Abstract
Diverse specie batteriche possiedono la capacità di attaccare alle superfici e colonizzare in forma di film sottili chiamati biofilm. I biofilm che crescono in mezzi porosi sono rilevanti per diversi processi industriali e ambientali come il trattamento delle acque reflue e di CO 2 sequestro. Abbiamo usato Pseudomonas fluorescens, un batterio aerobico Gram-negativi, per indagare la formazione di biofilm in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi. Il dispositivo di microfluidica è costituito da una serie di micro-posti, che sono stati fabbricati utilizzando soft-litografia. In seguito, la formazione di biofilm in questi dispositivi a flusso è stato studiato e ci dimostrano la formazione di biofilm filamentosi note come stelle filanti nel nostro dispositivo. Qui vengono fornite insieme ai protocolli di coltura batterica I protocolli dettagliati per la fabbricazione e l'assemblaggio del dispositivo di microfluidica. Le procedure dettagliate per la sperimentazione con il dispositivo di microfluidica sono anche presentati insieme con il rappresentanterisultati.
Introduction
Recentemente, abbiamo dimostrato la dinamica di formazione di biofilm batterici in un dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi 1. Biofilm batterici sono essenzialmente colonie di batteri di superficie aggregati che sono racchiusi da sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 2-4. Questi film sottili di batteri possono formare in quasi ogni nicchia immaginabile che vanno da superfici lisce all'habitat molto più complesso di mezzi porosi. Valiei et al. 1 usato un dispositivo microfluidico con una matrice di micro-pilastro per simulare una struttura di supporto porosa e studiato la formazione di biofilm in questo dispositivo in funzione della portata del fluido. Essi hanno scoperto che in un certo regime di flusso, biofilm filamentosi noti come stelle filanti hanno cominciato ad emergere tra i diversi pilastri. Streamers possono essere legati ad una o entrambe le estremità per superfici solide, ma il resto della struttura è sospesa in un liquido. Formazione Streamer inizia in genere dopo un primo strato di biofilm ha formato e il suo formatoione può dettare l'evoluzione a lungo termine di biofilm in tali habitat complessi. Recentemente, alcuni ricercatori hanno studiato le dinamiche di formazione streamer. Yazdi et al. 5 ha mostrato che le fiamme possono formare nei flussi vorticosi provenienti da una bolla oscillante. In un altro esperimento, Rusconi et al. 6 studiato l'effetto di curvatura del canale e della geometria del canale sulla formazione di stelle filanti. Essi hanno scoperto che le fiamme possono formare nelle sezioni curve di microcanali, e streamer morfologia è correlata alla motilità. Recenti ricerche hanno dimostrato che le fiamme possono avere ampie ripercussioni in vari scenari naturali e artificiali in quanto possono fungere da precursori della formazione di strutture maturi in interfacce porosi, portare a una rapida e catastrofica proliferazione di biofilm in sistemi biomedici, e anche causare notevoli flow interazioni struttura, ecc 1,7-9.
Filanti Biofilm spesso formano ihabitat n complesse come mezzi porosi. Crescita biofilm intesa in ambiente mezzi porosi è rilevante per diversi processi ambientali e industriali come il trattamento biologico delle acque reflue 10, mantenendo ben-bore integrità in situazioni come la cattura di CO 2 11 e collegare dei pori nel terreno 12. Osservando la formazione di biofilm in tali habitat complessi spesso può essere difficile a causa della opacità dei mezzi porosi. In tali situazioni, le piattaforme multimediali porosi microfluidica base possono rivelarsi estremamente vantaggiosa in quanto consentono in tempo reale e monitoraggio in situ. Un altro vantaggio della microfluidica è la possibilità di costruire più bioreattori su un'unica piattaforma bio-microfluidica e contemporaneamente consentire il monitoraggio e / o integrazione di sensori on-line. La flessibilità per implementare più esperimenti di laboratorio in un unico dispositivo e la capacità di raccogliere importanti dati pertinenti per l'analisi statistica accurata è un adv importanteantage di sistemi microfluidici 13,14.
