Abstract
いくつかの細菌種は、表面に付着したバイオフィルムと呼ばれる薄膜の形態でそれらにコロニーを形成する能力を有する。多孔質媒体で成長バイオフィルムは、このような廃水処理およびCO 2の隔離など、いくつかの産業や環境のプロセスに関連している。私たちは、多孔質媒体を模倣マイクロ流体デバイス内のバイオフィルム形成を調査するために、 シュードモナス·フルオレッグラム陰性好気性細菌を使用していました。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィを用いて作製されたマイクロポストのアレイからなる。続いて、流れにこれらのデバイスにおけるバイオフィルムの形成を検討したと私たちは私たちのデバイス内のストリーマとして知られている糸状バイオフィルムの形成を実証する。マイクロ流体デバイスの製造および組立のための詳細なプロトコルは、細菌培養プロトコールと一緒にここに提供されています。マイクロ流体デバイスを用いた実験のための詳細な手順も、代表と一緒に提示されている結果。
Introduction
最近では、多孔質媒体1を模したマイクロ流体デバイス内の細菌のバイオフィルム形成のダイナミクスを示した。細菌性バイオフィルムは、本質的に、細胞外高分子物質（EPS）2-4によって包まれている表面に凝集する細菌のコロニーである。細菌のこれらの薄膜は、滑らかな表面から多孔質媒体のはるかに複雑な生息地に至るまで、ほぼすべての考えられるニッチを内形成することができる。 Valiei ら 1は多孔質媒体の構造をシミュレートするために、マイクロピラーのアレイを有するマイクロ流体デバイスを使用し、流体の流量の関数として、この装置ではバイオフィルム形成を研究した。彼らはある特定の流れ状態で、ストリーマとして知られている糸状バイオフィルムを別の柱の間に現れ始めたことがわかった。ストリーマは、一方に係留され得るか、または両方が、固体表面に終了するが、その他の構成は、液体中に懸濁されている。ストリーマの形成は、典型的には、バイオフィルムの初期層を形成した後に開始し、そのフォーマットイオンは、このような複雑な生息地でバイオフィルムの長期的な発展を決定することができます。最近、いくつかの研究者は、ストリーマ形成のダイナミクスを調べた。ヤズディら 5はストリーマが発振バブルから生じる渦流れに形成することができることを示した。別の実験では、Rusconiからら 6は、ストリーマの形成にチャネル曲率およびチャネルの形状の影響を調べた。彼らは、ストリーマは、マイクロチャネルの湾曲部分に形成できることを見出し、ストリーマ形態は、運動性に関連する。最近の研究では、ストリーマは、彼らが多孔インタフェースで成熟した構造の形成の前駆体として働くことができるように、さまざまな天然および人工のシナリオで幅広い影響を持つ生物医学システムで迅速かつ壊滅的なバイオフィルムの増殖につながり、また、実質的なフロースルーを引き起こす可能性があることを実証した構造の相互作用など 1,7-9。
バイオフィルム吹流しは、多くの場合、私を形成するそのような多孔質媒体としてのn複雑な生息地。多孔質のメディア環境におけるバイオフィルムの成長を理解することは、例えばCO 2回収11、土壌12中の細孔の閉塞のような状況ではよく穴の整合性を維持、このような生物学的廃水処理10などのいくつかの環境および産業プロセスに関連しています。このような複雑な生息地でのバイオフィルム形成を観察することにより、しばしば多孔質媒体の不透明度に挑戦することができます。それらはリアルタイムで可能にし、 その場での監視にこのような状況では、マイクロ流体ベースの多孔質媒体プラットフォームは、非常に有利で 証明することができる。マイクロフルイディクスのもう一つの利点は、単一のバイオマイクロ流体プラットフォーム上で複数のバイオリアクターを構築し、同時にオンライン監視および/またはセンサの組み込みを可能にする機能です。一つの装置で正確な統計分析のために有意な関連データを収集する機能で複数の研究室での実験を実施するための柔軟性が重要である前売りマイクロ流体システム13,14のアンテージ。
上記の議論の文脈では、多孔質媒体環境でストリーマ形成の動態を理解することは、複数のアプリケーションに有益であろう。本研究では、多孔質媒体を模倣装置におけるストリーマの形成を調査するためのプロトコルを開発しています。マイクロフルイディックプラットホームの製造は、細胞培養実験のために必要な手順が記載されている。実験では、 シュードモナス·フルオレッセンスの野生型細菌株を用いた。P.土壌中に天然に見出さフルオレッセンスは、土壌の生態15を維持する上で重要な役割を果たしている。用いられる細菌株は、遺伝的に恒常的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。
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Protocol
