Summary
Этот протокол описывает использование амидного сочетани реакций изоникотиновой кислоты и диаминоалканов образовывать мостиковые лиганды, пригодные для использования в синтезе многоядерных комплексов платины, которые сочетают аспекты противоопухолевых препаратов BBR3464 и picoplatin.
Introduction
Платина противоопухолевые препараты остаются одним из наиболее широко используемых семье агентов в лечении человеческого рака 1. Несмотря на успех, они ограничены в их применении тяжелыми дозолимитирующей побочных эффектов 2-4. Ограниченные дозы, которые могут быть введены пациентам также означает, что опухоли могут вырабатывать устойчивость 5. По существу, новые препараты продолжают разрабатываться для улучшения профиль побочных эффектов и преодолеть приобретенную устойчивость, как phenanthriplatin 6 и phosphaplatin 7.
В конце 1990-х, трехъядерный платиновый препарат был разработан, BBR3464 (схема 1) 8, то есть до 1000 х более токсичным в пробирке, чем ведущие платина наркотиков, цисплатин. BBR3464 также способен преодолевать приобретенной устойчивости в панели линий раковых клеток человека 9. К сожалению, повышение активности BBR3464 будет сопровождаться 50 - до 100 - раз более высокую токсичность, котораяограничивает его применение 10-12. Он также легко разрушается в организме, то есть немного препарата достигает ядра раковых интактные 9.
Picoplatin является мононуклеарных на основе платины препарат, который содержит 2-метил-пиридин-лиганд (схема 1) 13. Метильной группой этого препарата защищает его от нападения биологических нуклеофилами; в частности цистеин и метионин, содержащие пептиды / белки 14-16. Таким образом, препарат достаточно стабилен и имеет намного более высокую концентрацию, которая достигает ядра раковых сравнению как с BBR3464 и цисплатин 17. Его снижена реактивность также означает picoplatin имеет более высокую максимальную переносимую дозу по сравнению с BBR3464 и цисплатин 10,18,19.
Таким образом, этот проект призван объединить свойства BBR3464 и picoplatin производить новые препараты, которые в состоянии преодолеть приобретенную устойчивость, что отображения повышенной биологической стабильности и менее строгую боковую EFFECTS (например, рисунок 1). При этом, ряд двуядерных комплексов платины были подготовлены с биспиридина мостиковых лигандов 20. Лиганды выполнены с использованием амидного сочетани реакции с изоникотиновой кислоты или ее производных, таких как 2-метил-изоникотиновой кислоты, переменной длины диаминоалканов. Реакция одним моль-эквивалентом лигандов с двумя моль эквивалентов transplatin дает желаемые комплексы платины (схема 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Синтез N, N '-. (Алканов-1, н-диил) diisonicotinamide
- Сушат одну горловину или три-горлую круглодонную колбу в печи (100 ° С, 1 ч), чтобы обеспечить вся влага удаляется.
- Добавить твердого изоникотиновой кислоты, или его производное, в колбу вместе с магнитным перемешивающим стержнем. Если диаминоалкан лиганд (ы) являются твердыми при комнатной температуре, затем 0,5 моль (к числу молей изоникотиновой кислоты) добавляли в колбу на данном этапе.
- Закройте горлышко (ы) из колбы с резиновой перегородкой и заменить воздух в колбе с азотом или через непрерывный поток азота или с использованием азота заполнены шары.
- С помощью подкожной иглы и шприца, чтобы добавить безводный диметилформамид или диметилсульфоксид (4 мл в 500 мг изоникотиновой кислоты или 2-метил-изоникотиновой кислоты), чтобы растворить твердое вещество. Если твердые не легко растворяются, то нагревают раствор осторожно.
- Добавить 7 моль-эквивалентов (на аКрепление изоникотиновой кислоты, используемой) триэтиламина (слабое основание) и 0,5 моль эквивалентов на диаминоалканом. Если раствор является жидкостью при комнатной температуре, затем добавляют 1,5 моль-эквивалентов.
