Abstract
कई बैक्टीरियल प्रजातियों सतहों को देते हैं और biofilms बुलाया पतली फिल्मों के रूप में उन्हें उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता होती है. झरझरा मीडिया में बढ़ने कि biofilms ऐसे अपशिष्ट उपचार और सीओ 2 ज़ब्ती के रूप में कई औद्योगिक और पर्यावरण प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक हैं. हम चाहते हैं कि mimics झरझरा मीडिया एक microfluidic डिवाइस में biofilm गठन जांच करने के लिए, स्यूडोमोनास fluorescens एक ग्राम नकारात्मक एरोबिक जीवाणु का इस्तेमाल किया. microfluidic डिवाइस नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर गढ़े गए थे जो सूक्ष्म पदों की एक सरणी के होते हैं. इसके बाद, प्रवाह के साथ इन उपकरणों में biofilm गठन जांच की गई है और हम अपने डिवाइस में स्ट्रीमर के रूप में जाना filamentous biofilms के गठन को प्रदर्शित करता है. निर्माण और microfluidic डिवाइस की विधानसभा के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल जीवाणु संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ साथ यहां प्रदान की जाती हैं. Microfluidic डिवाइस के साथ प्रयोग के लिए विस्तृत प्रक्रिया भी प्रतिनिधि के साथ प्रस्तुत कर रहे हैंपरिणाम है.
Introduction
हाल ही में, हम झरझरा मीडिया 1 mimics कि एक microfluidic डिवाइस में जीवाणु biofilm गठन की गतिशीलता का प्रदर्शन किया. बैक्टीरियल biofilms अनिवार्य रूप से बाह्य बहुलक पदार्थों (ईपीएस) 2-4 से रखा जाता है कि सतह एकत्रित बैक्टीरिया की कालोनियों हैं. बैक्टीरिया के इन फिल्मों पतली चिकनी सतहों से झरझरा मीडिया की बहुत अधिक जटिल निवास स्थान से लेकर लगभग हर कल्पनीय आला में फार्म कर सकते हैं. Valiei एट अल. 1 एक झरझरा मीडिया संरचना अनुकरण सूक्ष्म स्तंभों में से एक सरणी के साथ एक microfluidic डिवाइस का इस्तेमाल किया और द्रव का प्रवाह दर के एक समारोह के रूप में इस डिवाइस में biofilm गठन का अध्ययन किया. वे एक निश्चित प्रवाह शासन में, स्ट्रीमर के रूप में जाना filamentous biofilms विभिन्न स्तंभों के बीच उभरने लगे कि पाया. स्ट्रीमर एक पर सीमित किया जा सकता है या दोनों ठोस सतहों के लिए समाप्त हो जाती है, लेकिन संरचना के बाकी तरल में निलंबित कर दिया है. किरण गठन आम तौर पर शुरू होता है biofilm की एक प्रारंभिक परत का गठन और उसके स्वरूप के बादआयन ऐसी जटिल निवास में biofilm की लंबी अवधि के विकास निर्देशित कर सकते हैं. हाल ही में, कई शोधकर्ताओं किरण गठन की गतिशीलता की जांच की है. Yazdi एट अल. 5 स्ट्रीमर एक oscillating बुलबुला से होने वाले vortical प्रवाह में फार्म कर सकते हैं कि पता चला है. एक अन्य प्रयोग में, RUSCONI एट अल. 6 स्ट्रीमर के गठन पर चैनल वक्रता और चैनल ज्यामिति के प्रभाव की जांच की. वे स्ट्रीमर microchannels की घुमावदार वर्गों में फार्म कर सकते हैं कि पाया, और किरण आकारिकी गतिशीलता से संबंधित है. हाल के शोध स्ट्रीमर वे झरझरा इंटरफेस में परिपक्व संरचनाओं के गठन के लिए व्यापारियों के रूप में कार्य कर सकते हैं, विभिन्न प्राकृतिक और कृत्रिम स्थितियों में व्यापक असर हो एक जैव चिकित्सा प्रणालियों में तेजी और आपत्तिजनक biofilm प्रसार करने के लिए नेतृत्व, और भी काफी flow- पैदा कर सकता है कि प्रदर्शन किया है संरचना बातचीत, आदि 1,7-9.
