Summary
Bu protokol, antikanser ilaçların BBR3464 ve pikoplatin yönlerini birleştiren çok çekirdekli platin kompleksleri, sentezinde kullanılmak için müsait köprü ligandlar oluşturmak için izonikotinik asit ve diamino-amid birleştirme reaksiyonlarının kullanımı açıklanmaktadır.
Introduction
Platinum antikanser ilaçların, insan kanserinin 1 tedavisinde maddelerinin en yaygın olarak kullanılan ailesinin olmaya devam etmektedir. Onların başarısına rağmen, şiddetli doz sınırlayıcı yan etkileri 2-4 tarafından uygulanması sınırlıdır. Hastalara tatbik edilebilir sınırlı dozları da tümörlerin 5 direnç geliştirebilir anlamına gelir. Gibi, yeni ilaçlar yan etki profilini geliştirmek ve phenanthriplatin 6 ve 7 phosphaplatin gibi, kazanılmış direnci aşmak için geliştirilmeye devam ettikçe.
1990'lı yılların sonlarında, bir trinuclear platin ilaç, BBR3464 (Şema 1) 8, bu lider platin ilaç, sisplatin daha in vitro kadar 1.000 x daha sitotoksiktir geliştirilmiştir. BBR3464 de insan kanser hücre çizgileri 9 oluşan bir panelde kazanılmış direncinin üstesinden gelmek edebilmektedir. Ne yazık ki, BBR3464 artan aktivitesi 50 ile uyumludur - 100 - daha yüksek toksisite, kat hangi10-12 kullanımını sınırlar. Ayrıca kolayca ilacın bir önemi, vücutta parçalanır 9 sağlam kanser çekirdek ulaşır.
Pikoplatin, 2-metil-piridin ligant (Şema 1), 13 ihtiva eden bir tek çekirdekli platin bazlı bir ilaçtır. Bu ilacın metil grubu biyolojik nükleofiller ile saldırılara karşı korur; , özellikle sistein ve peptitler / proteinler 14-16 ihtiva eden metionin. Bu nedenle, ilaç oldukça kararlıdır ve BBR3464 ve sisplatin hem de 17 ile karşılaştırıldığında kanser çekirdek ulaştığında çok daha yüksek bir konsantrasyona sahiptir. Bu azaltılmış reaktivitesi de pikoplatin BBR3464 ve sisplatin 10,18,19 ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir maksimum tolere edilen dozu anlamına gelir.
Bu proje, bu nedenle gelişmiş biyolojik stabilite ve daha az ciddi yan effe görüntülemek kazanılmış direnci aşmak için edebiliyoruz yeni ilaçlar üretmek BBR3464 ve pikoplatin özelliklerini birleştirmek için çalıştıcts (örneğin, Şekil 1). Bu şekilde, iki çekirdekli platin kompleksleri, bir dizi köprü bispiridin ligandlar 20 ile hazırlanmıştır. Ligandlar izonikotinik asit, ya da 2-metil-izonikotinik asit, değişken uzunluk diamino gibi onun türevleri ile amit birleştirme reaksiyonları kullanılarak yapılır. Transplatin iki mol eşdeğeri ile, ligandların bir mol eşdeğer reaksiyonu, arzu edilen platin kompleksleri (Şema 1) oluşur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. N, N 'sentezi -. (Alkan-1, n-diil) diisonicotinamide
- Nem da engel olmak için bir fırında (100 ° C, 1 st) tek bir boyun ya da üç-boyunlu, yuvarlak tabanlı bir şişeye kurutun.
- Manyetik bir karıştırma çubuğu ile birlikte şişeye, katı izonikotinik asit veya bunun bir türevini ekleyin. Diaminoalkane ligand (lar), oda sıcaklığında katı ise, o zaman (izonikotinik asit sayısı mol) 0.5 mol, bu aşamada şişeye ilave edilir.
- Kauçuk septa ile şişenin boyun (ler) kapak ve bir azot akımı ile sürekli bir ya da azot doldurulmuş balonlardan kullanımı yoluyla ya da azot ile birlikte bir şişe içindeki havayı değiştirin.
