Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af amidkobling reaktioner isonikotinsyre og diaminoalkaner til dannelse brodannende ligander egnede til anvendelse i syntesen af multinucleare platinkomplekser, der kombinerer aspekter af anticancerlægemidler BBR3464 og picoplatin.
Introduction
Platinum anticancermedicin fortsat en af de mest udbredte familie af agenter i behandlingen af kræft hos mennesker 1. På trods af deres succes, er de begrænset i deres anvendelse af alvorlige dosisbegrænsende bivirkninger 2-4. De begrænsede doser, der kan gives til patienter, betyder også, at tumorer kan udvikle resistens 5. Som sådan, nye lægemidler fortsat udvikles for at forbedre bivirkningsprofil og overvinde erhvervet resistens, ligesom phenanthriplatin 6 og phosphaplatin 7.
I slutningen af 1990'erne blev en tricycliske platin lægemiddel udviklet, BBR3464 (Skema 1) 8, der er op til 1.000 x mere cytotoksisk in vitro end den førende platin narkotika, cisplatin. BBR3464 er også i stand til at overvinde erhvervet resistens i et panel af humane cancer cellelinjer 9. Desværre er øget aktivitet af BBR3464 modsvares af 50 - til 100 - fold højere toksicitet, sombegrænser anvendelsen af 10-12. Det er også let nedbrydes i kroppen, hvilket betyder, lidt af medikamentet når kræft kerner intakte 9.
Picoplatin er en mononukleær platinbaseret lægemiddel, der indeholder en 2-methyl-pyridin-ligand (skema 1) 13. Methylgruppen af dette stof beskytter det mod angreb fra biologiske nukleofiler; navnlig cystein og methionin, der indeholder peptider / proteiner 14-16. Som sådan, at stoffet er helt stabil og har en meget højere koncentration, når kræft kerner sammenlignet med både BBR3464 og cisplatin 17. Dens nedsat reaktionsevne betyder også picoplatin har en højere maksimalt tolererede dosis sammenlignet med BBR3464 og cisplatin 10,18,19.
Dette projekt er derfor forsøgt at kombinere de egenskaber BBR3464 og picoplatin at producere nye lægemidler, der er i stand til at overvinde erhvervet resistens, der viser forbedret biologisk stabilitet og mindre alvorlige side-effects (fx figur 1). Herved blev en række bicycliske platinkomplekser fremstillet med bispyridin brodannende ligander 20. Liganderne er lavet ved hjælp amid koblingsreaktioner med isonicotinsyre eller derivater deraf som 2-methyl-isonicotinsyre, diaminoalkaner variabel længde. Omsætning af et mol ækvivalent af liganderne med to molækvivalenter transplatin giver de ønskede platinkomplekser (skema 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af N, N '-. (Alkan-1, n-diyl) diisonicotinamide
- Tør en enkelt hals eller tre-halset rundbundet kolbe i en ovn (100 º C, 1 time) for at sikre, at al fugt er fjernet.
- Tilføj solid isonicotinsyre eller dets derivat, til kolben sammen med en magnetomrører. Hvis diaminoalkan ligand (e) er faste stoffer ved stuetemperatur, hvorefter 0,5 mol (nummer mol isonicotinsyre) sættes til kolben på dette stadium.
- Cap halsen (r) i kolben med gummisepta og erstatte luften i kolben med nitrogen enten gennem en kontinuerlig nitrogenstrøm eller ved anvendelse af nitrogen-balloner.
- Brug en kanyle og en sprøjte til at tilføje vandfrit dimethylformamid eller dimethylsulfoxid (4 ml per 500 mg isonicotinsyre eller 2-methyl-isonicotinsyre) for at opløse det faste stof. Hvis de faste stoffer ikke opløses let, og opløsningen opvarmes forsigtigt.
- Tilføj 7 mol ækvivalenter (til enmount af isonicotinsyre anvendt) triethylamin (svag base) og 0,5 mol ækvivalenter af diaminoalkan. Hvis opløsningen er en væske ved stuetemperatur, hvorefter der tilsættes 1,5 molækvivalenter.