以下に説明するために、ここに実験プロトコルを実行します。マイクロ流体プラットフォームを作成するための微細加工プロトコルは、ステップ1、ステップ2で説明されています（ 図2）細菌培養プロトコルを説明し、実験装置（ 図3）の組み立てステップ3が関係。最後に、実際の実験手順は、工程4に記載されている。
1チップ製造手順
注：適切な安全手順は、以下に記載のプロセスに従わなければなりません。詳細については、制度的安全管理者に相談してください。
- 適切なソフトウェア（ 例えば 、L-Editの）マスクを設計します。チャンネルのデザインは、幅625ミクロンの主なマイクロ流路で構成されています。チャネルの中央領域の直径が50μmの微細柱の配列が含まれ、（補足ファイルを参照してください）離れて25μmの間隔をあけ。
- ガラス上このデザインを印刷（5 "×5"ソーダライムガラス次に、クロムエッチング液を用いCr層をエッチングし）、その0.09の厚さを有し、「フォトマスクを製造するためにマスキングを使用して、クロム（Cr）の約70nmの厚さの層で被覆されている。1分間使用してAZ400K現像液。約1分間のレジストと冷たいピラニア溶液でそれをきれいに取り除くために、アセトンを使用してください。（H 2 SO 4とH 2比3 O 2：1）。
- フォトリソグラフィー
- 20分間ピラニア溶液と化学的に標準的な4 "のシリコンウェハを清掃してください。
- DI水でウェーハを洗浄して、それを乾燥させます。
- ホットプレート（15分間200℃）上のウエハ加熱する。
- コートレジストを有するシリコンウェーハ。ここでは、ポジ型フォトレジストAZ4620は12.5ミクロンの厚さの層を得るために25秒間2000rpmでシリコンウェハ上にスピンコートした。
- 100℃で窒素流で90秒間ウェハを浮遊させることによって、ホットプレート上でウェーハのソフトベークして、すべての溶媒を除去します。次に、tに真空中でそれを維持60秒間、彼は同じ温度。
- 脱水のための24時間暗箱にウェハを配置します。
- フォトレジストに設計されたパターンを転写するために、UV光にウェハを公開します。
- 240秒間、フォトレジスト現像液（AZ400K）のウェハを浸し。その後、イソプロピルアルコール、ウエハをリンスし、窒素ガス流中に置くことによって、それを乾燥させる。
- ICP-DRIE（誘導結合プラズマ - ディープ反応性イオンエッチング）プロセス
- DRIEエッチングを適用します。デバイスに必要な最終的な深さ（この調査では50程度）に応じて適切なエッチング深さを選択してください。フォトレジストは、このプロセスの間にマスキング層として機能します。
- アセトンで残りのフォトレジストを除去し、ウェーハを洗浄してください。
- PDMS（ポリジメチルシロキサン）鋳造
- シリコンマスターモールドをシラン化するためのトリクロロメチルシラン（TCMS）を使用します。バイアル中のトリクロロメチルシランの2または3滴を注ぎ、横にデシケーターに入れてくださいシリコンマスターモールド。シラン化プロセスが完了するまで2〜3時間を許可します。
- PDMSを製造するために1：別の容器に、10の重量比で硬化剤とのSylgard 184シリコーンベースを混合する。真空条件（約2時間）に供することによりPDMSを脱気。
- ホルダにシリコンマスターモールドを入れてください。その後、PDMSスタンプを形成するために、シリコンマスターモールド上にPDMSを注ぐ。気泡がこのプロセスの間に、PDMSで形成されないことを確認してください。
- 80℃で2時間、PDMSを治す。
- マスターモールドからPDMSスタンプをはがし。その後、独立したマイクロチップにPDMSスタンプを切った。最後に、入口および出口（単数または複数）のための穴をドリル切削コアを使用する。
- ガラスへのPDMSの接着
- 30秒間酸素プラズマにカバースリップとPDMSスタンプを公開します。カバースリップに結合PDMSスタンプ。
- PDMSスタンプとカバースリップとの間に適切なシールを達成するために、70℃で10分間オーブンに入れるなどして、デバイスをアニールする。
2細菌培養
注：適切なバイオセーフティ·プロトコルは、ステップ2〜4のために従わなければなりません。詳細については、制度的安全管理者に相談してください。
- LB寒天プレートを準備します
- 20グラムルリア - ベルターニ（LB）寒天（ミラー）粉末、超純水500mlを1Lのフラスコに入れる。粉末を溶解するために撹拌する。
- 15 psiの、15分間121℃でオートクレーブすることにより滅菌する。
- フラスコをベンチやバイオセーフティーフード内で水浴中で50〜55℃まで冷却して。
- 50μg/ mlの最終濃度を達成するために抗生物質テトラサイクリンを加える。旋回でよく混ぜる。
- プレートに混合物を注ぐ。フル2分の1〜3分の2まで各プレートを埋める。
- 炎空気はそれらが形成する場合は、それらをポップするために簡単に泡。固化した気泡は、細菌培養にわたって拡散することが困難である。
- プレートを室温で一晩冷却してください。