Biofilm स्ट्रीमर अक्सर मैं फार्मऐसे झरझरा मीडिया के रूप में एन जटिल निवास. झरझरा मीडिया वातावरण में समझौता biofilm विकास जैसे CO2 कब्जा 11 के रूप स्थितियों में अच्छी तरह से बोर अखंडता को बनाए रखने और मिट्टी 12 में pores के plugging जैविक अपशिष्ट उपचार 10, के रूप में कई पर्यावरण और औद्योगिक प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है. ऐसे जटिल निवास में biofilm गठन अवलोकन कारण अक्सर झरझरा मीडिया की अस्पष्टता के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. वे वास्तविक समय और सीटू की निगरानी में की अनुमति के रूप में ऐसी स्थितियों में, microfluidics आधारित झरझरा मीडिया प्लेटफॉर्म बेहद फायदेमंद साबित हो सकता है. Microfluidics का एक अन्य लाभ यह है कि एक भी जैव microfluidic मंच पर कई बायोरिएक्टर का निर्माण और एक साथ ऑनलाइन निगरानी और / या सेंसर के समावेश के लिए अनुमति देने की क्षमता है. एक डिवाइस और सटीक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण प्रासंगिक डेटा इकट्ठा करने की क्षमता में कई प्रयोगशाला प्रयोगों को लागू करने के लिए लचीलापन एक महत्वपूर्ण एडीवी हैmicrofluidic सिस्टम 13,14 के antage.
ऊपर चर्चा के संदर्भ में, एक झरझरा मीडिया वातावरण में समझ की किरण गठन गतिशीलता कई अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद होगा. इस अध्ययन में, हम कि mimics झरझरा मीडिया एक डिवाइस में प्रकाश की किरण के गठन की जांच के लिए प्रोटोकॉल का विकास. Microfluidic मंच का निर्माण, सेल संस्कृति और प्रयोग के लिए आवश्यक कदम वर्णित हैं. हमारे प्रयोगों में, स्यूडोमोनास fluorescens के जंगली प्रकार बैक्टीरियल तनाव में कार्यरत था. पी मिट्टी में प्राकृतिक रूप से पाया fluorescens, मिट्टी पारिस्थितिकी 15 को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. नियोजित बैक्टीरियल तनाव आनुवंशिक रूप अनिवार्यता से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया गया था.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नीचे वर्णित क्रम में यहां प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करना. Microfluidic मंच बनाने के लिए microfabrication प्रोटोकॉल 1 चरण 2 जीवाणु संस्कृति प्रोटोकॉल (चित्रा 2) का वर्णन है, और चरण 3 प्रयोगात्मक सेटअप (चित्रा 3) के विधानसभा से संबंधित चरण में चर्चा कर रहे हैं. अंत में, वास्तविक प्रयोगात्मक कदम चरण 4 में वर्णित है.
1 चिप निर्माण की प्रक्रिया
नोट: उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं नीचे वर्णित प्रक्रियाओं के लिए पालन किया जाना चाहिए. जानकारी के लिए संस्थागत सुरक्षा अधिकारी से परामर्श करें.
- एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे, एल संपादित) के साथ मुखौटा डिजाइन. चैनल डिजाइन चौड़ाई 625 मीटर की एक मुख्य सूक्ष्म चैनल के होते हैं. चैनल के मध्य क्षेत्र व्यास में 50 माइक्रोन, (पूरक फाइलों को देखने) के अलावा 25 माइक्रोन से स्थान सूक्ष्म पदों की एक सरणी शामिल हैं.
