Summary
Denne protokollen beskriver bruken av amid-koblingsreaksjoner av isonikotinsyre og diaminoalkanes for å danne bygge bro-ligander som er egnet for anvendelse i syntesen av multinukleære platinakomplekser, som kombinerer deler av anticancer-medikamenter BBR3464 og picoplatin.
Introduction
Platina anticancer legemidler er fortsatt en av de mest brukte familie av midler ved behandling av human cancer 1.. Til tross for sin suksess, er de begrenset gyldighet av alvorlig dosebegrensende bivirkninger 2-4. De begrensede doser som kan administreres til pasienter betyr også at tumorer kan utvikle resistens 5. Som sådan, nye legemidler fortsette å bli utviklet for å bedre bivirkningsprofil og vinne ervervet resistens, som phenanthriplatin 6 og phosphaplatin 7.
På slutten av 1990-tallet, ble en trinuclear platina medikament utviklet, BBR3464 (Skjema 1) 8, som er opp til 1000 x mer cytotoksiske in vitro enn den ledende platina narkotika, cisplatin. BBR3464 er også i stand til å overvinne ervervet resistens i et panel av menneskelige kreftcellelinjer ni. Dessverre er det økt aktivitet av BBR3464 matchet av 50 - til 100 - ganger høyere toksisitet, sombegrenser bruken 10-12. Det er også lett brytes ned i legemet, noe som betyr at lite av medisinen når kreft kjerner intakte 9..
Picoplatin er en mononukleær platinabasert medikament som inneholder en 2-metyl-pyridin-ligand (Skjema 1) 13. Den metylgruppe av dette stoffet beskytter den mot angrep av biologiske nukleofiler; spesielt cystein og metionin inneholder peptider / proteiner 14-16. Som sådan, er stoffet ganske stabile, og har en mye høyere konsentrasjon som når kreftkjerner sammenlignet med både BBR3464 og cisplatin 17. Dens redusert reaktivitet betyr også picoplatin har en høyere maksimal tolerert dose sammenlignet med BBR3464 og cisplatin 10,18,19.
Dette prosjektet derfor søkt å kombinere egenskapene til BBR3464 og picoplatin å produsere nye legemidler som er i stand til å overvinne ervervet resistens som viser forbedret biologisk stabilitet og mindre alvorlige side-effeCTS (f.eks figur 1). Ved å gjøre det, ble en rekke bisykliske platinum komplekser forberedt med bispyridine bridging ligander 20. De ligander foretas ved hjelp av amid-koblingsreaksjoner med isonikotinsyre eller dens derivater som 2-metyl-isonikotinsyre, variabel lengde diaminoalkanes. Omsetning av en mol-ekvivalent av ligandene med to mol-ekvivalenter av transplatin gir de ønskede platinakomplekser (Skjema 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av N, N '-. (Alkan-1, n-diyl) diisonicotinamide
- Tørk en eneste hals-eller tre-halset, rundbunnet kolbe i en ovn (100 ° C, 1 time) for å sikre at all fuktighet er fjernet.
- Legg solid isonikotinsyre, eller dets derivat, til kolben sammen med en magnetisk rørestav. Dersom diaminoalkane liganden (e) er faste stoffer ved værelsestemperatur, deretter 0,5 mol (i tall mol isonikotinsyre) ble tilsatt til kolben på dette stadiet.
- Lokk på halsen (e) av kolben med gummi septa og erstatte luften i kolben med nitrogen, enten gjennom en kontinuerlig nitrogenstrøm eller ved hjelp av nitrogenfylte ballonger.
- Bruk en hypodermisk nål og sprøyte til å legge vannfritt dimetylformamid eller dimetyl-sulfoksyd (4 ml per 500 mg isonikotinsyre eller 2-metyl-isonikotinsyre) for å oppløse det faste stoffet. Hvis de faste stoffene ikke oppløses lett, deretter varme den løsningen forsiktig.
- Legg 7 mol ekvivalenter (til enmontering av isonikotinsyre anvendes) trietylamin (svak base), og 0,5 mol-ekvivalenter av diaminoalkane. Hvis oppløsningen er en væske ved værelsestemperatur, deretter til 1,5 mol-ekvivalenter.