- Tilføj et mol ækvivalent af 1-propylphosphonsyre-anhydrid (koblingsmiddel) med kontinuert omrøring og tillade reaktionen at fuldføre løbet 5-12 timer.
2.. Oprensning af ligander
- For bispyridin ligander lavet ved hjælp diaminoalkan ligander med 10 eller flere methylengrupper, vente for de produkter, udfældes fra opløsningen som reaktionen skrider frem.
- For bispyridin ligander fremstillet ved anvendelse diaminooctan, udfældning af produktet ved tilsætning ~ 40 ml vand.
- For bispyridin lavet ved hjælp diaminoalkaner af 2-6 methylengrupper, tilsættes ~ 40 ml vand og gør det muligt for forbindelserne at krystallisere i løbet af 1-3 dage.
- Saml hver bispyridin ligand ved vakuumfiltrering og omkrystalliseres fra ca 400-500 ml kogende vand pr 200mg ligand. Bemærk: der er behov for mere vand til længere bispyridin ligander på grund af deres opløselighed meget reduceret vand.
- Tilføj NaOH og KOH (pH 9) til opløsningen for at sikre, at forbindelserne er frie baser upon omkrystallisation.
3.. Syntese og oprensning af de bicykliske platinkomplekser
- Fuldt opløse trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, i varmt (70-80 º C) vand (150 ml pr 200 mg transplatin) for at producere en klar stærkt gul farvet løsning.
- Tilføj en 0,5 mol ækvivalent af den bispyridin ligand og omrøre opløsningen ved temperaturer indtil ligand opløst (klar opløsning). Vent til den løsning, at vende nær farveløs, slukke for varmen, og der omrøres ved stuetemperatur i et par ekstra timer.
- Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning, hvilket vil give et gult farvet pulver.
- Rense, platinkomplekset (r) ved at opløse i en minimal mængde varmt vand (~ 50 &# 186; C). Hvis de resterende gule eller hvide farvede faste stoffer er til stede, så filtrere disse fra.
- Tilføj acetone til opløsningen, indtil et hvidt bundfald, som synes at være en polymer form af metalkomplekser, og udgør op til 10% af reaktionsproduktet. Fortsæt tilføjelsen af acetone (~ ekstra 20-30 ml), indtil der ikke mere bundfald. Bemærk: Denne hvide bundfald er en urenhed.
- Fjern dette bundfald ved filtrering af indholdet gennem nylon filterpapir (0,2 um porestørrelse) og roterende inddampning af den resterende opløsning til tørhed, hvilket gav et rent produkt. Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan derefter yderligere acetoneudfældning trin udføres, før komplekset er ren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bispyridin ligander og deres respektive bicycliske platinkomplekser er karakteriseret ved 1H, 13C og 195 Pt NMR (tabel 1 og 2), elektrosprayionisering massespektroskopi. Nøjagtige smeltepunkter kan bestemmes ved anvendelse af differentiel scanningskalorimetri og renhed bestemmes bedst ved elementaranalyse for C, H og N procentvise indhold. Mest brug er 1H NMR da det er hurtigt og let at bruge, giver resultater inden for få minutter fra isolation af de endelige produkter med resonanser, der endeligt kan dokumentere succesfulde amid koblings-og koordinerings-platin (tabel 1 og 2).
Isonicotinsyre har tre resonanser; to dubletter i den aromatiske region (7 til 9 ppm) og en meget bred resonans omkring 13 ppm for carboxylsyre proton. De diaminoalkan protonresonanser er alle beliggende i den alifatiske region mellem 1 og 4 ppm. Som than længde diaminoalkan kæde stiger mange af methylen resonanser bliver tilsvarende, og som sådan er færre toppe observeret i den alifatiske region end forventet; selv om de er betydeligt mere intens og kan tildeles løst deres integrationer (tabel 1 og 2). Se for eksempel figur 1 og 2 til den kemiske struktur og 1H-NMR-spektre af N, N '- (octan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid), biao, ligand. På grund af symmetri i molekylet fem alifatiske resonanser normalt ville forventes for Biao; men de fire indre mest methylen toppe er alle magnetisk ækvivalente, og vise sig som en stor resonans ved ~ 1,2 ppm.