- Katı çözünmesi susuz dimetilformamid ya da dimetilsülfoksit (izonikotinik asit veya 2-metil-izonikotinik asit 500 mg başına 4 mi) eklemek için bir hipodermik bir iğne ve şırınga kullanın. Katılar kolayca çözülür yoksa, o zaman çözelti hafifçe ısıtılır.
- A 7 mol eşdeğer (ekletrietilamin (zayıf baz) ve diaminoalkane 0.5 mol eşdeğerleri kullanılır izonikotinik asit) montaj. Çözelti, oda sıcaklığında bir sıvı ise, 1.5 mol eşdeğer ekleyin.
- Sürekli karıştırma ile 1-propilfosfonik anhidrid (bağlama maddesi) bir mol eşdeğeri eklenir ve reaksiyon 5-12 saat içinde tamamlanması için izin verir.
Ligandların 2. Saflaştırılması
- Reaksiyon ilerledikçe ürün çözeltiden çökeltilmesi için 10 veya daha fazla metilen grubu ile diaminoalkane ligandları kullanılarak yapılan bispiridin ligandları için, bekle.
- Bispiridin ligandlar diaminooctane kullanılarak yapılan için, ~~~iobj 40 ml su ilave edilerek ürün çökeltildi.
- Bispiridin 2-6 metilen grupları diamino kullanılarak yapılan için, su ~ 40 ml ekleyin ve bileşikler 1-3 gün boyunca kristalleşmeye izin verir.
- Vakum filtreleme işlemi ile her bispiridin ligand toplamak ve 200 kaynar su başına yaklaşık 400-500 ml yeniden kristalizeLigandın mg. Not: Daha fazla su onların çok düşük su çözünürlüğü nedeniyle uzun bispiridin ligandlar için gereklidir.
- Bileşikler yeniden kristalleştirme üzerine serbest bazlar olmasını sağlamak için çözeltiye NaOH ve KOH (pH 9) ilave edin.
Çekirdekli Platin Kompleksleri 3. Sentezi ve saflaştırılması
- Tam olarak (II), transplatin, sıcak (70-80 ° C) su içinde (200 mg transplatin 150 mi), berrak bir kuvvetli sarı renkli bir solüsyon elde etmek trans-diamminodichloridoplatinum çözülür.
- Bispiridin ligand 0,5 mol eşdeğeri, ekleme ve çözünene ligand (berrak bir çözelti) kadar bir sıcaklıkta çözelti karıştırın. , Renksiz yakın açmak çözüm için bekleyin ısı kapatın ve birkaç ek saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.
- Sarı renkli bir toz elde edecek, döner buharlaştırma ile çözücünün çıkarın.
- Minimum sıcak su miktarı (~ 50 ve içinde çözülmesi ile, platin kompleksi (ler) arıtın186., C). Kalan sarı veya beyaz renkli katılar varsa, o zaman bu filtre kapalı.
- Metal kompleksleri bir polimerik formu olarak görünür ve reaksiyon ürününün% 10 kadar temsil beyaz bir çökelti oluşana dek çözeltisine aseton ekleyin. Daha fazla çökelti görünene kadar aseton ilave edilmesini (~ 20-30 ml ilave) devam edin. Not: Bu beyaz çökelek bir kirlilik olduğunu.
- Naylon filtre kağıdı (0.2 um gözenek boyutu) ve saf bir ürün elde edecek kuruyana geri kalan çözelti, döner buharlaştırmak ile filtre içeriği bu çökelti çıkarın. Not: Gerekirse, daha sonra ilave aseton çökeltme adımları karmaşık saf kadar gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bispiridin ligandları ve ilgili iki çekirdekli platin kompleksleri, 1 H, 13 ° C ve 195 Pt NMR (Tablo 1 ve 2) ve bir elektrosprey iyonizasyon kütle spektroskopisi ile karakterize edilir. Doğru erime noktaları en iyi C, H ve N yüzde içeriği için element analizi ile tespit edilir, diferansiyel tarama kalorimetresi ve saflık kullanılarak belirlenebilir. Kesin olarak başarılı amid birleştirme ve platin koordinasyon (Tablo 1 ve 2) göstermek rezonanslarının ile nihai ürünlerin izolasyonu dakika içinde sonuç veren, hızlı ve kullanımı kolay olduğu gibi en kullanımı 1H NMR olduğunu.