- कांच पर इस डिजाइन प्रिंट (5 "एक्स 5" सोडा नींबू गिलास), "0.09 की मोटाई है और एक फोटो मुखौटा तैयार करने के क्रम में मास्किंग का उपयोग, क्रोमियम (सीआर) के लगभग 70 एनएम मोटी परत से लेपित है. उपयोग AZ400K डेवलपर 1 मिनट के लिए है. फिर, सीआर एचेंट का उपयोग करोड़ परत खोदना के बारे में 1 मिनट के लिए विरोध और ठंड पिरान्हा समाधान के साथ साफ पट्टी एसीटोन का प्रयोग करें. (एच 2 एसओ 4 और एच 2 3 के अनुपात में ओ 2: 1).
- Photolithography
- 20 मिनट के लिए पिरान्हा समाधान के साथ रासायनिक एक मानक 4 "सिलिकॉन वेफर साफ करें.
- डि पानी के साथ वेफर कुल्ला और सूखी.
- एक गर्म प्लेट (15 मिनट के लिए 200 डिग्री सेल्सियस) पर वेफर गरम करें.
- कोट photoresist के साथ सिलिकॉन वेफर. इधर, सकारात्मक photoresist AZ4620 एक 12.5 माइक्रोन मोटी परत प्राप्त करने के लिए 25 सेकंड के लिए 2,000 rpm पर एक सिलिकॉन वेफर पर स्पिन लेपित किया गया था.
- 100 डिग्री सेल्सियस पर नाइट्रोजन प्रवाह पर 90 सेकंड के लिए वेफर चल द्वारा एक गर्म थाली पर वेफर के नरम पाक से सभी विलायक निकालें. फिर, टी में निर्वात में रखना60 सेकंड के लिए वह एक ही तापमान.
- निर्जलीकरण के लिए 24 घंटे के लिए एक अंधेरे बॉक्स में वेफर रखें.
- Photoresist करने के लिए डिजाइन पैटर्न का हस्तांतरण करने के क्रम में पराबैंगनी प्रकाश में वेफर बेनकाब.
- 240 सेकंड के लिए photoresist डेवलपर समाधान (AZ400K) में वेफर विसर्जित कर दिया. फिर, isopropyl शराब के साथ वेफर कुल्ला और नाइट्रोजन गैस की एक धारा में रखकर यह सूखी.
- आईसीपी DRIE (उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा - दीप प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी) प्रक्रिया
- DRIE नक़्क़ाशी लागू करें. डिवाइस के लिए आवश्यक अंतिम गहराई (इस जांच में 50 माइक्रोन) के अनुसार उपयुक्त खोदना गहराई चुनें. Photoresist इस प्रक्रिया के दौरान एक मास्किंग परत के रूप में कार्य करता है.
- एसीटोन के साथ शेष photoresist निकालें और वेफर साफ.
- PDMS (polydimethylsiloxane) कास्टिंग
- सिलिकॉन मास्टर मोल्ड silanizing लिए trichloromethylsilane (TCMS) का प्रयोग करें. एक शीशी में trichloromethylsilane के 2 या 3 बूँदें डालो और बगल में एक desiccator में जगहसिलिकॉन मास्टर मोल्ड. Silanizing प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 2-3 घंटे की अनुमति दें.
- PDMS तैयार करने के लिए 1: एक अलग कंटेनर में, 10 का वजन अनुपात से इलाज के एजेंट के साथ 184 Sylgard सिलिकॉन आधार मिश्रण. स्थितियां (लगभग 2 घंटा) वैक्यूम करने के लिए यह subjecting द्वारा PDMS देगास.
- एक धारक में सिलिकॉन मास्टर मोल्ड रखो. फिर, PDMS स्टांप के लिए फार्म सिलिकॉन मास्टर मोल्ड पर PDMS डालना. बुलबुले इस प्रक्रिया के दौरान PDMS में फार्म नहीं है कि यह सुनिश्चित करें.
- 80 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए PDMS इलाज.
- पील मास्टर मोल्ड से PDMS स्टांप बंद. फिर, PDMS अलग माइक्रोचिप्स में टिकट काट दिया. अंत में, प्रवेश (एस) और आउटलेट (ओं) के लिए छेद ड्रिल करने के लिए एक काटने कोर का उपयोग करें.