- Добавить одним моль-эквивалентом 1-пропилфосфонового ангидрида (связующего агента) при непрерывном перемешивании и оставляют реакционную завершить в течение 5-12 часов.
2. Очистка лигандов
- Для биспиридина лигандов, сделанных с помощью диаминоалканом лигандов с 10 или более метиленовых групп, ждать продукты для осаждения из раствора по мере протекания реакции.
- Для биспиридина лиганды с использованием диаминооктан, осаждают продукт добавлением ~~~iobj 40 мл воды.
- Для биспиридина с использованием диаминоалканов из 5:58 метиленовых групп, добавьте ~ 40 мл воды и позволяет соединения кристаллизоваться в течение 1-3 дней.
- Сбор каждый биспиридина лиганд вакуумной фильтрацией и перекристаллизовывают из примерно 400-500 мл кипящей воды в 200мг лиганда. Примечание: Более вода необходима для более биспиридина лигандов из-за их значительно сниженной растворимостью в воде.
- Добавить NaOH и КОН (рН 9) к раствору, чтобы гарантировать, что эти соединения являются свободные основания после перекристаллизации.
3. Синтез и очистка Биядерные комплексы платины
- Полностью растворяется транс-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, в горячей (70-80 ° С) водой (150 мл на 200 мг transplatin) для получения прозрачного сильно желтого цвета раствор.
- Добавить 0,5 моль эквивалент биспиридина лиганда и перемешивают раствор при температуре до лигандов растворится (прозрачный раствор). Дождитесь решения, чтобы превратить вблизи бесцветный, выключите огонь, и перемешивают при комнатной температуре в течение нескольких дополнительных часов.
- Растворитель удаляют на роторном испарителе, который даст желтого цвета порошок.
- Очищают, комплекс платины (адреса) путем растворения в минимальном количестве теплой воды (~ 50 &# 186; С). Если остальные желтые или белые цветные отходах присутствуют твердые, затем процеживают них прочь.
- Добавить ацетон в раствор до тех пор, белый осадок не образуется которая, как представляется полимерной форме комплексов металлов и представляет до 10% продукта реакции. Продолжить добавление ацетона (~ лишних 20-30 мл), пока не появится не более осадок. Примечание: этот белый осадок является примесью.
- Удалить осадок путем фильтрации содержимого через нейлоновый фильтр бумаги (размер пор 0,2 мкм) и ротационные испарения оставшегося раствора досуха, в результате которых получают чистый продукт. Примечание: Если необходимо, то дополнительные шаги ацетон осадки не могут быть выполнены, пока комплекс чист.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В биспиридина лиганды и их соответствующие комплексы платины биядерные характеризуются 1 Н, 13 С и 195 Pt ЯМР (таблицы 1 и 2), и с ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии. Точные температуры плавления можно определить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и чистоту лучше всего определяется с помощью элементного анализа для C, H и N процентного содержания. Наибольший использования является 1Н ЯМР как это быстро и проста в использовании, что дает результаты в течение нескольких минут изоляции конечных продуктов с резонансов, которые могут окончательно с успешными Амид муфты и координации платины (таблицы 1 и 2).
Изоникотиновой кислоты имеет три резонансы; два дуплета в ароматической области (от 7 до 9 млн) и очень широкий резонанс около 13 частей на миллион для протона карбоновой кислоты. В диаминоалкан протонные резонансы расположены в алифатической области между 1 и 4 частей на миллион. Как тон длина цепи увеличивается диаминоалкан многих из метиленовых резонансов становятся эквивалентными и, как таковые, меньше пики наблюдаются в алифатической области, чем можно было бы ожидать; хотя они значительно более интенсивным и может быть назначен свободно их интеграции (таблицы 1 и 2). Например см. фиг.1 и 2 для химической структуре и 1 Н-ЯМР спектрах N, N '- (октан-1 ,8-диил) бис (изоникотинамида), Биао, лиганд. Из-за симметрии в молекуле пять алифатических резонансы следовало бы ожидать для Бяо; но четыре внутренних самых метилен пики все магнитно эквивалентны и появляются в виде одного большого резонанса на ~ 1,2 частей на миллион.