Izonikotinik asit üç rezonansı; karboksilik asit, proton için iki aromatik bölgesinde ikili (7 ppm ila 9) ve çok geniş bir rezonans yaklaşık 13 ppm. Diaminoalkane proton rezonans her 1 ile 4 ppm arasında alifatik bölgesinde bulunmaktadır. T olarako metilen rezonansların çok diaminoalkane zincir uzunluğu artar eşdeğer hale gelir ve bu gibi daha az sayıda tepe beklenenden daha alifatik bölgesinde görülmektedir; önemli ölçüde daha yoğun olan ve entegrasyon (Tablo 1 ve 2) ile gevşek bir şekilde tayin edilebilir, ancak. Örneğin, kimyasal yapısı ve N, N '1H NMR spektrumları için Şekil 1 ve 2'ye bakınız - (oktan-1 ,8-diil) bis (izonikotinamid), biao, ligand. Nedeniyle molekül içinde simetrisine beş alifatik rezonans normal Piao'nun için beklenir; ancak dört iç en metilen piki manyetik eşdeğer ve ~ 1.2 ppm de büyük bir rezonans gibi göstermek.
Bağlanmamış diaminoalkane zinciri amin proton rezonans alifatik bölgesinde yer alır ve bağlama t üzerine, aromatik bölgeye, önemli ölçüde aşağı alanda hareket ederken en önemli rezonans olduğunukarboksilik asit o. Takip eden amid proton rezonans nispeten geniş triplet rezonans (Şekil 2) gibi, bu ligandlann her için yaklaşık 8,7 ppm görülmektedir.
Bispiridin ligandlanna platin grubunun koordinasyon ligandın aromatik rezonanslarının ve için ikili rezonans platin kaplin gözetilmesi (Ha rezonanslarının kayması ve Hb rezonanslarının kayması yukarı alana 0.07 ppm aşağıalanı 0.15 ppm) seçici vardiya ile gözlemlenir Ha protonlar (Şekil 3). Bispiridin ligand platin grupların koordinasyon da 195 Pt NMR kullanılarak kolaylıkla görülebilir. Platin rezonans kimyasal kayma doğrudan 21 koordine atomlu türleri ile ilgilidir. Ligandlar (-2500 ppm doğru) rezonanslarını yukarı alana kaydırmak ino Chlorido ligandlar (0 ppm doğru) 195 Pt rezonansı aşağıalanı vardiya ve (m) duyuyorum. Buradan sentezlenen dinükleer platin kompleksleri, tek r göstermektedir nedeniyle 3 x am (m) ino ve 1 x chlorido koordinasyon devlet (Şekil 4) 22 civarında -2300 ppm esonance. Iki ligandlar tek transplatin molekülün (4 x ÖS (m) ino çevre) ile reaksiyona ise bu kirlilik -2400 ppm 22 yukarı alana olurdu oysa reaksiyona girmemiş transplatin kirlilik bir rezonans olarak etrafında -2100 ppm gösterecektir.
Şema 1 ve pikoplatin BBR3464 ve bispiridin ligandları ve ilgili iki çekirdekli platin komplekslerinin sentezi için genel sentetik bir şema, platin ilaçların kimyasal yapıları.; R = H ya da CH3; . n = 1-6, platin kompleksleri için karşı iyonlar atlanmıştır; Burada açıklanan yöntemi kullanarak bunlar diklorür tuzlarıdır.
tp_upload/51740/51740fig1highres.jpg "/>
Şekil 1, bu N, N 'kimyasal yapısı -.. (Oktan-1 ,8-diil) bis (izonikotinamid) ligand, biao ve 1H NMR rezonansların atama için kullanılan proton numaralandırma şeması denkliğini not molekülün merkezinde dört metilen protonlarının (O) arasında.