- कांच के लिए PDMS के संबंध
- 30 सेकंड के लिए ऑक्सीजन प्लाज्मा को कवर पर्ची और PDMS स्टांप बेनकाब. कवर पर्ची के लिए बॉण्ड PDMS स्टांप.
- PDMS स्टांप और कवर पर्ची के बीच उचित सील को प्राप्त करने के लिए, 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में डाल कर डिवाइस पानी रखना.
2 जीवाणु संस्कृति
नोट: उचित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल कदम 2-4 के लिए पीछा किया जाना चाहिए. जानकारी के लिए संस्थागत सुरक्षा अधिकारी से परामर्श करें.
- लेग अगर प्लेटों की तैयारी
- एक 1 एल कुप्पी को 20 ग्राम Luria-Bertani (पौंड) अगर (मिलर) पाउडर और ultrapure पानी की 500 मिलीलीटर जोड़ें. पाउडर भंग करने के लिए हलचल.
- 15 साई, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
- कुप्पी एक बेंच पर या जैव सुरक्षा हुड में एक पानी के स्नान में 50-55 डिग्री सेल्सियस तक नीचे शांत करने के लिए अनुमति दें.
- 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक टेट्रासाइक्लिन जोड़ें. घूमता द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
- प्लेटों में मिश्रण डालो. पूर्ण 2/3 - 1/2 तक प्रत्येक प्लेट भरें.
- ज्वाला हवा वे फार्म अगर उन्हें पॉप संक्षिप्त बुलबुले. जम हवाई बुलबुले से अधिक जीवाणु संस्कृति का प्रसार करने के लिए मुश्किल हैं.
- प्लेटें रात भर कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें.
- वे शांत हैं,, उनकी आस्तीन में वापस प्लेटें डाल 4 डिग्री सेल्सियस पर बैग, लेबल (एंटीबायोटिक और तारीख), और दुकान सील.
नोट: प्रकाश कई एंटीबायोटिक दवाओं के निष्क्रिय रूप में, टिन पन्नी के साथ प्लेटों का जायजा कवर.
- लेग शोरबा तैयारी
- 20 ग्राम Luria-Bertani (पौंड) शोरबा (मिलर) पाउडर और एक कुप्पी को ultrapure पानी का 1 एल जोड़ें. पाउडर भंग करने के लिए हलचल.
- 15 साई, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा जीवाणुरहित.
- कुप्पी एक बेंच पर या जैव सुरक्षा हुड में एक पानी के स्नान में 50-55 डिग्री सेल्सियस तक नीचे शांत करने के लिए अनुमति दें.
- 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए एंटीबायोटिक टेट्रासाइक्लिन जोड़ें. घूमता द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
- जब शांत, 4 डिग्री सेल्सियस पर लेबल की बोतल रखें.
नोट: प्रकाश कई एंटीबायोटिक दवाओं के निष्क्रिय रूप में, टिन पन्नी के साथ बोतल कवर.
- एक लेग अगर प्लेट पर संस्कृति बैक्टीरिया (इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है स्यूडोमोनास fluorescens)
- (फ्रीजर से -80 डिग्री बैक्टीरियल जायजा ले लो; सी) और बर्फ पर जगह है.
- -80 डिग्री सेल्सियस बैक्टीरियल शेयर और एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर एक लेग अगर प्लेट रखें.
- स्ट्रीक एक वक्र पैटर्न में एक लेग अगर थाली पर बैक्टीरियल तनाव. अगर प्लेट कवर और रातोंरात 30 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं. अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्रिज में थाली की दुकान.
- बैक्टीरियल समाधान तैयार (S1)
- एक autoclaved फ्लास्क 50 मिलीलीटर लेग शोरबा मीडिया डालो. एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर यह कार्रवाई.