- 彼らはクールである場合、戻って自分の袖にプレートを入れて、袋を密封し、ラベル（抗生物質および日付）、そして4℃で保存してください。
注：光は多くの抗生物質を不活性化するように、スズ箔でプレートの株式をカバー。
- LBブロス準備
- 20グラムルリア - ベルターニ（LB）ブロス（ミラー）粉末および超純水1Lをフラスコに加える。粉末を溶解するために撹拌する。
- 15 psiの、15分間121℃でオートクレーブすることにより滅菌する。
- フラスコをベンチやバイオセーフティーフード内で水浴中で50〜55℃まで冷却して。
- 50μg/ mlの最終濃度を達成するために抗生物質テトラサイクリンを加える。旋回でよく混ぜる。
- ときにクール、4℃で標識ボトルを置く。
注：光は多くの抗生物質を不活性化するように、スズ箔でボトルをカバー。
- LB寒天プレートに培養菌（このプロトコルが使用するシュードモナス·フルオレッ ）
- 冷凍庫から細菌の株式を取る（-80°; C）と氷の上に置きます。
- バイオセーフティーフードの内側に-80℃で細菌株式およびLB寒天プレートを置きます。
- ストリークジグザグパターンでLB寒天プレート上に細菌株。寒天プレートをカバーし、一晩30℃以上でそれをインキュベートする。最後に、4℃の冷蔵庫内のプレートを格納します。
- 菌液を準備する（S1）
- オートクレーブをフラスコに50ミリリットルのLBブロス培地を注ぐ。バイオセーフティーフードの内側に、この操作を実行します。
- フラスコにLB寒天プレートから単一の細菌コロニーを転送します。この操作は、バイオセーフティーフード内で行われるべきである。
- 30℃、適切な時間（4時間）、150 rpmで振とう培養器でフラスコを入れてください。
- 希釈菌液（S2）を準備します
- 滅菌プラスチックチューブに5ミリリットルのLBブロス培地を注ぐ。
- LBブロス培地と混合することにより、S1に希釈する。次いで、この溶液をボルテックス。溶液を希釈希望視神経を達成ら密度（ODは、600nm = 0.1で測定）。
注：バイオフィルムの実験は、通常、この近くでOD値を採用している。
3実験のセットアップを準備します
- 使用方法ピンセットは、マイクロチップの入口および出口の（複数の）への柔軟なプラスチックチューブ（0.20 "ID）を接続してください。入口と出口は、以前にマイクロチップ（ステップ1.5.5）のPDMS部分に掘削された。本研究でマイクロチップは、2つの入口と一つの出口から構成されています。
- 菌液（S2溶液）で注射器（複数可）を記入し、注射器（複数可）内のすべての気泡を除去。
- 入口管（群）へのシリンジチップ（S）（30 G 0.5」鈍針）を接続した後、コンテナを無駄に排出管を接続します。
4。実験を実行します
- シリンジチップ（複数可）に注射器を接続します。
- シリンジポンプにシリンジ（複数可）場所と固定してください。その後DESIRの対物レンズで、光学顕微鏡下でマイクロチップを配置ED倍率（ 例えば 、40X）。 （P. 30℃でオレッ ）細菌増殖のための一定の温度環境を維持するために、ライブセルチャンバー装置を備えたマイクロチップをカバー。
- 所望の流量レベルにポンプを設定します（たとえば10μL/時間）と流体ポンプを開始します。
- 細菌がチャンバ内に導入されると、バイオフィルム形成も開始される。バイオフィルム形成及び成熟は、一般的に数時間または数日の期間にわたって発生する。観察し、顕微鏡でバイオフィルムの成長を撮影。
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Representative Results
上述した微細加工プロトコルを使用して、PDMSベースのマイクロ流体デバイスを構築した。1は走査電子顕微鏡（SEM）PDMSの画像を示し 、デバイス。 図1aは、装置の入口断面を示している。フォーク状の入り口は、デバイス全体に圧力ヘッドを等しくするために作成されます。さらなるSEMイメージングはまた、柱壁が（ 図1b）は、ほぼ垂直であることを示した。培養した菌液（ 図2）で希釈し、その光学密度を0.1の値に調節した。私たちは、入力された流量の関数として、マイクロ流体デバイス内のバイオフィルム形成を調べた。ときにP.フルオレッセンスは、0.8μlの/ hrの低流速で装置に注入し、細菌付着およびバイオフィルム形成は、デバイスの壁に発生した。でも、長時間（> 20時間）した後、表面にぴったりのバイオフィルム以外の他の細菌の構造ない私たち再観察した。次に、同様の実験を8μlの/ hrの流量で繰り返した。この場合には、バイオフィルム形成は、再び希釈した細菌培養の注入の数分後に開始した。しかし、数時間後に、マイクロピラー間に延びる糸状構造の出現は、デバイス（ 図4）の中央部分付近に観察された。これらの糸状の構造は不動細菌の存在を介して可視化することができた。これらの構造は、ストリーマとして知られており、それらは、1つ以上の表面に両端でのみテザーである糸状バイオフィルムである。その他の構成は、多くの場合（この場合のように）液体培地中に懸濁される。 