Şekil 2, 1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz), N, N 'spektrum -. (Oktan-1 ,8-diil) bis (izonikotinamid), biao de yaklaşık 8.7 triplet amid rezonans konumunu not. yukarı birleşmeden önce diaminooctane amin rezonans için 1-2 ppm ppm.
Şekil 3,. 1H NMR (D 2 O, 400 MHz), trans-spektrumu [{Pt (NH3) 2 Cl} 2 μ-biao] 8.82 ppm'de aromatik Ha rezonans 2 +. Not platin bağlantı.
Şekil 4,. 195 Pt NMR (D 2 O, 400 MHz) spektrumunu trans-[{Pt (NH3) 2 Cl}. 2 μ-biao] 2 + bir ptn 3 Cl çevre ile tutarlı etrafında -2300 ppm geniş tek rezonans Not; N = am (m) ine.
Tablo 1, 400 MHz, d = çiftli DMSO-d6 içindeki bispiridin ligandların 1H NMR karakterizasyon verileri..; t = üçlü; q = kuartet; m = çoklu.
Tablo 2. D 2'deki iki çekirdekli platin komplekslerinin 1H NMR karakterizasyonu verileri </ Strong> O 400 MHz d = ikili.; t = üçlü; q = kuartet; m = çoklu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada iki çekirdekli platin kompleksleri, potansiyel anti-kanser maddeler olarak sentezlendi. Bunu yaparken bispiridin köprü ligandlan izonikotinik asit ve değişken uzunluk diamino kullanarak bir amit birleştirme reaksiyonu ile sentezlendi. Daha önce 2-8 metilen grupları ve ilgili platin kompleksleri ile bispiridin ligand ve bunların metil analoglarının sentezi rapor edilmiştir. Bu yazıda, sentezi ve bir saflaştırma yöntemi, daha hızlı ve daha ucuz hale revize edilmiş ve 8, 10 ve 12 metilen grup (sekiz metilen grupları ile birlikte kısa bispiridin ligandların sentezlenmesi ile, bu göstermiştir, biao, yeni bir karşılaştırma yapıldı eski yönteme saflaştırma yöntemi). Çekirdekli platin kompleksleri de, bu ligandları kullanılarak yapılmıştır.
Bispiridin ligandların sentezi zayıf bir baz olarak trietilamin kullanılarak, susuz bir çözücü içerisinde ve bir atıl azot atmosferi altında tamamlanmıştır ve karışımbirleştirme maddesi olarak propilfosfonik anhidrid. Izonikotinik asit bu, DMF, DMSO göre daha iyi çözünür, ancak DMF ya da DMSO ya, çözücü madde olarak da kullanılabilir. Sıcak su akışı altında çalışan bir çözgen, nazik ısıtma ya da çözülmeye yardımcı olmak için kullanılabilir için.
Bu eski yöntem uzatılmış reaksiyon süreleri (birkaç gün) ve artık ortadan NaHCO 3, dietil eter ve nötralizasyon karşı sıvı / sıvı çıkarımı da dahil olmak üzere bir çok aşamalı bir saflaştırma işlemi gerekir. Tüm reaktantlar birlikte bir aşamada ilave edilir sonra ligand sentez reaksiyonları hemen, oda sıcaklığında birkaç saat içinde tamamlanır. Bispiridin ligandlar (8 ya da daha az metilen grubu ile ligandlar için) su eklenmesi ile çözeltiden çökelen ve 10 ve 12 metilen grubu ligandlar için formasyonu üzerine çözeltiden çökelir. Bütün ligandlar yavaş recrystall kaynar su ve bazı durumlarda yeniden kristalize edilebilir-laşma X-ışını difraksiyonu için müsait kristaller verebilir.