- फ्लास्क लेग अगर थाली से एक भी जीवाणु कॉलोनी स्थानांतरण. इस आपरेशन भी एक जैव सुरक्षा हुड के अंदर किया जाना चाहिए.
- 30 डिग्री सेल्सियस और पर्याप्त समय (4 घंटा) के लिए 150 rpm पर एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में कुप्पी रखो.
- पतला बैक्टीरियल समाधान (S2) तैयार करें
- एक निष्फल प्लास्टिक ट्यूब में 5 एमएल लेग शोरबा मीडिया डालो.
- लेग शोरबा मीडिया के साथ मिश्रण से S1 पतला. फिर, समाधान भंवर. समाधान वांछित ऑप्टिक प्राप्त पतलाअल घनत्व (आयुध डिपो 600 एनएम = 0.1 पर मापा जाता है).
नोट: Biofilm प्रयोगों आम तौर पर इस इलाके में आयुध डिपो मूल्यों को रोजगार.
3 प्रायोगिक सेटअप तैयार
- का प्रयोग चिमटी माइक्रोचिप का प्रवेश (एस) और आउटलेट (ओं) में लचीले प्लास्टिक ट्यूब (0.20 "आईडी) कनेक्ट. Inlets और दुकानों पहले से माइक्रोचिप (चरण 1.5.5) का PDMS हिस्से में drilled गया. इस जांच में माइक्रोचिप दो inlets और एक दुकान के होते हैं.
- बैक्टीरियल समाधान (S2 समाधान) के साथ सिरिंज (एस) भरें और सिरिंज (एस) के सभी बुलबुले को दूर.
- इनलेट ट्यूब (ओं) में सिरिंज टिप (ओं) (30 ग्राम 0.5 "कुंद सुई) से कनेक्ट करें. फिर, कंटेनर बर्बाद करने के लिए आउटलेट ट्यूब (ओं) को जोड़ने.
4 प्रयोग चलाने
- सिरिंज टिप (ओं) के लिए सिरिंज (एस) से कनेक्ट करें.
- सिरिंज पंप पर प्लेस और तय सिरिंज (एस). फिर DESIR के उद्देश्य लेंस के साथ एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोचिप जगहएड बढ़ाई (जैसे, 40X). बैक्टीरियल वृद्धि (पी के लिए 30 डिग्री सेल्सियस fluorescens) के लिए एक निरंतर तापमान वातावरण बनाए रखने के लिए एक जीवित कोशिका कक्ष डिवाइस के साथ माइक्रोचिप कवर.
- वांछित प्रवाह दर के स्तर को पंप कहना है (10 μl / घंटा) सेट और तरल पदार्थ पंप आरंभ.
- बैक्टीरिया चेंबर में पेश कर रहे हैं एक बार, biofilm गठन भी शुरू की है. Biofilm गठन और परिपक्वता आम तौर पर कई घंटे या दिन की अवधि में पाए जाते हैं. निरीक्षण और माइक्रोस्कोप के माध्यम से biofilm विकास की छवियों को ले.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ऊपर उल्लेख किया microfabrication प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक PDMS आधारित microfluidic युक्ति का निर्माण किया गया था. 1 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) PDMS की छवियों से पता चलता है युक्ति. चित्रा 1 ए डिवाइस के द्वार अनुभाग दिखाता है. एक कांटा की तरह प्रवेश द्वार डिवाइस भर में दबाव सिर बराबर करने के लिए बनाई गई है. इसके अलावा SEM इमेजिंग भी स्तंभ दीवारों (चित्रा 1 बी) लगभग खड़ी कर रहे हैं कि पता चला है. सुसंस्कृत बैक्टीरियल समाधान (चित्रा 2) पतला था और अपनी