Abstract
Flera bakteriearter har förmågan att fästa vid ytor och kolonisera dem i form av tunna filmer som kallas biofilm. Biofilmer som växer i porösa medier är relevanta för flera industriella och miljömässiga processer såsom avloppsrening och CO2 kvarstad. Vi använde Pseudomonas fluorescens, en gramnegativ aerob bakterie, för att undersöka biofilm bildning i en mikroflödessystem enhet som härmar porösa medier. Den mikrofluidanordning består av en matris av mikro inlägg, som tillverkades med användning av mjuk-litografi. Därefter var biofilmbildning i dessa enheter med flödes utreds och vi demonstrerar bildandet av trådformiga biofilmer som kallas serpentiner i vår enhet. De detaljerade protokoll för tillverkning och montering av mikroflödessystem enhet finns här tillsammans med bakteriekulturen protokollen. Detaljerade förfaranden för experiment med mikroflödessystem enhet presenteras också tillsammans med företrädareresultat.
Introduction
Nyligen visade vi bakteriella biofilm bildningsdynamik i ett mikroflödessystem enhet som efterliknar porösa medier 1. Bakteriella biofilmer är i huvudsak kolonier av ytan aggregerade bakterier som är inneslutna av extracellulära polymera substanser (EPS) 2-4. Dessa tunna filmer av bakterier kan bildas i nästan alla tänkbara nisch allt från släta ytor till mycket mer komplex livsmiljö porösa medier. Et al. Valiei 1 använde en mikrofluidanordning med en matris av mikropelare för att simulera ett poröst mediestruktur och studerade biofilmbildning i denna anordning som en funktion av fluidflödeshastighet. De fann att i en viss ordning flöde, fintrådiga biofilmer kallas serpentiner började växa fram mellan olika pelare. Streamer kan tjudras vid en eller båda ändarna till fasta ytor, men resten av strukturen suspenderas i vätskan. Streamer formation börjar vanligtvis efter en inledande lager av biofilm har bildats och dess formation kan diktera den långsiktiga utvecklingen av biofilm i sådana komplexa livsmiljöer. Nyligen har flera forskare undersökt dynamiken i streamer bildning. Et al. Yazdi 5 visade att serpentiner kan bildas i Virvelflödena med ursprung från en oscillerande bubblan. I ett annat experiment al. Rusconi et 6 undersökte effekten av kanal krökning och kanalgeometri på bildandet av streamers. De fann att de serpentiner kan bildas i krökta sektioner av mikrokanaler, och streamer morfologi är relaterad till motilitet. Ny forskning har visat att streamers kan ha breda återverkningar i olika naturliga och konstgjorda scenarion eftersom de kan fungera som föregångare till bildandet av mogna strukturer i porösa gränssnitt, leder till snabb och katastrofal biofilm spridning inom biomedicinska system, och även orsaka betydande flödes struktur interaktioner osv 1,7-9.
Biofilm streamers bildar ofta jagn komplexa livsmiljöer såsom porösa medier. Förståelse biofilm tillväxt i porösa medier miljö är relevant för flera miljömässiga och industriella processer som biologisk vattenrening 10, upprätthålla väl borrhålet integritet i situationer som CO2 avskiljning 11 och pluggning av porer i marken 12. Observation biofilmsbildning i sådana komplexa miljöer kan ofta vara en utmaning på grund av opaciteten för porösa medier. I sådana situationer kan mikrofluidik baserade porösa medierna visa sig vara mycket fördelaktigt eftersom de möjliggör realtid och övervaka situ. En annan fördel med mikrofluidik är förmågan att bygga flera bioreaktorer på en bio-mikroflödes plattform och samtidigt göra det möjligt för online-övervakning och / eller infogandet av sensorer. Flexibiliteten att genomföra flera laboratorieexperiment i en enhet och möjlighet att samla in betydande relevanta uppgifter för noggrann statistisk analys är en viktig advantage av mikroflödessystem 13,14.