Dinükleer platin kompleksleri bispiridin ligandların bir molüne transplatin iki mol reaksiyona sokulması ile yapılır. Chlorido ligandların trans-labializing etkisi, ana ürün bispiridin ligandların (halkanın nitrojen atomu) tek site üzerinden platin koordinasyon ilaçların olmasını sağlar. Dinükleer platin kompleksleri, su, DMF ve DMSO hem de ZORLUTUNA tuzları gibi iyi bir çözünürlüğe sahiptir.
Aseton kullanılarak saflaştırma ayrımsal çöktürme yoluyla elde edilir. Tanımlanamayan yabancı madde, ürün önce çökelir ve dar gözenekli filtre kağıdı içinden süzme ile çıkarılır. Bu aseton yağış arıtılacak ürün artan miktarda daha iyi çalışır dikkat etmek önemlidir. 200 mg'den daha az miktarlarda olarak, bu yöntem de çalışmaz ve tekrar aseton çökeltiler gerekli olabilir. 200 mg veya yaklaşık miktarlar içinDaha biz tek aseton yağış adımlar genellikle sadece gerekli olduğunu bulduk.
Bu kağıt özel ligandlar ve platin komplekslerinin sentezini detayı iken, burada kullanılan teknik ve ligandların çok çekirdekli platin komplekslerinin çok daha geniş bir aralık sentezlenmesi için uygulanabilmektedir. Örneğin, uygun koruma grupları ile bu tür spermin ve spermidin gibi diğer diaminoalkane ligandları, bispiridin ligandları yapmak için kullanılabilir. Non-simetrik bispiridin ligandlar aynı zamanda, bir ucunda izonikotinik asit kullanılarak yapılan ve diğer ucunda 2-metil-izonikotinik asit olabilir. Bu non-simetrik ligandlar diaminoalkane zincirlerinin bir ucunda FMOC / BOC-koruma kullanımı ile elde edilebilir. Zincirin korumasız amin açıklanan amit birleştirme reaksiyonları kullanılarak izonikotinik türevi ile reaksiyona sokulabilir. Koruma grubu daha sonra diaminoalkane zinciri yarılır ve izonikotinik asitten farklı bir türevi kullanılarak, bağlı olduğuDiğer amit birleştirme reaksiyonu. Üç çekirdekli platin kompleksleri de potansiyel Üç çekirdekli için pirazolil-tabanlı ligandları kullanarak bir yöntemin bir adaptasyonu ile, bu ligandlann herhangi biri kullanılarak yapılabilir, BBR3464 gibi, 22, kompleksleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D2O | Aldrich | 151882 | 99.9% D |
| DMSO-d6 | Aldrich | 156914 | 99.96% D |
| 1,8-diaminooctane | Aldrich | D22401 | 98% |
| 1,10-diaminodecane | Aldrich | D14204 | 98% |
| 1,12-diaminododecane | Aldrich | D1,640-1 | 98% |
| Isonicotinic acid | Aldrich | I17508 | 99% |
| 1-Propylphosphonic anhydride solution | Aldrich | 431303 | 50 wt% in ethyl acetate |
| Trans-diaminodichloridoplatinum(II) | Aldrich | P1525 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | Z76855 | >99.9%, anhydrous |
| N,N’-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | 99.8%, anhydrous |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | T0886 | >99% |
| Nylon filter membranes | Whatman | 7402-004 | Pore size, 0.2 µm |
| Magnetic stirring hotplate | |||
| Magnetic stirring bar | |||
| Round bottom or three neck flask | |||
| Rubber septums of sufficient size for chosen round bottom or three neck flask | |||
| 5 ml hypodermic syringes | |||
| Hypodermic needles | |||
| Rubber party ballons | |||
| Rubber bands | |||
| A source of N2 gas | |||
| Rotary evaporator | |||
| Drying oven | |||
| NMR tubes | |||
| NMR spectrometer | |||
| 500 ml beakers | |||
| Glass or plastic pipettes |
References
- Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Trans. 39, 8113-8127 (2010).
- Kiernan, M. C. The pain with platinum: oxaliplatin and neuropathy. Eur. J. Cancer. 43, 2631-2633 (2007).