- Tilsett en mol-ekvivalent av 1-propylphosphonic anhydrid (koblingsmiddel) med kontinuerlig omrøring og tillat reaksjonsblandingen for å fullføre enn 5-12 timer.
2.. Rensing av de ligander
- For bispyridine ligander laget med diaminoalkane ligander med 10 eller flere metylengrupper, vente på produktene for å felle ut fra løsningen som reaksjonen utvikler seg.
- For bispyridine ligander laget ved hjelp diaminooctane, felle ut produktet ved tilsetning av ~ 40 ml vann.
- For bispyridine laget ved hjelp diaminoalkanes av 5:58 metylengrupper, legge ~ 40 ml vann og lar forbindelsene å utkrystallisere enn 1-3 dager.
- Samle hver bispyridine ligand ved vakuumfiltrering og omkrystalliser fra omtrent 400 til 500 ml kokende vann per 200mg av ligand. Merk: Mer vann er nødvendig for de lengre bispyridine ligander på grunn av sin mye redusert løselighet i vann.
- Til NaOH og KOH (pH 9) til oppløsningen for å sikre at forbindelsene er frie baser ved omkrystallisering.
Tre. Syntese og rensing av bisykliske Platinum Komplekser
- Fullt oppløse trans-diamminodichloridoplatinum (II), transplatin, i varm (70-80 ° C) vann (150 ml per 200 mg av transplatin) for å frembringe en klar sterkt gulfarget oppløsning.
- Til en 0,5 mol-ekvivalent av bispyridine ligand og omrør løsningen ved en temperatur inntil ligand oppløses (klar løsning). Vent til løsningen for å slå nær fargeløst, slå av varmen, og omrør ved romtemperatur i noen få ytterligere timer.
- Fjern løsningsmidlet ved roterende fordampning, noe som vil gi et gult farget pulver.
- Rens, platina-kompleks (e) ved å løse opp i en minimal mengde varmt vann (~ 50 &# 186; C). Hvis gjenværende gule eller hvite fargede faste stoffer er til stede, deretter filtrere disse av.
- Legg aceton til oppløsningen inntil et hvitt bunnfall dannes, som synes å være en polymer form av metallkomplekser, og representerer opp til 10% av reaksjonsproduktet. Fortsett tilsetning av aceton (~ ekstra 20-30 ml) inntil ikke mer bunnfall vises. Merk: Dette hvite bunnfall er en urenhet.
- Fjern dette bunnfall ved å filtrere innholdet gjennom nylonfilterpapir (0,2 um porestørrelse) og rotasjonsfordamper den resterende løsningen til tørrhet, noe som vil gi et rent produkt. Merk: Hvis det er nødvendig, kan deretter ytterligere aceton nedbørs trinn utføres før komplekset er ren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bispyridine ligander og deres respektive bisykliske platinakomplekser er karakterisert ved en H, 13 C og 195Pt NMR (Tabeller 1 og 2), og electrospray ionisering massespektroskopi. Nøyaktige smeltepunkter kan bestemmes ved hjelp av differensial scanning kalorimetri, og renhet kan best bestemmes ved elementanalyse for C, H og N prosentinnholdet. Størst nytte er en H NMR som det er raskt og enkelt å bruke, og gir resultater i løpet av minutter med isolasjon av de endelige produktene med resonanser som kan definitivt demonstrere vellykkede amid kopling og platina koordinering (tabell 1 og 2).
Isonikotinsyre har tre resonanser; to dubletter i den aromatiske regionen (7-9 ppm) og en svært bred resonans rundt 13 ppm til karboksylsyren proton. De diaminoalkane proton resonanser er alle plassert i den alifatiske regionen mellom 1 og 4 ppm. Som tHan lengden av diaminoalkane kjeden øker mange av de metylengrupper resonanser blir tilsvarende, og som sådan, er færre topper observert i den alifatiske område enn det som ville være forventet; selv om de er vesentlig mer intens og kan tildeles løst ved sine integrasjoner (tabell 1 og 2). For eksempel, se figur 1 og 2 for den kjemiske struktur og 1H NMR-spektra av det N, N '- (oktan-1 ,8-diyl) bis (isonikotinamid), biao, ligand. På grunn av symmetri i molekylet fem alifatiske resonanser normalt kan forventes for biao; men de fire indre mest metylenbroer toppene er alle magnetisk tilsvarende og vise seg som en stor resonans på ~ 1,2 ppm.