Inom ramen för ovanstående diskussion skulle förståelse streamer bildningsdynamik i ett poröst mediemiljö vara fördelaktig för flera tillämpningar. I denna studie utvecklar vi protokollet för utredning streamer bildning i en enhet som härmar porösa medier. Tillverkning av mikroflödes plattformen, är nödvändiga åtgärder för cellodling och experiment som beskrivs. I våra experiment, var vildtyp bakteriell stam av Pseudomonas fluorescens användes. P. fluorescens, som finns naturligt i marken, spelar en viktig roll för att upprätthålla markens ekologi 15. Den bakteriestam användes hade manipulerats genetiskt för att uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) konstitutivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utför experimentella protokoll här i den ordning som beskrivs nedan. Mikro protokoll för att skapa mikroflödes plattformen diskuteras i Steg 1 Steg 2 beskriver bakteriekulturen protokollet (Figur 2), och steg 3 avser montering av experimentuppställning (Figur 3). Slutligen är den faktiska experimentella steg som beskrivits i steg 4.
1 Chip Fabrication Tillvägagångssätt
OBS: Korrekt säkerhetsrutiner måste följas för de förfaranden som beskrivs nedan. Rådfråga institutionella skyddsombud för detaljer.
- Designa masken med en lämplig programvara (t.ex. L-Edit). Kanal design består av en huvud mikro-kanal med bredden 625 um. Den centrala regionen av kanalen innehåller en array av mikro inlägg 50 pm i diameter, åtskilda 25 | im från varandra (se kompletterande material).
- Skriv ut denna design på glas (5 "x 5" sodaglas), Som har en tjocklek på 0,09 "och är belagd med ca 70 nm tjockt skikt av krom (Cr), med användning av maskering för att framställa en bild mask. Användning AZ400K utvecklare för 1 min. Därefter etsa Cr-skiktet med användning av Cr etsmedel för ca 1 min Använd aceton för att plundra de stå emot och rengör den med kallt piraya lösning. (H 2 SO 4 och H 2 O 2 i förhållandet 3: 1).
- Fotolitografi
- Rengör en standard 4 "kiselskiva kemiskt med Piranha-lösning under 20 min.
- Skölj wafern med DI-vatten och torka den.
- Värm wafern på en het platta (200 ° C under 15 min).
- Coat kiselskivan med fotoresist. Här, den positiva fotoresist AZ4620 rotationsbelades på en kiselskiva vid 2000 rpm under 25 sek för att erhålla en 12,5 | im tjockt skikt.
- Ta bort alla lösningsmedlet genom mjuka bakning av skivan på en värmeplatta av flyt skivan under 90 sekunder på kväveflöde vid 100 ° C. Sedan, hålla den i vakuum vid than samma temperatur i 60 sek.
- Placera skivan i en mörk låda i 24 timmar för uttorkning.
- Exponera wafern för UV-ljus i syfte att överföra det utformade mönstret till fotoresisten.
- Sänk rånet i fotoresist framkallningslösning (AZ400K) för 240 sek. Sedan skölja rånet med isopropylalkohol och torka den genom att placera i en ström av kvävgas.
- ICP-DRIE (induktivt kopplad plasma - Deep Reactive Ion Etching) Process
- Applicera DRIE etsning. Välj lämplig etsningsdjupet enligt slutliga omfattning som krävs för enheten (50 um i denna undersökning). Fotoresist fungerar som ett maskeringsskikt under denna process.
- Ta resterande fotoresist med aceton och rengör skivan.
- PDMS (polydimetylsiloxan) Gjutning
- Använd triklormetylsilan (TCMS) för silanisering kisel mästare mögel. Häll 2 eller 3 droppar triklormetylsilan i en flaska och placera den i en torkapparat bredvidkisel mästare mögel. Låt 2-3 timmar för silanisering processen är färdig.
- I en separat behållare, blanda Sylgard 184 silikonbasen med härdare viktförhållande av 10: 1 för att framställa PDMS. Avgasa PDMS genom att utsätta det för vakuumbetingelser (ca 2 h).