Nel contesto della discussione di cui sopra, le dinamiche di formazione streamer comprensione in un ambiente mezzi porosi sarebbe utile per diverse applicazioni. In questo studio, sviluppiamo il protocollo per indagare la formazione streamer in un dispositivo che imita mezzi porosi. Realizzazione della piattaforma microfluidica, sono descritti i passi necessari per la cultura e la sperimentazione di cellule. Nei nostri esperimenti, il ceppo batterico tipo selvaggio di Pseudomonas fluorescens è stato impiegato. P. fluorescens, che si trova naturalmente nel suolo, svolge un ruolo chiave nel mantenimento ecologia del suolo 15. Il ceppo batterico impiegato era stato geneticamente per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) costitutivamente.
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Protocol
Eseguire i protocolli sperimentali qui nell'ordine descritto di seguito. Protocolli di microfabbricazione per la creazione della piattaforma microfluidica sono discussi nel Passo 1 Passo 2 descrive il protocollo di coltura batterica (Figura 2), e punto 3 riguarda il montaggio del setup sperimentale (Figura 3). Infine, la fase sperimentale attuale è descritta al punto 4.
1 Chip Fabrication Procedura
NOTA: La corretta procedure di sicurezza devono essere seguite per i processi descritti di seguito. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli.
- Progettare la maschera con un software appropriato (ad esempio, L-Edit). La progettazione canale è composto da un micro-canale di larghezza di 625 micron. La regione centrale del canale contiene una serie di micro-messaggi di 50 micron di diametro, distanziati di 25 micron a parte (vedi Supplemental Files).
- Stampa questo disegno su vetro (5 "x 5" vetro soda lime), Che ha uno spessore di 0.09 "ed è rivestito da circa 70 nm spesso strato di cromo (Cr), utilizzando mascheratura per preparare una maschera fotografico. Autore Utilizzo AZ400K per 1 min. Poi, etch strato Cr utilizzando Cr mordenzante per circa 1 min Usare acetone per togliere il resistere e pulirlo con soluzione piranha freddo. (H 2 SO 4 e H 2 O 2 in un rapporto di 3: 1).
- Fotolitografia
- Pulire un wafer da 4 "silicio standard chimicamente con una soluzione piranha per 20 min.
- Sciacquare la cialda con acqua deionizzata e asciugare.
- Riscaldare il wafer su una piastra calda (200 ° C per 15 min).
- Rivestire il wafer di silicio con photoresist. Qui, il fotoresist AZ4620 positivo è stato spin-rivestito su un wafer di silicio a 2.000 rpm per 25 secondi per ottenere uno strato di spessore di 12,5 micron.
- Rimuovere tutto il solvente dalla cottura morbida della fetta su una piastra calda per galleggiamento della fetta per 90 secondi in flusso di azoto a 100 ° C. Poi, tenerlo in vuoto a tegli stessa temperatura per 60 sec.
- Posizionare la cialda in una scatola scura per 24 ore per disidratazione.
- Esporre il wafer alla luce UV per trasferire il pattern progettato per il fotoresist.
- Immergere il wafer in soluzione di sviluppo di fotoresist (AZ400K) per 240 sec. Poi, risciacquare il wafer con alcool isopropilico e asciugare mettendo in corrente di azoto.
- ICP-DRIE (plasma accoppiato induttivamente - Deep Reactive Ion Etching) Processo
- Applicare DRIE incisione. Scegliere la profondità etch appropriata in base alla profondità finale richiesta per il dispositivo (50 micron in questa indagine). Photoresist agisce come uno strato di mascheratura durante questo processo.
- Rimuovere il photoresist rimanente con acetone e pulire la cialda.
- PDMS (polidimetilsilossano) Casting
- Utilizzare trichloromethylsilane (TCMS) per silanizzanti stampo maestro di silicio. Versare 2 o 3 gocce di trichloromethylsilane in un flaconcino e metterlo in un essiccatore accanto alstampo maestro silicio. Consenti 2-3 ore per il processo silanizzante per completare.
- In un contenitore separato, mescolare la base di silicone Sylgard 184 con induritore dal rapporto in peso di 10: 1 per preparare PDMS. Degassarla PDMS sottoponendolo a vuoto condizioni (circa 2 ore).