- Markman, M., et al. Clinical features of hypersensitivity reactions to carboplatin. J Clin. Oncol. 17, 1141-1145 (1999).
- Ding, D., Allman, B. L., Salvi, R. Review: Ototoxic characteristics of platinum antitumor drugs. Anatomical Rec. 295, 1851-1867 (2012).
- Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31, 1869-1883 (2012).
- Park, G. Y., Wilson, J. J., Song, Y., Lippard, S. J. Phenanthriplatin, a monofunctional DNA-binding platinum anticancer drug candidate with unusual potency and cellular activity profile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 11987-11992 (2012).
- Moghaddas, S., et al. next generation platinum antitumor agents: A paradigm shift in designing and defining molecular targets. Inorg. Chim. Acta. 393, 173-181 (2012).
- Farrell, N. P. Platinum formulations as anticancer drugs clinical and pre-clinical studies. Curr. Top. Med. Chem. 11, 2623-2631 (2011).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum complexes as anti-cancer drugs. Coord. Chem. Rev. 241, 133-145 (2003).
- Gourley, C., et al. A phase I study of the trinuclear platinum compound, BBR3464, in combination with protracted venous infusional 5-fluorouracil in patients with advanced cancer. Cancer Chemoth. Pharmacol. 53, 95-101 (2004).
- Calvert, A. H., et al. Phase II clinical study of BBR3464, a novel, bifunctional platinum analogue, in patients with advanced ovarian cancer. Eur. J. Cancer. 37, (2001).
- Jodrell, D. I., et al. Phase II studies with BBR3464, a novel tri-nuclear platinum complex, in patients with gastric or gastro-oesophageal adenocarcinoma. Eur. J. Cancer. 40, 1872-1877 (2004).
- William, W. N., Glisson, B. S. Novel strategies for the treatment of small-cell lung carcinoma. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 611-619 (2011).
- Raynaud, F., et al. cis-Amminedichloro(2-methylpyridine) Platinum(II) (AMD473), a novel sterically hindered platinum complex: In vivo activity, toxicology, and pharmacokinetics in mice. Clin. Cancer Res. 3, 2063-2074 (1997).
- Holford, J., et al. biochemical and pharmacological activity of the novel sterically hindered platinum co-ordination complex cis-[amminedichloro(2-methylpyridine)] platinum(II) (AMD473). Anti-Cancer Drug Des. 13, 1-18 (1998).
- Munk, V. P., et al. Investigations into the interactions between DNA and conformationally constrained pyridylamine platinum(II) analogues of AMD473. Inorg. Chem. 42, 3582-3590 (2003).
- Wheate, N. J., Collins, J. G. Multi-nuclear platinum drugs: A new paradigm in chemotherapy. Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents. 5, 267-279 (2005).
- Beale, P., et al. A phase I clinical and pharmacological study of cis-diamminedichloro(2-methylpyridine) platinumm II (AMD473). British journal of cancer. 88, 1128-1134 (2003).
- Sessa, C., et al. Clinical and pharmacological phase I study with accelerated titration design of a daily times five schedule of BBR3464, a novel cationic triplatinum complex. Ann. Oncol. 11, 977-983 (2000).
- Brown, S. D., et al. Combining aspects of the platinum anticancer drugs picoplatin and BBR3464 to synthesize a new family of sterically hindered dinuclear complexes; their synthesis, binding kinetics and cytotoxicity. Dalton Trans. 41, 11330-11339 (2012).
- Still, B. M., Anil Kumar, P. G., Aldrich-Wright, J. R., Price, W. S. 195Pt NMR - Theory and application. Chem. Soc. Rev. 36, 665-686 (2007).
- Wheate, N. J., Cullinane, C., Webster, L. K., Collins, J. G. Synthesis, cytotoxicity, cell uptake and DNA interstrand cross-linking of 4,4'-dipyrazolylmethane-linked multinuclear platinum anti-cancer complexes. Anti-Cancer Drug Des. 16, 91-98 (2001).