- Sätt kisel mästare mögel i en hållare. Därefter häll PDMS på kisel huvudsakliga gjutformen för att bilda PDMS stämpeln. Se till att bubblor inte bildas i PDMS under denna process.
- Cure PDMS för 2 timmar vid 80 ° C.
- Dra av PDMS stämpeln från master mögel. Därefter skär PDMS stämpel i separata mikrochips. Slutligen använder en skär kärna för att borra hål för inloppet (s) och utlopp (s).
- Limning av PDMS till Glass
- Exponera täckglas och PDMS stämpel för syre plasma för 30 sek. Bond PDMS stämpel på täckglas.
- För att uppnå en korrekt tätning mellan PDMS stämpel och locket glida, glödga enheten genom att sätta den i ugnen vid 70 ° C i 10 min.
2 Bakteriell kultur
OBS: Korrekt protokoll biosäkerhet måste följas för steg 2-4. Rådfråga institutionella skyddsombud för detaljer.
- Förbered LB-agarplattor
- Lägg 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) pulver och 500 ml ultrarent vatten till en 1 L kolv. Rör om för att lösa upp pulvret.
- Sterilisera genom autoklavering vid 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Låt kolven svalna till 50-55 ° C på en bänk eller i ett vattenbad i biosäkerhet huva.
- Lägg antibiotikumet tetracyklin för att uppnå en slutlig koncentration av 50 pg / ml. Blanda väl genom att snurra.
- Häll blandningen i plattorna. Fyll varje platta till halv - 2/3.
- Flame luftbubblor kort till pop dem om de utgör. Stelnat luftbubblor är svåra att sprida bakteriekultur över.
- Låt plattorna svalna vid rumstemperatur över natten.
- När de är svala,sätta plattor tillbaka i sin hylsa, förslut påsen, etikett (antibiotika och datum), och förvara vid 4 ° C.
OBS: Täck beståndet av plattor med stanniol, som ljus avaktiverar många antibiotika.
- LB Broth Framställning
- Tillsätt 20 g Luria-Bertani (LB) buljong (Miller) pulver och 1 liter ultrarent vatten till en kolv. Rör om för att lösa upp pulvret.
- Sterilisera genom autoklavering vid 15 psi, 121 ° C i 15 min.
- Låt kolven svalna till 50-55 ° C på en bänk eller i ett vattenbad i biosäkerhet huva.
- Lägg antibiotikumet tetracyklin för att uppnå en slutlig koncentration av 50 pg / ml. Blanda väl genom att snurra.
- Låt svalna, placera märkta flaskan vid 4 ° C.
OBS: Täck flaskan med aluminiumfolie, som ljus avaktiverar många antibiotika.
- Kultur Bakterier på en LB-agarplatta (Detta protokoll använder Pseudomonas fluorescens)
- Ta den bakteriella lager från frysen (-80 °, C) och placera den på is.
- Placera -80 ° C bakterie lager och en LB-agarplatta inne en biosäkerhet huva.
- Seriebakteriestammen på en LB-agarplatta i ett sicksackmönster. Täck agarplatta och inkubera den vid 30 ° C över natten. Slutligen, förvara plattan i kylskåp vid 4 ° C.
- Förbered Bakteriell Solution (S1)
- Häll 50 ml LB-buljong media till en autoklaverad kolv. Utför denna operation i en biosäkerhet huva.
- Överför en enda bakteriekoloni från LB-agarplatta till kolven. Denna operation bör också utföras i en biosäkerhet huva.
- Placera kolven i ett skak-inkubator vid 30 ° C och 150 rpm under tillräcklig tid (4 timmar).
- Förbered Späd Bakteriell Solution (S2)
- Häll 5 ml LB-buljong medier i ett steriliserat plaströr.
- Späd S1 genom blandning med LB buljong media. Därefter Vortexa lösningen. Späd lösningen uppnå önskad optiskal densitet (OD mätt vid 600 nm = 0,1).