図4は、バイオフィルムストリーマ構造の時間発展を示す。ストリーマは通常、粘弾性バイオフィルム上の流体せん断の影響で形成している。5は柱の一連の過去の流れのために流線と速度の輪郭を示しています。シミュレーションはその吹流しを示している私たちのマイクロ流体システム内のフォームは、本質的に、流体流の流線に沿って整列している。フロー構造およびバイオフィルムストリーマの形成の間の相関はまだよく理解されていない。しかし、ダスとクマー16は最近、これらの吹流しが本質的に粘弾性バイオフィルムの高粘性液体状態として形成することを提案した。これらは、バイオフィルムストリーマ形成の時間スケールは、典型的にははるかにバイオフィルムの粘弾性緩和時間スケールを超えて観察にそれらの推測をもと。バイオフィルムは、粘弾性液体として挙動することが知られているので、粘弾性緩和時間スケールよりもはるかに大きい時間スケールで、それらは本質的に高粘性の液体17として挙動している。この処方により、ストリーマは、高剪断応力の位置で発生することが期待できる。 図5は、チャネル内の高速度の位置を示しており、これらの位置は、高剪断応力の位置と一致する。初期PHAで成長自体は、ストリーマは、これらの位置（ 図4）の近くに由来することが観察される。
マイクロ流体チャネル（トップビュー）の図1の走査型電子顕微鏡（SEM）画像である。マイクロピラーを含むa）の入口部、b）の地域をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
細菌培養にかかわる2連続した工程図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3は、マイクロ流体実験のために設定します。1-光学顕微鏡（倒立）、細菌、6廃棄物リザーバを含む2シリンジポンプ、3 -イメージとデータ収集、染料（オプション）を含む4-シリンジ、5シリンジ。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ストリーマの進化の図4タイムラプス共焦点イメージングは画像面はデバイスの中央IE =25μmでのzに対応している。点線の楕円は、バイオフィルム吹流しを示しています。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
マイクロピラーを過ぎて流れの流線と速度コンターを示す図5数値流体機械的なシミュレーション。流体の流れは、上から下と速度スケールには、m /秒である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
私たちは、複雑な生息地でバイオフィルムの発達を研究するための多孔質媒体を模倣シンプルなマイクロ流体デバイスを実証した。実験の結果を決定するいくつかの重要なステップがあります。彼らは、デバイスのジオメトリが含まれています。ポスト形状が変化することができますが、フォームにストリーマに十分な細孔空間が必要である。また、Valiei ら 1はストリーマの形成のみを特定の流量範囲で起こることを実証している。閾値よりも低い流速で、ストリーマへのバイオフィルムの変形が観察されない場合がある。まだ別の特定の閾値流量値、バイオフィルムの破壊がストリーマの形成を可能に支配することができず、上記の。これらの実験を悩まできるもう一つの問題は、マイクロピラーアレイ中に溜まったガスの気泡である。通常、これらの気泡が所望の値に次第に減少最初に、次に、流量を増加させることによって除去しなければならない。
マイクロ流体プラットフォームこれらのような、いくつかの利点といくつかの制限があります。プラットフォームは、小さな培養容量で動作することを可能にし、ユーザ定義の特徴を組み込んだの柔軟性を有する。例えば、異なる多孔質構造は、マイクロピラーアレイの幾何学的パラメータを変更することによってシミュレートすることができる。実際の多孔質媒体のランダム構造を模倣さえ構造は、マイクロ流体プラットフォーム18上に作製することができる。さらに、いくつかのそのようなチャネルは、正確な統計分析のための重要な関連データの収集を可能にする単一のデバイス上で実施することができる。しかし、マイクロ流体システムは、典型的には多孔質媒体の二次元構造を模倣する。多孔質媒体の三次元的性質を模倣することができるデバイスは、通常、製造が非常に困難である。
ストリーマの形成と進化はまだよく理解されていない、さらに研究がこの方向に必要とされる。ストリーマが形成さと形式につながる方法を理解成熟したバイオフィルム構造のイオンは、心臓ステント、土壌中のバイオフィルム、及び濾過システムなどの生物医学装置の目詰まりなど、さまざまなシナリオに関連するであろう。当社のマイクロ流体プラットフォームは、その方向への一歩である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
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