Abstract
Несколько видов бактерий обладают способностью придаем поверхностей и колонизировать их в виде тонких пленок, называемых биопленок. Биопленки, которые растут в пористых средах актуальны для нескольких промышленных и экологических процессов, таких как очистка сточных вод и CO 2 секвестра. Мы использовали Pseudomonas Шогезсепз, грамотрицательная аэробная бактерия, исследовать образование биопленки в микрофлюидном устройства, которое имитирует пористых средах. Микрожидкостных устройство состоит из массива микро-сообщений, которые были изготовлены с использованием софт-литографии. Впоследствии, образование биопленки в этих устройствах с потоком была исследована и мы демонстрируем формирование нитевидных биопленок, известных как растяжки в нашем устройстве. Подробные протоколы для изготовления и сборки микрожидкостных устройств предусмотрены здесь наряду с бактериальными протоколов культуры. Подробные процедуры экспериментов с микрожидкостных устройств также представлены наряду с представителемРезультаты.
Introduction
Недавно мы показали динамику бактериальные биопленки в микрофлюидном устройства, который имитирует пористых средах 1. Бактериальные биопленки, по существу колонии на поверхности бактерий, которые объединены заключены по внеклеточных полимерных веществ (EPS) 2-4. Эти тонкие пленки бактерий могут образовываться в практически все мыслимые ниши, начиная от гладких поверхностей с гораздо более сложной среде обитания пористых сред. Valiei и соавт. 1 используется микрожидком устройство с множеством микро-колоннами, чтобы имитировать пористую структуру носителя и изучены образования биопленки в этом устройстве в зависимости от скорости потока жидкости. Они обнаружили, что в определенном режиме потока, нитевидные биопленки известные как растяжки стали появляться между различными колоннами. Ответвления могут быть привязаны на одном или обоих концах твердых поверхностей, но остальная часть структуры суспендируют в жидкости. Streamer образование, как правило, начинается после начального слой биопленки сформировал и его форматион может диктовать долгосрочного развития биопленки в таких сложных мест обитания. В последнее время некоторые исследователи исследовали динамику формирования стримера. Язди и др. 5 показали, что растяжки могут образовывать в вихревых потоков, происходящих из колеблющегося пузырька. В другом эксперименте, Рускони др. 6 исследовано влияние кривизны канала и геометрии канала на формирование стримеров. Они обнаружили, что растяжки могут образовываться в изогнутых участках микроканалов, а стримерного морфологии связано с подвижностью. Недавние исследования показали, что растяжки могут иметь далеко идущие последствия в различных естественных и искусственных сценариев, поскольку они могут действовать в качестве предшественников формирования зрелых структур в пористых интерфейсов, привести к быстрому и катастрофическому распространению биопленки в биомедицинских систем, а также нанести существенный проточного Структура взаимодействия и т.д. 1,7-9.
Биопленки растяжки часто форма Iн сложные места обитания, такие как пористых средах. Понимание рост биопленки в пористой среде СМИ имеет отношение к нескольким экологических и производственных процессов, таких как биологической очистки сточных вод 10, поддержание ствола скважины целостность в таких ситуациях, как улавливания СО 2 11 и забивания пор в почве 12. Наблюдая образование биопленки в таких сложных мест обитания часто может быть сложной задачей в связи с непрозрачностью пористых средах. В таких ситуациях, Microfluidics основе пористых средства массовой информации, может оказаться чрезвычайно выгодным, так как они позволяют в режиме реального времени и в мониторинге месте. Еще одно преимущество микрофлюидики является возможность построить несколько биореакторов на одном био-Микрожидкостных платформе и одновременно обеспечить оперативного мониторинга и / или включения датчиков. Гибкость, чтобы реализовать несколько лабораторных экспериментов в одном устройстве и возможность получать значительные соответствующие данные для точного статистического анализа является важным Advantage из микрофлюидных систем 13,14.
