Protocole pour la formation du biofilm Streamer dans un dispositif microfluidique avec micro-piliers
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
Plusieurs espèces bactériennes possèdent la capacité de se fixer sur les surfaces et dans les coloniser la forme de films minces appelées biofilms. Les biofilms qui se développent dans les milieux poreux sont pertinentes pour plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement des eaux usées et séquestration du CO 2. Nous avons utilisé Pseudomonas fluorescens, une bactérie aérobie Gram-négatif, à étudier la formation de biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite les milieux poreux. Dispositif microfluidique est constituée d'une matrice de micro-messages, qui ont été fabriqués en utilisant la lithographie molle. Par la suite, la formation de biofilms dans ces dispositifs à écoulement a été étudiée et nous démontrons la formation de biofilms filamenteux appelés banderoles dans notre dispositif. Les protocoles détaillés pour la fabrication et l'assemblage de dispositif microfluidique sont fournis ici avec les protocoles de culture bactérienne. Les procédures détaillées pour l'expérimentation avec le dispositif microfluidique sont également présentées, ainsi que représentantrésultats.
Introduction
Récemment, nous avons démontré bactériennes dynamique de formation d'un biofilm dans un dispositif microfluidique qui imite un milieu poreux 1. Les biofilms bactériens sont essentiellement des colonies de bactéries de surface agrégées qui sont encastrés par des substances polymériques extracellulaires (EPS) 2-4. Ces films minces de bactéries peuvent se former dans presque toutes les niches imaginables allant de surfaces lisses à l'habitat beaucoup plus complexe de milieux poreux. Valiei et al. 1 a utilisé un dispositif microfluidique avec une matrice de micro-piliers pour simuler une structure de support poreuse et a étudié la formation de biofilms dans ce dispositif en fonction du débit de fluide. Ils ont constaté que dans un certain régime d'écoulement, les biofilms filamenteux appelés banderoles ont commencé à émerger entre les différents piliers. Les banderoles peuvent être attachés à une ou deux extrémités de surfaces solides, mais le reste de la structure est suspendue dans un liquide. Serpentin formation commence typiquement après une première couche de biofilm est formé et son formation peut dicter l'évolution à long terme de biofilm dans des habitats complexes. Récemment, plusieurs chercheurs ont étudié la dynamique de la formation de banderoles. Yazdi et al. 5 a montré que les banderoles peuvent se former dans les flux tourbillonnaire provenant d'une bulle oscillante. Dans une autre expérience, Rusconi et al. Six étudié l'effet de la courbure de la voie et de la géométrie de la voie de la formation de flammes. Ils ont constaté que les flammes peuvent se former dans les sections courbes de microcanaux, et streamer morphologie est liée à la mobilité. Des recherches récentes ont démontré que les banderoles peuvent avoir d'importantes répercussions dans divers scénarios naturels et artificiels, car ils peuvent agir comme précurseurs pour la formation de structures matures dans les interfaces poreuses, conduire à une prolifération rapide et catastrophique biofilm dans un systèmes biomédicaux, et aussi causer accréditives importante interactions de structure, etc 1,7-9.
banderoles de biofilms forment souvent ihabitats n complexes tels que les milieux poreux. La croissance du biofilm compréhension poreux environnement médiatique est pertinente à plusieurs procédés industriels et environnementaux tels que le traitement biologique des eaux usées 10, le maintien du bien-alésage intégrité dans des situations comme capture du CO 2 11 et le colmatage des pores dans le sol 12. Observer la formation de biofilm dans ces habitats complexes peut souvent être difficile en raison de l'opacité du milieu poreux. Dans de telles situations, les plates-formes de médias poreux microfluidiques à base peuvent s'avérer extrêmement avantageux car ils permettent en temps réel et le suivi in situ. Un autre avantage de la microfluidique est la possibilité de construire plusieurs bioréacteurs sur une seule plate-forme de bio-microfluidique et en même temps permettre le suivi et / ou l'intégration de capteurs en ligne. La flexibilité de mettre en œuvre des expériences de laboratoire multiples dans un seul appareil et la capacité de recueillir des données pertinentes importantes pour l'analyse statistique précise est une importante advantage de systèmes microfluidiques 13,14.
Dans le contexte de la discussion ci-dessus, la compréhension dynamique de formation de banderoles dans un environnement de milieux poreux serait bénéfique à plusieurs applications. Dans cette étude, nous développons le protocole d'enquête pour la formation de banderoles dans un appareil qui imite les milieux poreux. La fabrication de la plate-forme microfluidique, les mesures nécessaires pour la culture cellulaire et l'expérimentation est décrite. Dans nos expériences, la souche bactérienne de type sauvage de Pseudomonas fluorescens a été utilisé. P. fluorescens, qui se trouve naturellement dans le sol, joue un rôle clé dans le maintien de l'écologie du sol 15. La souche bactérienne utilisée a été génétiquement modifié pour exprimer la protéine fluorescente verte (GFP) constitutive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré un dispositif microfluidique simple qui imite les milieux poreux pour étudier le développement de biofilm dans des habitats complexes. Il ya plusieurs étapes critiques qui dictent les résultats des expériences. Ils comprennent la géométrie de l'appareil. Alors que la géométrie de poste peut varier, pores suffisamment d'espace pour banderoles pour former est nécessaire. En outre, Valiei et al. 1 ont démontré que la formation de banderoles a lieu seulement dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
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