- Mettete lo stampo maestro di silicio in un supporto. Poi, versare il PDMS sullo stampo maestro di silicio per formare il timbro PDMS. Assicurarsi che le bolle non si formano nei PDMS durante questo processo.
- Curare le PDMS per 2 ore a 80 ° C.
- Staccare il timbro PDMS dallo stampo master. Quindi, tagliare le PDMS bollo in microchip separati. Infine, utilizzare un nucleo di taglio per perforare fori per l'ingresso (s) e di uscita (s).
- Incollaggio di PDMS al vetro
- Esporre il vetrino e PDMS bollo di plasma di ossigeno per 30 sec. Legame PDMS bollo per la polizza di copertura.
- Per ottenere una corretta tenuta tra il timbro PDMS e il vetrino, temprare il dispositivo mettendolo in forno a 70 ° C per 10 min.
2 batterica Cultura
NOTA: i protocolli di corretta biosicurezza deve essere seguita per i passaggi 2-4. Consultare il responsabile della sicurezza istituzionale per i dettagli.
- Preparare piastre LB Agar
- Aggiungere 20 g di Luria-Bertani (LB) agar (Miller) polveri e 500 ml di acqua ultrapura per un pallone da 1 L. Mescolare per sciogliere la polvere.
- Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min.
- Lasciare raffreddare il pallone fino a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d'acqua nella cappa di biosicurezza.
- Aggiungere l'antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando.
- Versare il composto in lastre. Riempire ogni piatto fino a 1/2 - 2/3 pieno.
- Aria Fiamma bolle brevemente per farli scoppiare se fanno. Bolle d'aria solidificati sono difficili da diffondere la cultura batterica sopra.
- Lasciare le piastre a raffreddare a temperatura ambiente per una notte.
- Quando sono freschi,mettere lastre di nuovo nella loro manica, sigillare il sacchetto, etichetta (antibiotico e data), e conservare a 4 ° C.
NOTA: Coprire lo stock di piastre con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici.
- LB Broth Preparazione
- Aggiungere 20 g Luria-Bertani (LB) brodo (Miller) polveri e 1 L di acqua ultrapura in un pallone. Mescolare per sciogliere la polvere.
- Sterilizzare in autoclave a 15 psi, 121 ° C per 15 min.
- Lasciare pallone raffreddare a 50-55 ° C su una panchina o in un bagno d'acqua nella cappa di biosicurezza.
- Aggiungere l'antibiotico tetraciclina per ottenere una concentrazione finale di 50 mg / ml. Mescolare bene agitando.
- Lasciar raffreddare, posizionare la bottiglia etichettata a 4 ° C.
NOTA: Coprire la bottiglia con carta stagnola, come la luce disattiva molti antibiotici.
- Coltura dei batteri su una piastra di LB Agar (Questo protocollo utilizza Pseudomonas fluorescens)
- Prendete il magazzino batterica dal congelatore (-80 °, C) e posizionarlo sul ghiaccio.
- Posizionare l'° C magazzino batterica -80 e un piatto di agar LB all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Streak il ceppo batterico su una piastra di agar LB a zig-zag. Coprire la piastra di agar e incubare a 30 ° C durante la notte. Infine, riporre il piatto in frigorifero a 4 ° C.
- Preparare la soluzione batterica (S1)
- Versare 50 ml di brodo LB supporto a un pallone autoclavato. Eseguire questa operazione all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Trasferire una singola colonia batterica dalla piastra di agar LB al pallone. Questa operazione deve essere eseguita all'interno di una cappa di biosicurezza.
- Mettere il pallone in un incubatore shaker a 30 ° C e 150 rpm per un tempo adeguato (4 ore).
- Preparare la soluzione batterica Diluire (S2)
- Versare 5 ml di LB supporti brodo in un tubo di plastica sterilizzata.
- Diluire S1 mescolando con mezzi brodo LB. Quindi, agitare la soluzione. Diluire la soluzione raggiungere l'ottica desiderataAl densità (OD misurata a 600 nm = 0,1).