В контексте сказанного выше, динамика понимание формирования стримеров в пористой среде медиа бы полезно несколько приложений. В этом исследовании, мы разрабатываем протокол за расследование образование косы в устройстве, которое имитирует пористые среды. Изготовление микрожидкостных платформы, необходимые шаги для культуры и экспериментов клетки описаны. В наших экспериментах был использован дикий тип Бактериальный штамм Pseudomonas Fluorescens. П. Fluorescens, нашел в почве, играет ключевую роль в поддержании экологии почв 15. Бактериальный штамм занятых были генетически сконструированы для экспрессии зеленый флуоресцентный белок (GFP) конститутивно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Выполните экспериментальных протоколов здесь в порядке, описанном ниже. Протоколы микротехнологий для создания микрожидкостных платформы обсуждаются в шаге 1 Шаг 2 описывает бактериальной протокол культуры (рис 2), и Шаг 3 относится к сборке экспериментальной установки (рисунок 3). Наконец, фактический экспериментальный шаг описан в пункте 4.
1 Чип Порядок изготовления
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное процедуры безопасности необходимо выполнять для процессов, описанных ниже. Обратитесь к институциональной офицера безопасности для деталей.
- Дизайн маску с соответствующим программным обеспечением (например, L-Edit). Конструкция канала состоит из главного микро-канал с шириной 625 мкм. Центральная область канала содержит массив микро-сообщений 50 мкм в диаметре, расположены 25 мкм друг от друга (Смотрите дополнительные файлы).
- Распечатать эту конструкцию на стекле (5 "х 5" натрий-кальций-стекло), Который имеет толщину 0,09 "и покрыта примерно на 70 нм толстым слоем хрома (Cr), с помощью маскировки, чтобы подготовить фотошаблон. Использование AZ400K разработчиком в течение 1 мин. Затем, травление слой Cr с использованием травителя Cr около 1 мин Используйте ацетон обирать сопротивляться и очистить его с холодным раствором пираньи. (H 2 SO 4 и H 2 O 2 в соотношении 3: 1).
- Фотолитографии
- Очистите стандартный 4 "кремниевой пластины химически с пираньи решение в течение 20 мин.
- Промыть пластины с дистиллированной водой и высушить его.
- Нагреть пластины на горячей плите (200 ° С в течение 15 мин).
- Пальто кремниевой пластины с фоторезиста. Здесь положительный фоторезист AZ4620 был спин-покрытием на кремниевой пластине при 2000 оборотах в минуту в течение 25 сек, чтобы получить толстый слой 12,5 мкм.
- Удалить весь растворитель мягкой выпечки пластины на горячей плите путем размещения пластины в течение 90 сек на потоке азота при 100 ° С. Тогда, держать его в вакууме при ТОн же температуре в течение 60 сек.
- Поместите пластину в темном поле в течение 24 часов для обезвоживания.
- Expose пластину УФ-излучения для того, чтобы передать картины, разработанные для фоторезиста.
- Погрузите пластины в раствор фоторезиста разработчиков (AZ400K) для 240 сек. Затем промыть пластины с изопропиловым спиртом и сушат, поместив в потоке газообразного азота.
- ICP-DRIE (индуктивно-связанной плазмой - Deep Реактивное ионное травление) Процесс
- Применить DRIE травления. Выберите подходящий глубину травления в соответствии с конечной глубины, необходимой для устройства (50 мкм в данном исследовании). Фоторезист действует в качестве маскирующего слоя во время этого процесса.
- Удалите остатки фоторезиста с ацетоном и очистить пластины.
- PDMS (полидиметилсилоксана) Литье
- Используйте trichloromethylsilane (TCMS) для silanizing мастер кремния формы. Залить 2 или 3 капли trichloromethylsilane в пузырек и поместите его в эксикаторе рядомкремния мастер формы. Разрешить 2-3 ч для процесс silanizing, чтобы закончить.