Амин протонного резонанса несвязанной диаминоалкан цепи находится в алифатической области и является наиболее важным резонанс, как она движется значительно слабого поля, в ароматической области, на соединительной то карбоновой кислоты. Последующее амид протонного резонанса видно вокруг 8,7 частей на миллион для всех этих лигандов, как относительно широкий триплет резонанса (рис. 2).
Координация платиновой группы к биспиридина лигандов наблюдается на основе выборочных сдвигов ароматических резонансов лиганда в (0.15 промилле слабого поля смещения резонансов га и 0,07 промилле в сильное поле смещения резонансов гемоглобина) и соблюдением платины сцепления на дублетного резонанса для Ha протоны (рис. 3). Координация платиновых групп в биспиридина лиганда можно наблюдать легко, используя 195 ЯМР Pt. Химический сдвиг платиновой резонанса напрямую связана с типами атомов скоординированных 21. Хлоридо лиганды переложить 195 Pt резонансы слабого поля (к 0 промилле) и местонахождение (м) ино лиганды переложить резонансы в сильное поле (к -2500 млн). Комплексы платины двухъядерные синтезированные здесь показать один г esonance вокруг -2300 промилле в связи с 3-кратным утра (м) ино и 1 х государственной координации хлоридо (рис. 4) 22. Непрореагировавший transplatin примеси бы показать как резонанс вокруг -2100 промилле, тогда как, если два лиганда взаимодействует с одной молекулой transplatin (4 х утра (м) ино окружающей среды), то эта примесь будет сильное поле из -2400 млн 22.
Схема 1 Химические структуры платиновых препаратов picoplatin и BBR3464 и общую схему синтеза для синтеза биспиридина лигандов и их двойной ядерной комплексов платины.; R = Н или СН 3; . п = 1-6 ионы Счетчик для комплексов платины были опущены; с помощью метода, описанного здесь они дихлорид соли.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1 химическая структура N, N '-.. (Октан-1 ,8-диил) бис (изоникотинамид) лиганд, Бяо, и протон схема нумерации используется для присвоения резонансов в ЯМР 1 Примечание эквивалентность из четырех метиленовых протонов (He) в центре молекулы.
Рисунок 2 1Н ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) спектр N, N '-. (Октан-1 ,8-диил) бис (изоникотинамид), Бяо Обратите внимание на расположение в триплет амидной резонанса на уровне около 8,7. частей на миллион, по сравнению с 1-2 частей на миллион дл диаминооктан амина резонанса до муфты.
Рисунок 3. 1 H-ЯМР (D 2 O, 400 МГц) спектр транс-[{Pt (NH 3) 2 Cl 2} μ-Биао] 2 +. Заметим, платина соединение в ароматическом Ха резонанса при 8,82 частей на миллион.
Рисунок 4. 195 Pt ЯМР (D 2 O, 400 МГц) спектр транс-[{Pt (NH 3) 2 Cl}. 2 μ-Биао] 2 + Обратите внимание на один широкий резонанс вокруг -2300 частей на миллион, который согласуется с PTN 3 Cl среды; N = утра (м) НИС.
Таблица 1 1 Н ЯМР характеристика данным биспиридина лигандов в ДМСО-d6 при 400 МГц д = дублет..; т = триплет; д = квартет; м = мультиплет.
