设备。 图1a示出了该装置的入口部分。甲叉状的入口被创建，以均衡压头跨器件。进一步SEM成像还表明，支柱壁几乎是垂直的（ 图1b）。将培养的细菌溶液（ 图2）中的稀释和其光密度调节至0.1的值。我们研究了生物膜的形成在微流体装置的输入流率的函数。当P。荧光假单胞菌注入设备在低流率的0.8微升/小时，细菌附着和生物膜的形成发生在该装置的壁上。即使经过较长时间（> 20小时），比面拥抱生物膜其它没有其他细菌的结构我们再观察。接着，将同样的实验重复的8微升/小时的流速。在这种情况下，生物膜形成输液稀释的细菌培养物在几分钟后再次启动。然而，几个小时后，出现微柱之间延伸的丝状结构的附近观察到的装置（ 图4）的中间部分。这些丝状结构可以通过不动细菌的存在可视化。这些结构被称为拖缆和它们丝状生物膜那些只拴在一个或两个端部到表面上。该结构的其余部分通常是悬浮在液体介质（如在这种情况下）， 图4示出了生物膜流光结构随时间的演化。缆通常形成由于在粘弹性生物膜的流体剪切的效果， 图5示出了流线和速度轮廓为流过一系列支柱。仿真结果表明，该横幅的在我们的微流体系统的形式本质上是沿着流体流动的流线对齐。流动的结构和形成生物膜缆之间的相关性还没有得到很好的理解。然而，Das和库马尔16最近提出，这些幡形成的固有的粘弹性生物膜的高粘度液体状态。他们根据自己的猜想上的时间尺度生物膜流光形成通常远远超过生物膜的粘弹性松弛时间尺度的观察。生物膜是已知表现为粘弹性体的液体，因此在时间尺度比粘弹性松弛时间尺度要大得多，所以它们基本上表现为高粘性液体17。根据该配方，拖缆可以预计到起源于高剪切应力的位置， 图5示出了高的速度在通道中的位置，并且这些位置用的高剪切应力的位置重合。在最初的PHA生长本身，拖缆附近观察到这些位置（ 图4）来发起。
图1的扫描电子显微镜（SEM）图像，所述微流体通道（顶视图）的。 A）入口段，含微柱B）地区。 请点击这里查看该图的放大版本。
图涉及细菌培养2连续的步骤。 请点击这里查看该图的放大版本。
图3设置为微流体实验。1光学显微镜（倒置），2注射器泵，3 -图像及数据采集，4注射器含有染料（可选），5 -注射器含有细菌，6 -废物储存器。 请点击这里查看该图的放大版本。
幡进化图4定时聚焦成像，图像平面对应于Z =设备25微米，即中间。虚线椭圆证明生物膜的飘带。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图5计算流体力学模拟出流过微柱的流线和速度轮廓。流体流动是由上到下，速度规模为米/秒。 请点击这里查看该图的放大版本。
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Discussion
我们证明了模拟多孔介质的生物膜研究发展的生境复杂的简单的微流体装置。它有决定了实验的结果，几个关键步骤。它们包括设备的几何形状。而后期的几何形状可以改变，充分的孔隙空间幡形成是必要的。此外，Valiei 等 。1表明，流光的形成只发生在一定的流量范围。在流率低于阈值的情况下，变形的生物膜成缆可能不会被观察到。但是，超过一定的阈另一个流量值，生物膜骨折可以支配，不允许形成幡。可困扰着这些实验的另一个问题是气泡，可以成为被困在微柱阵列中。通常这些泡沫必须通过增加流速最初，然后逐渐减小它为所需的值被删除。
微流控平台如这些提供了一些优势和一些限制。的平台使我们有小培养体积的工作，并具有结合用户定义的功能的灵活性。例如，不同的多孔结构可通过改变微柱阵列的几何参数进行模拟。即使是模仿实际多孔介质的随机结构结构可以制作在微流体平台18。此外，一些这样的信道可在单个设备允许收集显著相关数据进行准确的统计分析来实现。然而，微流体系统通常模仿多孔介质的二维结构。设备，可以模拟多孔介质的立体性通常是相当具有挑战性的制作。
幡的形成和演化都不能很好地理解的是，进一步的研究需要在这个方向。了解飘带是如何形成的，并导致格式成熟生物膜结构的离子将是相关的，以各种各样的方案，包括生物医学装置，如心脏支架，在土壤中的生物膜，和过滤系统的堵塞。我们的微流体平台是朝这个方向迈出的一步。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
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