- В отдельном контейнере, смешать силиконовую базу Sylgard 184 с помощью отвердителя весовом соотношении 10: 1 для приготовления PDMS. Дегазации PDMS, подвергая его условиях вакуума (около 2 ч).
- Поставьте кремния мастер формы в держателе. Тогда, залить PDMS на главном кремния формы, чтобы сформировать PDMS штамп. Убедитесь, что пузырьки не образуют в PDMS в ходе этого процесса.
- Вылечить PDMS течение 2 ч при 80 ° С.
- Снимите штампа PDMS от мастера плесени. Тогда, вырезать PDMS штамп в отдельных микросхем. И, наконец, использовать режущую ядро для сверления отверстий для впуска (ы) и выходе (ы).
- Склеивание PDMS до стекла
- Expose покровное и PDMS штамп в кислородной плазме в течение 30 сек. Бонд PDMS штамп в покровным.
- Для достижения надлежащего уплотнения между PDMS штамп и покровным стеклом, отжига устройство, поместив ее в печи при 70 ° С в течение 10 мин.
2 бактериальная культура
ПРИМЕЧАНИЕ: Собственные протоколы биобезопасности должен следовать за шаги 2-4. Обратитесь к институциональной офицера безопасности для деталей.
- Подготовка чашек с агаром LB
- Добавить 20 г Лурии-Бертани (LB), агар (Miller) порошки и 500 мл сверхчистой воды в 1-литровую колбу. Движение, чтобы растворить порошок.
- Стерилизация в автоклаве при 15 фунтов на квадратный дюйм, 121 ° С в течение 15 мин.
- Разрешить колбу остыть до 50-55 ° С на скамейке или на водяной бане в капюшоне биобезопасности.
- Добавьте Тетрациклин антибиотик, чтобы достичь конечной концентрации 50 мкг / мл. Все хорошо перемешать, вращая.
- Вылейте смесь в пластинах. Заполните каждую тарелку по 1/2 - 2/3 полной.
- Кратко пламени пузырьки воздуха, чтобы совать их, если они образуют. Затвердевшие пузырьки воздуха трудно распространить бактериальную культуру более.
- Разрешить пластины остыть при комнатной температуре в течение ночи.
- Когда они здорово,положить тарелки обратно в рукаве, печать мешок, метку (антибиотик и дату), и хранить при температуре 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покройте запас пластин с фольгой, как свет дезактивирует многие антибиотики.
- LB Отвар Подготовка
- Добавить 20 г Лурия-Bertani (LB) бульон (Miller) порошки и 1 л воды высшей степени очистки на колбу. Движение, чтобы растворить порошок.
- Стерилизация в автоклаве при 15 фунтов на квадратный дюйм, 121 ° С в течение 15 мин.
- Разрешить колбу остыть до 50-55 ° С на скамейке или на водяной бане в капюшоне биобезопасности.
- Добавьте тетрациклин антибиотик, чтобы достичь конечной концентрации 50 мкг / мл. Все хорошо перемешать, вращая.
- Когда остынет, поместите надписью бутылку при 4 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покройте бутылку с фольгой, как свет дезактивирует многие антибиотики.
- Культура Бактерии на LB агаром (использует Этот протокол Pseudomonas Шогезсепз)
- Возьмите бактериальной запас из морозильника (-80 °; C) и поместите его на льду.
- Поместите -80 ° C бактериальный бульон и агар пластины LB внутри капюшоном биобезопасности.
- Подряд бактериальный штамм на чашке с агаром LB, в виде ломаной линии. Накройте агаром и инкубировать ее при 30 ° С в течение ночи. И, наконец, хранить пластины в холодильнике при 4 ° С.
- Подготовьте бактериального раствора (S1)
- Налейте 50 мл LB бульон СМИ к автоклавного колбу. Выполните эту операцию внутри капюшоном биобезопасности.
- Передача одну бактериальную колонию с чашки с агаром LB в колбу. Эта операция также должна быть выполнена внутри капюшоном биобезопасности.