Aminen protonresonansspektrum den løse diaminoalkan kæden er beliggende i den alifatiske region, og er den vigtigste resonans som den bevæger sig væsentligt nedstrøms, ind i den aromatiske region efter kobling to carboxylsyren. Den efterfølgende amidproton resonans ses omkring 8,7 ppm for alle disse ligander, som en forholdsvis bred triplet resonans (Figur 2).
Koordinering af platin gruppen til de bispyridin ligander er observeret gennem selektive skift af ligand er aromatiske resonanser (0,15 ppm downfield skift af Ha resonanser og 0,07 ppm ad banen skift af Hb resonanser) og overholdelse af platin kobling på dublet resonans for Ha protoner (figur 3). Koordinering af platin-grupper til bispyridin ligand kan ligeledes let iagttages ved hjælp af 195 Pt NMR. Den kemiske skift af en platin resonans er direkte relateret til de typer af atomer koordinerede 21. Chlorido ligander skift 195 Pt resonanser downfield (mod 0 ppm) og AM (m) ino ligander flytte resonanser op ad banen (mod -2.500 ppm). De bicycliske platinkomplekser syntetiseret her, viser en enkelt r esonance omkring -2300 ppm på grund af det 3 x am (m) ino og 1 x chlorido koordinering tilstand (figur 4) 22. Ureageret transplatin urenhed ville vise som en resonans omkring -2100 ppm, hvorimod hvis to ligander reagerede med en enkelt transplatin molekyle (4 x am (m) ino miljø), så er denne urenhed ville være op ad banen på -2.400 ppm 22..
Skema 1 De kemiske strukturer af platin narkotika picoplatin og BBR3464 og generelt synteseskema til syntese af bispyridin ligander og deres respektive bicycliske platin komplekser.; R = H eller CH3; . n = 1-6 modioner for platinkomplekser er blevet udeladt; ved hjælp af den her beskrevne fremgangsmåde er de dichlorid salte.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Bemærk ækvivalens (oktan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid) ligand, Biao og proton nummersystem, der anvendes til tildeling af resonanser i 1H NMR - Figur 1 Den kemiske struktur af N, N '.. af de fire methylenprotoner (HE) i midten af molekylet.
Figur 2 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) spektrum af N, N '-. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonicotinamid), Biao Bemærk placeringen af triplet amid resonans på omkring 8.7. ppm, op 1-2 ppm for diaminooctan amin resonans før kobling.
Fig. 3. 1H NMR (D2O, 400 MHz)-spektret af trans-[{Pt (NH3) 2 Cl} 2 μ-biao] 2 +. Bemærk platin kobling på den aromatiske Ha resonans ved 8,82 ppm.
Figur 4.. Den 195 Pt NMR (D2O, 400 MHz)-spektret af trans-[{Pt (NH3) 2 Cl}Note 2 μ-Biao] 2 + enkelt bred resonans omkring -2.300 ppm, hvilket er konsistent med en PTN 3. Cl miljø.; N = am (m) ine.
Tabel 1 1 H NMR karakterisering data for de bispyridin ligander i DMSO-d6 ved 400 MHz d = dublet..; t = triplet; q = kvartet; m = multiplet.
Tabel 2. 1H NMR karakterisering data for de bicycliske platinkomplekser i D 2 </ Strong> O på 400 MHz d = dublet.; t = triplet; q = kvartet; m = multiplet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde bicycliske platinkomplekser er blevet syntetiseret som potentielle anticancermidler. Dermed bispyridin brodannende ligander blev syntetiseret via en amid koblingsreaktion ved hjælp isonicotinsyre og diaminoalkaner variabel længde. Tidligere syntesen af bispyridin ligander og deres methyl-analoger med 2 til 8 methylengrupper og deres respektive platinkomplekser er blevet rapporteret. I dette papir, har syntese og oprensning metode blevet revideret gør det hurtigere og billigere og har demonstreret dette ved at syntetisere bispyridin ligander med 8, 10 og 12 methylengrupper (den korteste med de otte methylengrupper, Biao blev lavet til at sammenligne den nye oprensningsfremgangsmåde til den ældre metode). Bicycliske platin komplekser blev også fremstillet ved anvendelse af disse ligander.