NOTA: esperimenti Biofilm tipicamente impiegano valori di OD in questa zona.
3 Preparare il setup sperimentale
- Utilizzando le pinzette collegano tubi di plastica flessibili (0.20 "ID) nella presa (s) e di uscita (s) del microchip. Gli ingressi e le uscite sono state precedentemente perforati nella porzione PDMS del microchip (fase 1.5.5). In questa indagine , il microchip è costituito da due ingressi ed una uscita.
- Riempire la siringa (s) con la soluzione batterica (soluzione S2) e rimuovere tutte le bolle nella siringa (s).
- Collegare punta della siringa (s) (30 G 0.5 "ago smussato) in tubo di ingresso (s). Quindi, collegare il tubo di uscita (s) per i rifiuti del contenitore.
4 Esecuzione dell'esperimento
- Collegare la siringa (s) per la punta della siringa (s).
- Luogo e siringa fix (s) sulla pompa a siringa. Poi mettere il microchip sotto un microscopio ottico con lenti dell'obiettivo di Desired ingrandimento (ad esempio, 40X). Coprire il microchip con un dispositivo di camera di cellule vive per mantenere un ambiente a temperatura costante per la crescita batterica (30 ° C per P. fluorescens).
- Impostare la pompa al livello di portata desiderata (per esempio 10 ml / ora) ed avviare il pompaggio del fluido.
- Una volta che i batteri vengono introdotti nella camera, è anche avviata la formazione di biofilm. Formazione di biofilm e maturazione si verificano in genere in un periodo di diverse ore o addirittura giorni. Osservare e prendere le immagini della crescita di biofilm attraverso il microscopio.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo microfabbricazione sopra menzionato, un dispositivo microfluidico basato PDMS è stato costruito. Figura 1 mostra il microscopio elettronico a scansione (SEM) immagini del PDMS dispositivo. Figura 1a mostra la sezione di ingresso del dispositivo. Un ingresso a forcella è stato creato per equalizzare la testa di pressione attraverso il dispositivo. Ulteriori immagini SEM ha anche mostrato che le pareti pilastro sono quasi verticale (Figura 1b). La soluzione di coltura batterica (Figura 2) è stato diluito e la sua densità ottica è stata regolata ad un valore di 0,1. Abbiamo esaminato formazione di biofilm nel dispositivo microfluidico in funzione della portata in ingresso. Quando P. fluorescens è stata iniettata nel dispositivo alla portata di 0,8 ml / h, l'attaccamento batterica bassa e la formazione di biofilm si è verificato alle pareti del dispositivo. Anche dopo un lungo periodo di tempo (> 20 ore), altre strutture batteriche diverse biofilm-abbracciare superficie chere osservato. Successivamente, lo stesso esperimento è stato ripetuto con una portata di 8 microlitri / hr. In questo caso, la formazione di biofilm nuovamente iniziata dopo pochi minuti di infusione della coltura batterica diluita. Tuttavia, dopo poche ore, comparsa di strutture filamentose che si estendono tra micro-pilastro è stato osservato nei pressi della parte centrale del dispositivo (figura 4). Tali strutture filamentose potrebbero essere visualizzati mediante la presenza di batteri immobili. Queste strutture sono conosciuti come stelle filanti e sono biofilm filamentose che sono legati solamente ad una o entrambe le estremità per le superfici. Il resto della struttura è spesso sospeso nel mezzo liquido (come in questo caso). Figura 4 mostra l'evoluzione temporale della struttura biofilm bandierina. Streamers solito formano per effetto del taglio fluido sul biofilm visco-elastico. Figura 5 mostra i filetti e profili di velocità di flusso attraverso una serie di pilastri. La simulazione mostra che le stelle filanti cheforma nel nostro sistema microfluidica sono sostanzialmente allineati lungo le linee di flusso di flusso del fluido. La correlazione tra le strutture di flusso e la formazione di biofilm filanti non è ancora ben compreso. Tuttavia, Das e Kumar 16 hanno recentemente proposto che queste fiamme si formano come altamente viscoso stato liquido dei biofilm intrinsecamente viscoelastici. Hanno basato la loro congettura sulla constatazione che il tempo scala di biofilm formazione streamer in genere supera di gran lunga i viscoelastici scale di tempo di rilassamento di biofilm. I biofilm sono noti a comportarsi come i liquidi viscoelastici e perciò a scale temporali molto più grandi rispetto alla scala di tempo di rilassamento viscoelastico, che essenzialmente si comportano come liquidi altamente viscosi 17. Secondo questa formulazione, filanti si può aspettare di origine in luoghi di forti sollecitazioni di taglio. Figura 5 mostra le posizioni di alta velocità nel canale, e queste posizioni coincidono con le posizioni di elevate sollecitazioni di taglio. Nel pha iniziale se di crescita, filanti sono osservate per originare vicino a queste posizioni (Figura 4).