- Поставьте колбу в шейкер-инкубатор при 30 ° С и 150 оборотов в минуту для адекватного времени (4 ч).
- Подготовьте разбавленной бактериального раствора (S2)
- Налейте 5 мл LB бульон СМИ в стерилизованную пластиковой трубки.
- Развести S1 путем смешивания с LB бульоне СМИ. Тогда, вихрь решение. Развести раствор достичь желаемого оптикааль плотность (OD при 600 нм = 0,1).
ПРИМЕЧАНИЕ: биопленки эксперименты обычно используют значения ОП в этом районе.
3 Подготовьте Setup Экспериментальная
- С помощью пинцета подключить гибкие пластиковые трубки (0,20 "ID) в входе (входах) и выходе (ы) микрочипа. Входы и выходы были ранее пробуренных в PDMS части микрочипа (шаг 1.5.5). В этом исследовании , микрочип состоит из двух входов и один выход.
- Заполните шприц (ы) с бактериальной раствор (раствор S2) и удалить все пузырьки в шприце (ы).
- Подключите шприц наконечник (ы) (30 G 0,5 "тупые иглы) в впускной трубы (ы). Затем подключите выходную трубку (ы), чтобы тратить контейнер.
4 Запустите эксперимент
- Подключение шприц (ей) наконечника (ы) шприца.
- Место и исправление шприц (ы) на шприцевой насос. Затем поместите микрочип под оптическим микроскопом с объективов желаниред увеличение (например, 40X). Накройте микрочип с живой клетки камеры устройства для поддержания постоянной температуры окружающей среды для роста бактерий (30 ° C для Р. Шогезсепз).
- Установите насос на уровне лучшего расхода (скажем 10 мкл / час) и инициировать перекачку жидкости.
- После того, как бактерии вводятся в камеру, образование биопленки также инициирован. Формирование биопленок и созревание обычно происходит в течение нескольких часов или даже дней. Наблюдать и получать изображения роста биопленки через микроскоп.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя упомянутую выше протокол микроструктур, на основе PDMS микрожидкостных устройство было построено. Рисунок 1 показывает сканирующего электронного микроскопа (SEM) образы PDMS устройство. 1а представлены вступительный раздел устройства. Вилка-как вход создается уравнять напор через устройства. Далее изображений SEM также показали, что столб стены почти вертикально (Рисунок 1б). Культивируют бактериального раствора (рисунок 2) и разводили его оптическую плотность доводят до значения 0,1. Мы исследовали образование биопленки в микрофлюидного устройства в зависимости от расхода на входе. Когда П. Fluorescens вводили в устройство при низкой скорости потока 0,8 мкл / ч, прикрепление бактерий и образование биопленки происходит на стенках устройства. Даже после длительного времени (> 20 ч), никакие другие бактериальные кроме поверхностно-обнимать биопленок структуры мывновь наблюдается. Далее, тот же самый эксперимент был повторен при скорости потока 8 мкл / час. В этом случае образование биопленки снова начал через несколько минут после инфузии разбавленной бактериальной культуры. Тем не менее, через несколько часов, появление нитевидных структур, проходящих между микро-столбов наблюдалось вблизи средней части устройства (рисунок 4). Эти нитевидные структуры могут быть визуализированы с помощью присутствии неподвижных бактерий. Эти структуры известны как растяжки, и они нитевидные биопленки, которые привязаны только на одном или обоих концах, чтобы поверхностей. Остальная часть структуры часто суспендируют в жидкой среде (как в данном случае). На рисунке 4 показаны временные эволюцию структуры биопленки стримерного. Растяжки обычно образуют за счет эффекта сдвига жидкости на вязкоупругой биопленки. Рисунке 5 представлены линии тока и контуров скорости для обтекания серии столбов. Моделирование показывает, что стримеры,форма в нашем микрофлюидного системы, по существу, выровнены вдоль линий тока потока жидкости. Корреляция между структурами потока и формирования биопленки растяжки еще не очень хорошо понял. Тем не менее, Das и Кумар 16 недавно предложили, что эти растяжки образуются в очень вязкой жидкости состояния неразрывно вязкоупругих биопленок. Они основывали свою гипотезу на том, что временная шкала формирования биопленки стримеров обычно намного превышает вязкоэластичных времени релаксации масштабы биопленок. Биопленки, как известно, ведут себя как вязкоупругих жидкостей и, следовательно, на временных масштабах, существенно превышающих масштабе времени вязкоупругая релаксации, они по существу ведут себя как высоковязких жидкостей 17. Согласно этой формулировке, растяжки можно ожидать, происходят в местах высоких напряжений сдвига. Рисунок 5 показывает расположение высокой скорости в канале, и эти места совпадают с мест высоких напряжений сдвига. В начальной ФГА себе роста, растяжки наблюдаются, происходят вблизи этих местах (рисунок 4).