ऑप्टिकल घनत्व 0.1 के मूल्य को समायोजित किया गया. हम निवेश प्रवाह की दर के एक समारोह के रूप में microfluidic डिवाइस में biofilm गठन की जांच की. जब पी fluorescens 0.8 μl / घंटा, बैक्टीरियल लगाव की एक कम प्रवाह दर पर डिवाइस में इंजेक्ट किया गया था और biofilm गठन डिवाइस की दीवारों पर हुई. यहां तक कि समय की एक लम्बी अवधि (> 20 घंटे) के बाद, सतह से चिपके biofilms के अलावा अन्य कोई अन्य बैक्टीरियल संरचनाओं हमफिर से मनाया. इसके बाद, एक ही प्रयोग 8 μl / घंटा की एक प्रवाह दर पर दोहराया गया था. इस मामले में, biofilm गठन फिर से पतला जीवाणु संस्कृति के अर्क के कुछ ही मिनटों के बाद शुरू कर दिया. हालांकि, कुछ ही घंटों के बाद, सूक्ष्म स्तंभों के बीच विस्तार filamentous संरचनाओं की उपस्थिति डिवाइस (चित्रा 4) के मध्य वर्ग के पास मनाया गया. इन filamentous संरचनाओं स्थिर बैक्टीरिया की उपस्थिति के माध्यम से कल्पना की जा सकती है. इन संरचनाओं स्ट्रीमर के रूप में जाना जाता है और वे केवल एक में सीमित या दोनों सतहों को समाप्त कर रहे हैं कि filamentous biofilms हैं. संरचना के बाकी अक्सर (इस मामले में) के रूप में तरल माध्यम में निलंबित कर दिया है. 4 biofilm किरण संरचना के समय विकास से पता चलता है. स्ट्रीमर आमतौर पर Visco लोचदार biofilm पर द्रव कतरनी के प्रभाव के कारण के रूप में. 5 स्तंभों में से एक श्रृंखला में पिछले प्रवाह के लिए सुव्यवस्थित और वेग स्वरूप पता चलता है. सिमुलेशन कि स्ट्रीमर से पता चलता है किहमारे microfluidic प्रणाली में फार्म अनिवार्य रूप से तरल पदार्थ बह साथ गठबंधन कर रहे हैं. प्रवाह संरचनाओं और biofilm स्ट्रीमर के गठन के बीच संबंध अभी तक अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. हालांकि, दास और कुमार 16 हाल ही में इन स्ट्रीमर आंतरिक रूप से viscoelastic biofilms के अत्यधिक चिपचिपा तरल राज्य के रूप में है कि फार्म का प्रस्ताव किया है. वे biofilm किरण गठन के समय पैमाने पर आम तौर पर दूर biofilms के viscoelastic विश्राम का समय तराजू से अधिक है कि अवलोकन पर उनके अनुमान आधारित. Biofilms रूप viscoelastic तरल पदार्थ व्यवहार करने के लिए जाना जाता है और इसलिए viscoelastic विश्राम का समय पैमाने की तुलना में काफी बड़ा समय तराजू पर, वे अनिवार्य रूप अत्यधिक चिपचिपा तरल पदार्थ 17 से व्यवहार कर रहे हैं. इस निर्माण के अनुसार, स्ट्रीमर. उच्च कतरनी तनाव के स्थानों पर ही शुरू होने की उम्मीद 5 चैनल में उच्च वेग के स्थानों से पता चलता है, और इन स्थानों उच्च कतरनी तनाव के स्थानों के साथ मेल किया जा सकता है. प्रारंभिक संसदीय सौध में विकास के एसई, स्ट्रीमर इन स्थानों (चित्रा 4) के पास ही शुरू करने के लिए मनाया जाता है.