Таблица 2. 1 Н ЯМР характеристика данных платиновых комплексов двуядерных в D 2 </ STRONG> О на частоте 400 МГц г = дуплет.; т = триплет; д = квартет; м = мультиплет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой работе биядерного комплексы платины были синтезированы в качестве потенциальных противоопухолевых агентов. При этом биспиридина мостиковых лигандов были синтезированы с помощью реакции связывания амида с использованием изоникотиновой кислоты и переменных диаминоалканов длины. Ранее синтез биспиридина лигандов и их метиловых аналогов с 2 до 8 метиленовых групп и их соответствующих комплексов платины поступало. В данной работе метод синтеза и очистки была пересмотрена что делает его быстрее и дешевле и продемонстрировали это, синтезируя биспиридина лигандов с 8, 10 и 12 метиленовых групп (самый короткий с восьми метиленовых групп, Бяо, было сделано, чтобы сравнить новый Способ очистки, чтобы старый метод). Двуядерных комплексов платины были также сделаны с помощью этих лигандов.
Синтез биспиридина лигандов было завершено в безводном растворителе и в инертной атмосфере азота с использованием триэтиламина в качестве слабого основания ипропилфосфоновой ангидрид в качестве связующего агента. Либо ДМФ или ДМСО могут быть использованы в качестве растворителя, хотя изоникотиновой кислоты растворяется лучше в ДМСО, чем это делает в ДМФ. Для либо растворитель, слабый нагрев под управлением потоком горячей воды может быть использована для облегчения растворения.
Этот старый метод требовал продленного времени реакции (несколько дней) и многостадийный процесс очистки включая добычу жидкость / жидкость против диэтилового эфира и нейтрализации NaHCO 3, который в настоящее время устранены. Реакции синтеза лиганда теперь завершена в течение нескольких часов при комнатной температуре после того как все реагенты добавлены вместе в одну стадию. В биспиридина лиганды осадить из раствора с добавлением воды (для лигандов с 8 или менее метиленовых групп) и осадить из раствора при образовании для 10 и 12 метиленовой группы лигандов. Все лиганды могут быть перекристаллизовывают из кипящей воды и в некоторых случаях их медленного ПЕРЕКРИСТАЛЛИЗАЦИЯзации может дать кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного анализа.
Комплексы платины биядерные получают взаимодействием двух молей transplatin на один моль на биспиридина лигандов. Транс-labializing эффект хлоридо лигандов гарантирует, что основным продуктом является координация платиновых препаратов с помощью одного сайта на биспиридина лигандов (атом азота кольца). Комплексы платины двухъядерные имеют хорошую растворимость в качестве дикатиона солей в обоих воды, DMF и DMSO.
Очистка достигается за счет фракционным осаждением с использованием ацетона. Неидентифицированных примесей выпадает в осадок до продуктом и удаляют фильтрацией через узкую бумаги пор фильтра. Важно отметить, что осадки ацетон лучше работает с увеличением количества продукта, который будет очищенной. В сумму, меньшую 200 мг, метод не работать, так и повторные ацетон осадков может потребоваться. Для сумм около 200 мг илиЧем больше мы нашли, что отдельные шаги ацетон осадки, как правило, требуется только.
Хотя в настоящем документе подробно синтез специфических лигандов и комплексов платины, методы, используемые здесь, могут быть применены для синтеза гораздо более широкий спектр лигандов и многоядерных комплексов платины. Например, с подходящими защитными группами другие диаминоалкан лиганды, такие как спермин и спермидин, могут быть использованы, чтобы сделать биспиридина лиганды. Несимметричные биспиридина лиганды также могут быть получены с использованием изоникотиновой кислоты на одном конце и 2-метил-изоникотиновой кислоты на другом конце. Эти не-симметричные лиганды может быть сгенерирован с использованием FMOC / BOC-защиты на одном конце диаминоалкан цепей. Незащищенный амин цепи может быть подвергнуто взаимодействию с производным изоникотиновой с использованием реакций, описанных сочетанием амидной. Защитную группу затем отщепляют от диаминоалкан цепи и другое производное изоникотиновой кислоты прикреплен с помощьюдругой амидное сочетание реакции. Трехъядерный комплексы платины также может потенциально быть сделаны с помощью любого из этих лигандов с помощью адаптации метода с использованием лигандов пиразолила основанные сделать трехъядерный, BBR3464-как, комплексы 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