Figura 1 Microscopio elettronico a scansione (SEM) immagini del canale microfluidica (vista dall'alto). a) sezione di ingresso, b) Regione contenente micro-pilastro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2 passi sequenziali coinvolti nella coltura batterica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Impostazione per esperimenti microfluidica. Microscopio 1-ottico (invertito), pompa-siringa 2, 3-Immagine e acquisizione dati, 4 siringa contenente colorante (facoltativo), 5-siringa contenente batteri, serbatoio 6-Rifiuti. Per favore clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4 Time-lapse imaging confocale dell'evoluzione di stelle filanti. Piano immagine corrisponde a z = 25 micron cioè metà del dispositivo. Ellissi tratteggiate mostrano filanti biofilm. cliccatequi per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 computazionale simulazioni meccaniche fluide che mostrano linee di corrente e profili di velocità di flusso attraverso micro-pilastro. Flusso del fluido è da cima a fondo scala e la velocità è in m / sec. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato un semplice dispositivo di microfluidica che imita mezzi porosi per lo studio dello sviluppo del biofilm in ambienti complessi. Ci sono diversi passaggi critici che determinano l'esito degli esperimenti. Essi comprendono la geometria del dispositivo. Mentre la geometria del palo può variare, adeguato poro-spazio per bandierine per formare è necessario. Inoltre, Valiei et al. 1 hanno dimostrato che la formazione streamer si verifica solo in un determinato campo di portata. A portate inferiori a un valore di soglia, la deformazione del biofilm in fiamme non può essere osservato. Eppure, al di sopra di una certa soglia di un altro valore di portata, fratture biofilm può dominare e non permettere la formazione di stelle filanti. Un altro problema che può affliggere questi esperimenti è bolle di gas che possono diventare intrappolati nella matrice di micro-pilastro. Solitamente queste bolle devono essere rimossi aumentando la portata inizialmente e poi gradualmente diminuendo al valore desiderato.
Piattaforme microfluidicacome questi offrono diversi vantaggi e alcuni limiti. La piattaforma ci permette di lavorare con piccoli volumi di coltura, e ha la flessibilità di incorporare funzioni definite dall'utente. Per esempio, diverse strutture porose possono simulare modificando i parametri geometrici della matrice di micro-pilastro. Anche le strutture che imitano la struttura casuale di vera mezzi porosi possono essere realizzati su piattaforme microfluidica 18. Inoltre, molti di questi canali possono essere implementate su un unico dispositivo che consente la raccolta di importanti dati pertinenti per l'analisi statistica accurata. Tuttavia, i sistemi microfluidici tipicamente imitano struttura bidimensionale di mezzi porosi. Dispositivi che possono mimare la natura tridimensionale dei mezzi porosi sono di solito abbastanza difficile da realizzare.
Formazione ed evoluzione delle stelle filanti non sono ancora ben compresi, e sono necessarie ulteriori ricerche in questa direzione. Comprensione di come si formano stelle filanti e portano al formatoione di strutture di biofilm maturi sarà rilevante per una vasta gamma di scenari, tra cui ostruzione di dispositivi biomedici, quali stent cardiaci, biofilm nel terreno, e sistemi di filtrazione. La nostra piattaforma microfluidica è un passo in questa direzione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
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