Aminet proton resonans av ukoblede diaminoalkane kjeden ligger i den alifatiske regionen og er den viktigste resonans når den beveger seg vesentlig nedover i feltet, i den aromatiske region, ved kopling to karboksylsyren. Den etterfølgende amid proton resonans sett rundt 8,7 ppm for alle disse ligander, som en forholdsvis bred triplett resonans (figur 2).
Samordning av platinagruppen til de bispyridine ligander er observert gjennom selektive skift av ligand sin aromatiske resonanser (0,15 ppm nedfelt skift av HA resonanser og 0,07 ppm upfield forskyvning av Hb resonanser) og overholdelse av platina kopling på dublett resonans for den Ha protoner (figur 3). Samordning av platina grupper til bispyridine ligand kan også observeres enkelt ved hjelp av 195 Pt NMR. Den kjemiske forskyvning av en platina resonans er direkte relatert til de typer atomer koordinerte 21.. Chlorido ligander skifte 195 Pt resonanser downfield (mot 0 ppm), og jeg er (m) ino ligander skifte resonansen upfield (mot -2500 ppm). De bisykliske platinum komplekser syntetisert her viser en enkelt r esonance rundt -2300 ppm på grunn av den 3 x am (m) ino-og 1 x chlorido koordinering tilstand (figur 4) 22. Ureagert transplatin urenhet ville vise som en resonans rundt -2100 ppm mens hvis to ligander reagerte med et enkelt transplatin molekyl (4 x am (m) ino miljø), så dette urenhet ville være upfield av -2400 ppm 22.
Reaksjonsskjema 1. De kjemiske strukturene av narkotika platina picoplatin og BBR3464 og det generelle synteseskjema for syntesen av bispyridine ligander og deres respektive bisykliske platinakomplekser.; R = H eller CH 3; . n = 1-6 motioner for platinakomplekser er utelatt; ved hjelp av metoden som er beskrevet her er de dichloride salter.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Den kjemiske struktur av N, N '-.. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonikotinamid) ligand, biao, og proton nummereringsordningen anvendes for tildeling av resonansen i 1H NMR merke til ekvivalens av de fire metylenprotoner (He) i midten av molekylet.
Figur 2 1 H NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) spekteret av N, N '-. (Oktan-1 ,8-diyl) bis (isonikotinamid), Biao Legg merke til plasseringen av tripletten amid resonans på rundt 8,7. ppm, opp fra 1-2 ppm for diaminooctane amin resonans før kopling.
Figur 3. The 1H NMR (D-2-O, 400 MHz) spekteret av trans-[{Pt (NH3) 2-Cl} 2 μ-Biao] 2 +. Merke til platina kopling på den aromatiske Ha resonans ved 8,82 ppm.
Fig. 4. The 195Pt NMR (D 2 O, 400 MHz) spekteret av trans-[{Pt (NH3) 2-Cl}. 2 μ-biao] 2 + Merk singelen bred resonans rundt -2300 ppm som er konsistent med en PTN 3 Cl miljø; N = am (m) ine.
Tabell 1. De 1 H NMR-karakterisering av data i de bispyridine ligander i DMSO-d6 ved 400 MHz d = dublett..; t = lett; q = kvartett; m = plett.