Syntesen af bispyridin ligander blev afsluttet i vandfrit opløsningsmiddel og under en inert nitrogenatmosfære anvendelse af triethylamin som en svag base ogpropylphosphonsyre-anhydrid som koblingsmidlet. Enten DMF eller DMSO kan anvendes som opløsningsmiddel, selv om isonicotinsyre opløses bedre i DMSO, end det gør i DMF. For enten opløsningsmiddel forsigtig opvarmning under rindende varmt vand kan anvendes til at hjælpe opløsning.
Denne gamle metode kræves længere reaktionstider (flere dage), og en multipel oprensningstrin processen, herunder væske / væske-ekstraktion af diethylether og neutralisering med NaHCO3, som nu er elimineret. Ligand syntesereaktioner er nu afsluttet i løbet af få timer ved stuetemperatur, efter at alle reaktanterne tilsættes sammen i et trin. De bispyridin ligander udfældes fra opløsning ved tilsætning af vand (til ligander med 8 eller færre methylengrupper) og udfældes fra opløsning ved dannelse af de 10 og 12 methylengruppe ligander. Alle ligander kan omkrystalliseres fra kogende vand og i nogle tilfælde deres langsomme recrystallordning kan give krystaller er egnede til røntgendiffraktion.
De bicycliske platinkomplekser er fremstillet ved at omsætte to mol transplatin til et mol af bispyridin ligander. Det transeuropæiske labializing effekt af chlorido ligander sikrer, at den største produkt er koordinering af platin narkotika gennem et enkelt sted på bispyridin ligander (nitrogenatomet af ringen). De bicycliske platinkomplekser har god opløselighed dikation salte i både vand, DMF og DMSO.
Oprensning opnås ved fraktioneret udfældning med acetone. Den uidentificerede urenheder udfældes før produktet og bliver fjernet ved filtrering gennem smalle pore filtrerpapir. Det er vigtigt at bemærke, at acetoneudfældning fungerer bedre med stigende mængde af produktet, der skal renses. På mindre end 200 mg, er den metode ikke virker så godt, og kan kræves gentagne acetone nedbør. For beløb omkring 200 mg ellermere, vi har fundet, at der generelt kun kræves en enkelt acetoneudfældning trin.
Mens dette papir beskriver syntesen af specifikke ligander og platin-komplekser, kan de teknikker, der anvendes her, skal anvendes til at syntetisere en langt bredere vifte af ligander og multinucleare platin komplekser. For eksempel, med passende beskyttende grupper andre diaminoalkan ligander, såsom spermin og spermidin, kan bruges til at lave bispyridin ligander. Ikke-symmetriske bispyridin ligander kan også gøres ved hjælp af isonicotinsyre den ene ende og 2-methyl-isonicotinsyre på den anden ende. Disse ikke-symmetriske ligander kan genereres ved anvendelse af FMOC / BOC-beskyttelse på den ene ende af diaminoalkan kæder. Den ubeskyttede amin af kæden kan omsættes med en isonikotinsyre derivat ved hjælp af amid koblingsreaktioner beskrevet. Beskyttelsesgruppen spaltes derefter fra diaminoalkan kæde og en anden derivat af isonicotinsyre er fastgjort ved hjælp af enandre amid koblingsreaktion. Tricycliske platin-komplekser kan også potentielt gøres ved hjælp af en af disse ligander via en tilpasning af en metode, ved hjælp pyrazolylgruppe baserede ligander til at gøre tricycliske, BBR3464-lignende, komplekser 22..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