OBS: Biofilm experiment använder typiskt OD-värden i denna närhet.
3 Förbered experimentella Setup
- Använda pincett ansluter flexibla plaströr (0,20 "ID) i inlopps (s) och utlopp (er) i mikrochip. De inlopp och utlopp tidigare borrats i PDMS delen av mikrochip (steg 1.5.5). I denna undersökning , mikrochip består av två inlopp och ett utlopp.
- Fyll sprutan (s) med bakterielösning (S2-lösning) och ta bort alla bubblor i sprutan (s).
- Anslut sprutspetsen (s) (30 G 0.5 "trubbig nål) i inloppsröret (s). Anslut sedan utloppsrör (s) till avfallsbehållare.
4 Kör Experiment
- Anslut sprutan (s) till sprutspetsen (er).
- Ort och fix spruta (s) på sprutpumpen. Placera sedan mikrochip under ett optiskt mikroskop med objektiv av desired förstoring (t.ex. 40X). Täck mikrochip med en levande cellkammare anordning för att bibehålla en konstant temperatur miljö för bakteriell tillväxt (30 ° C för P. fluorescens).
- Ställ in pumpen till den önskade flödeshastigheten nivå (säg 10 l / timme) och initiera vätskepumpning.
- När bakterier förs in i kammaren, är biofilmbildning även inlett. Biofilm bildning och mognad uppträder vanligen under en period av flera timmar eller dagar. Beakta och ta bilder av biofilm tillväxt genom mikroskopet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av ovan nämnda mikrofabrikation protokoll, var en PDMS baserad mikrofluidikanordning konstrueras. Figur 1 visar svepelektronmikroskop (SEM) bilder av PDMS-enheten. Figur 1a visar ingångssektion av anordningen. En gaffelliknande ingång är skapad för att utjämna tryckhuvud över anordningen. Ytterligare SEM imaging visade också att pelaren väggarna är nästan lodrätt (Figur 1b). Den odlade bakterielösningen (Figur 2) utspäddes och dess optiska täthet justerades till ett värde av 0,1. Vi undersökte biofilmbildning i mikrofluidanordning som en funktion av inmatningsflödeshastigheten. När P. fluorescens injicerades i enheten vid en låg flödeshastighet på 0,8 l / h, bakteriell vidhäftning och biofilmbildning inträffade vid väggarna i enheten. Även efter en längre tid (> 20 h), inga andra än utanpå kramas biofilmer bakteriella strukturer vire observerats. Därefter tillsattes samma experiment upprepades vid en flödeshastighet av 8 ul / tim. I det här fallet, biofilm bildning åter började efter några minuter av infusion av den utspädda bakteriekultur. Men efter några timmar, utseende trådformiga strukturer som sträcker sig mellan mikropelare observerades nära den mellersta delen av anordningen (Figur 4). Dessa trådformiga strukturer skulle kunna visas genom närvaron av orörliga bakterier. Dessa strukturer är kända som serpentiner och de är filamentösa biofilmer som endast är bundna vid en eller båda ändarna till ytor. Resten av strukturen är ofta suspenderade i det flytande mediet (som i detta fall). Figur 4 visar tidsevolution av biofilm streamer struktur. Streamer bildar vanligen på grund av effekten av fluid skjuvning på den viskoelastiska biofilmen. Figur 5 visar strömningslinjerna och hastighets konturer för flöde förbi en rad pelare. Simuleringen visar att de streamers somform i vårt mikroflödessystem är i huvudsak inriktade längs vätskeflödesströmlinjerna. Korrelationen mellan flödesstrukturer och bildandet av biofilm serpentiner är ännu inte klarlagd. Men Das och Kumar 16 har nyligen föreslagit att dessa serpentiner bildas som mycket trögflytande vätska topp inneboende viskoelastiska biofilmer. De bygger sina gissningar på observationen att tidsskalan för biofilm streamer bildning vanligtvis vida överstiger de viskoelastiska relaxatidsskalor biofilmer. Biofilmer är kända för att bete sig som viskoelastiska vätskor och därmed på tidsskalor mycket större än den viskoelastiska avkoppling tidsskalan, de huvudsakligen uppträder som högviskösa vätskor 17. Enligt denna formulering kan serpentiner förväntas härröra vid platser för höga skjuvspänningar. Figur 5 visar var de med hög hastighet i kanalen, och dessa platser sammanfalla med lägena för höga skjuvspänningar. I den inledande pha se på tillväxt, är serpentiner observeras ha sitt ursprung i närheten av dessa platser (Figur 4).