Tabell 2. Den 1 H NMR karakterisering data av bisykliske platinum komplekser i D 2 </ Strong> O på 400 MHz d = dublett.; t = lett; q = kvartett; m = plett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbeidet bisykliske platinakomplekser har vært syntetisert som potensielle anticancermidler. Ved å gjøre det bispyridine bridging ligander ble syntetisert via en amid koblingsreaksjon ved hjelp isonikotinsyre og variabel lengde diaminoalkanes. Tidligere syntesen av bispyridine ligander og deres metyl-analoger med 2 til 8 metylengrupper og deres respektive platinakomplekser har vært rapportert. I denne utredningen, har syntese og rensing metoden blitt revidert slik at det er raskere og billigere, og har vist dette ved å syntetisere bispyridine ligander med 8, 10 og 12 metylengrupper (den korteste med de åtte metylengrupper, biao, ble gjort for å sammenligne den nye rensemetode til den eldre metoden). Bisykliske platina komplekser ble også gjort ved hjelp av disse ligander.
Syntesen av de bispyridine ligander ble gjennomført i vannfritt oppløsningsmiddel og under en inert nitrogenatmosfære ved bruk av trietylamin som en svak basepropylphosphonic anhydrid som koblingsmiddel. Enten DMF eller DMSO, kan brukes som oppløsningsmiddel, selv om den isonikotinsyre oppløses bedre i DMSO enn det gjør i DMF. For hver løsningsmiddel, forsiktig oppvarming under en rennende strøm av varmt vann kan brukes for å lette oppløsningen.
Denne gamle metode kreves lengre reaksjonstider (flere dager) og en fler-trinns renseprosess inkluderer væske / væske-ekstraksjon mot dietyleter og nøytralisering med NaHCO 3, som nå er eliminert. Liganden syntesereaksjoner er nå fullført i løpet av noen timer ved romtemperatur etter at alle reaksjonskomponentene er lagt sammen i ett trinn. De bispyridine ligander utfelles fra oppløsningen ved tilsetning av vann (for ligander med 8 eller færre metylengrupper), og utfelles fra oppløsningen ved dannelse på 10 og 12 metylengruppe ligander. Samtlige ligander kan omkrystalliseres fra kokende vann, og i noen tilfeller deres sakte Omkrystalliseringenization kan gi krystaller egnete for røntgendiffraksjon.
De bisykliske platinakomplekser er laget ved å omsette to mol av transplatin til et mol av bispyridine ligander. Den trans-labializing effekten av chlorido ligander sikrer at hovedproduktet er koordinering av platina legemidler gjennom et enkelt område på bispyridine ligander (nitrogenatomet i ringen). De bisykliske platinum komplekser har god løselighet som indikasjon salter i både vann, DMF og DMSO.
Rensing oppnås ved fraksjonert ventet ved hjelp av aceton. Den uidentifisert urenhet utfelles før produktet og blir fjernet ved filtrering gjennom trange porer filterpapir. Det er viktig å merke seg at acetonutfelling fungerer bedre med økende mengde av produktet som skal renses. På beløp mindre enn 200 mg, ikke metoden fungerer ikke så godt og gjentatte aceton Nedbøren kan være nødvendig. For beløp rundt 200 mg ellermer har vi funnet at enslige aceton nedbørs skritt er vanligvis bare nødvendig.
Mens dette papiret beskriver syntesen av spesifikke ligander og platinakomplekser, kan de teknikker som er brukt her anvendes for å syntetisere et mye større utvalg av ligander og multinukleære platinakomplekser. For eksempel, med egnede beskyttende grupper andre diaminoalkane ligander, slik som spermin og spermidin, kan brukes til å lage bispyridine ligander. Ikke-symmetrisk bispyridine ligander kan også gjøres ved hjelp av isonikotinsyre i den ene enden, og 2-metyl-isonikotinsyre i den andre enden. Disse ikke-symmetriske ligander kan genereres ved bruk av Fmoc / BOC-beskyttelse på én ende av de diaminoalkane kjedene. Den ubeskyttede aminet av kjeden kan omsettes med et isonikotinsyre-derivat ved hjelp av amid-koblingsreaksjoner er beskrevet. Den beskyttende gruppe blir så spaltet fra diaminoalkane kjeden og et annet derivat av isonikotinsyre er festet ved hjelp av enandre amid-koblingsreaksjon. Trinuclear platina komplekser kan også potensielt bli gjort ved hjelp av noen av disse ligander via en filmatisering av en metode med pyrazolyl-baserte ligander å gjøre trinuclear, BBR3464-aktig, komplekser 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al.
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