Рисунок 1 Сканирующий электронный микроскоп (SEM) изображения микрожидкостной канала (вид сверху). а) раздел Вход, б) Регион содержащий микро-столбы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. последовательных шагов, вовлеченных в бактериальной культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Настройка для микрофлюидных экспериментов. 1-Оптический микроскоп (перевернутый), 2-шприцевой насос, 3-изображения и сбор данных, 4-шприц, содержащий краситель (по желанию), 5-шприц, содержащий бактерии, резервуар 6-отходов. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4 Покадровый конфокальной микроскопии эволюции растяжки. Самолет изображения соответствует г = 25 мкм, т.е. середину устройства. Пунктирные эллипсы продемонстрировать биопленки растяжки. Пожалуйста, нажмитездесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5 вычислительной газовой механические расчеты, показывающие линии тока и контуров скорости обтекания микро-столбов. Поток жидкости является сверху вниз и скорости масштабе в м / сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали простой микрожидкостных устройств, который имитирует пористых средах для изучения развития биопленки в сложных средах обитания. Есть несколько важных шагов, которые диктуют итоги экспериментов. Они включают в себя геометрию устройства. В то время как геометрия сообщение может варьироваться, адекватной пор-пространство для растяжки для формирования необходимо. Кроме того, Valiei и соавт. 1, показали, что формирование стримера происходит только в определенном диапазоне скорости потока. При скорости потока ниже, чем пороговое значение, деформация биопленки в стримеров не может наблюдаться. Тем не менее, выше определенного значения расхода другого порога, разрушение биопленки может доминировать и не допускать формирование стримеров. Другой вопрос, что может преследовать этих экспериментов пузырьки газа, которые попадают в массиве микро-стойки. Обычно эти пузырьки должны быть удалены путем увеличения скорости потока, первоначально, а затем постепенно уменьшается до желаемого значения.
Микрожидкостных платформытаких как они предлагают несколько преимуществ и несколько ограничений. Платформа позволяет нам работать с небольшими объемами культуры, и обладает достаточной гибкостью включения определяемые пользователем функции. Например, различные пористые структуры могут быть смоделированы путем изменения геометрических параметров массива микро-стойки. Даже структуры, которые имитируют случайную структуру реального пористых средах могут быть изготовлены на микрофлюидных платформ 18. Кроме того, несколько таких каналов может быть реализован на одном устройстве, позволяя для сбора соответствующих данных значимых для быстрого и точного статистического анализа. Тем не менее, микрофлюидных системы обычно имитировать двумерный структуру пористых средах. Устройства, которые могут имитировать трехмерную природу пористых средах, как правило, довольно сложно изготовить.
Формирование и эволюция растяжки не очень хорошо еще понял, и требуются дальнейшие исследования в этом направлении. Понимание того, как растяжки формировать и привести к форматуионный зрелых биопленки структур будут иметь отношение к широкому кругу сценариев в том числе засорения биомедицинских устройств, таких как стенты, сердечные биопленки в почве, и системы фильтрации. Наша Микрожидкостных платформа является шагом в этом направлении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