Figur 1 Svepelektronmikroskop (SEM) bilder av mikroflödeskanalen (topp-vy). a) Inloppssektion, b) Region som innehåller mikropelare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sekventiell stegen i bakteriekultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Inställningar för mikroflödesexperiment. 1-optisk mikroskop (inverterad), 2-spruta pump, 3-Bild och datainsamling, 4-spruta innehåller färgämne (tillval), 5-spruta innehållande bakterier, 6-avfallsbehållare. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 Time-lapse konfokala avbildning av utvecklingen av banderoller. Bildplanet motsvarar z = 25 pm dvs mitten av enheten. Streckade ellipser visa biofilm serpentiner. Klickahär för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Computational fluid mekaniska simuleringar som visar effektiviserar och hastighets konturer flöde förbi mikropelare. Vätskeflödet är från topp till botten och hastighetsskalan är i m / sek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visade en enkel mikroflödessystem enhet som efterliknar porösa medier för att studera biofilm utveckling i komplexa miljöer. Det finns flera viktiga steg som dikterar resultatet av experimenten. De inkluderar anordningen geometri. Medan efter geometri kan variera, är nödvändigt tillräckligt por-utrymme för streamers att bilda. Dessutom Valiei et al. 1 har visat att streamer bildning förekommer endast i en viss flödeshastighet intervall. Vid flödeshastigheter lägre än ett tröskelvärde, kanske inte observeras deformation av biofilmer i serpentiner. Men över en viss annan tröskelflödesvärdet, kan biofilmen fraktur dominera och inte tillåta bildandet av serpentiner. En annan fråga som kan plåga dessa experiment är gasbubblor som kan ha fastnat i mikro-stolpen array på. Vanligtvis dessa bubblor måste avlägsnas genom att man ökar flödeshastigheten i början och sedan gradvis minskar den till det önskade värdet.
Mikroflödes plattformarsom dessa erbjuder flera fördelar och få begränsningar. Plattformen gör det möjligt för oss att arbeta med små odlingsvolymer, och har flexibiliteten att införliva användardefinierade funktioner. Exempelvis kan olika porösa strukturer simuleras genom att förändra de geometriska parametrarna för mikro-stolpen array på. Även strukturer som efterliknar slump struktur verkliga porösa medier kan tillverkas på mikroflödes plattformar 18. Dessutom kan flera sådana kanaler implementeras på en enda enhet som möjliggör insamling av viktiga relevanta uppgifter för noggrann statistisk analys. Men mikrofluidiksystem härma normalt tvådimensionell struktur porösa medier. Enheter som kan imitera den tredimensionella karaktären hos porösa medier är oftast ganska svårt att tillverka.
Bildning och utveckling serpentiner är inte förstått ännu, och ytterligare forskning behövs i denna riktning. Förståelse för hur serpentiner bilda och leda till formatetion av mogna biofilm strukturer kommer att vara relevant för en rad olika scenarier, inklusive igensättning av biomedicinska anordningar såsom hjärt stentar, biofilmer i jord och filtreringssystem. Vår mikroflödes plattform är ett steg i den riktningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri dish | Fisher | 875712 | sterile 100 mm x 15 mm polystyrene Petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24 incubator shaker series | |
| 50 ml sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene RNase-/DNase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 μg/ml |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole-Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al. Encylopedia of Nanotechnology. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