Microfluidic चैनल (शीर्ष दृश्य) की संख्या 1 स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) छवियों. एक) इनलेट अनुभाग, सूक्ष्म खंभे युक्त ख) क्षेत्र. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
जीवाणु संस्कृति में शामिल 2 अनुक्रमिक चरणों चित्रा. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 microfluidic प्रयोगों के लिए स्थापित की. 1 ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (उल्टे), 2-सिरिंज पंप, 3 छवि और डाटा अधिग्रहण, (वैकल्पिक) 4-सिरिंज युक्त डाई, 5 सिरिंज युक्त बैक्टीरिया, 6-अपशिष्ट जलाशय. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
स्ट्रीमर की विकास की चित्रा 4 समय चूक confocal इमेजिंग. छवि विमान = Z करने के लिए डिवाइस के 25 माइक्रोन यानी बीच मेल खाती है. धराशायी ellipses biofilm स्ट्रीमर प्रदर्शित करता है. क्लिक करेंयहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्रा सूक्ष्म खंभे पिछले प्रवाह के streamlines और वेग आकृति दिखा 5 कम्प्यूटेशनल द्रव यांत्रिक सिमुलेशन. द्रव का प्रवाह नीचे और वेग पैमाने ऊपर से है मी / सेकंड में है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम जटिल निवास में biofilm विकास के अध्ययन के लिए झरझरा मीडिया mimics कि एक साधारण microfluidic डिवाइस का प्रदर्शन किया. प्रयोगों के परिणाम हुक्म है कि कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. वे डिवाइस ज्यामिति शामिल हैं. पोस्ट ज्यामिति बदल सकते हैं, स्ट्रीमर फार्म करने के लिए पर्याप्त ताकना अंतरिक्ष आवश्यक है. इसके अलावा, Valiei एट अल. 1 किरण गठन केवल एक निश्चित प्रवाह की दर रेंज में होता है कि प्रदर्शन किया है. एक सीमा मूल्य से कम प्रवाह दरों पर, स्ट्रीमर में biofilms के विरूपण देखा नहीं जा सकता. अभी तक एक निश्चित एक और सीमा प्रवाह दर मूल्य से ऊपर, biofilm फ्रैक्चर हावी है और स्ट्रीमर के गठन की अनुमति नहीं दे सकते. इन प्रयोगों प्लेग कर सकते हैं कि एक और मुद्दा सूक्ष्म स्तंभ सरणी में फँस सकता है कि गैस के बुलबुले है. आमतौर पर इन बुलबुले वांछित मूल्य के लिए यह कम धीरे धीरे फिर शुरू में प्रवाह की दर में वृद्धि और से हटाया जाना है.
Microfluidic प्लेटफार्मोंजैसे इन कई फायदे और कुछ सीमाओं प्रदान करते हैं. मंच छोटे संस्कृति संस्करणों के साथ काम करने के लिए सक्षम बनाता है, और उपयोगकर्ता के परिभाषित सुविधाओं को शामिल करने का लचीलापन है. उदाहरण के लिए, विभिन्न झरझरा संरचनाओं सूक्ष्म स्तंभ सरणी के ज्यामितीय मापदंडों बदलकर प्रेरित किया जा सकता है. असली झरझरा मीडिया के यादृच्छिक संरचना की नकल है कि यहां तक कि संरचनाओं microfluidic प्लेटफॉर्म 18 पर निर्मित किया जा सकता है. इसके अलावा, कई ऐसे चैनलों सटीक सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण प्रासंगिक डेटा के संग्रह के लिए अनुमति देता है एक डिवाइस पर लागू किया जा सकता है. हालांकि, microfluidic प्रणालियों आमतौर पर झरझरा मीडिया की दो आयामी संरचना की नकल. झरझरा मीडिया के तीन आयामी प्रकृति की नकल कर सकते हैं कि उपकरणों आमतौर पर निर्माण करने के लिए काफी चुनौतीपूर्ण हैं.
स्ट्रीमर के गठन और विकास अच्छी तरह से अभी तक समझ नहीं रहे हैं, और अधिक अनुसंधान इस दिशा में आवश्यक है. स्ट्रीमर फार्म और प्रारूप करने के लिए नेतृत्व की समझपरिपक्व biofilm संरचनाओं के आयन ऐसे दिल स्टंट्स, मिट्टी में biofilms, और निस्पंदन सिस्टम के रूप में जैव चिकित्सा उपकरणों के clogging सहित परिदृश्यों की एक विस्तृत विविधता के लिए प्रासंगिक हो जाएगा. हमारे microfluidic मंच कि दिशा में एक कदम है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
