Summary
바렛 식도의 분자 드라이버에 대한 개선 된 정보를 식별 할 필요가있다. 면역 형광 염색은 세포 형태에 세포 신호 전달의 효과를 이해하기위한 유용한 기술이다. 우리는 바렛 식도 세포의 치료 적 처치를 평가하기 위하여 면역 형광 염색법을 사용하기위한 간단한 효과적인 프로토콜을 제시한다.
Abstract
식도 선암 (EAC)는 전체 생존보다 17 %의 속도와 EAC의 발병률은 지난 20 년 동안 극적으로 증가했다가 있습니다. EAC의 주요 위험 요인 중 하나는 바렛 식도 (BE), 만성 가슴 앓이에 대한 응답으로 정상 편평 식도의 화생이 있으면서 변화입니다. EAC 사이의 잘 설정된 연결에도 불구하고, 분자 이벤트의 진행을 포함 특히 변경된 신호 전달 경로의 심문은 EAC에, 제대로 이해 못할 것이다. 이 중 대부분은 이러한 질병을 연구하는 데 사용할 수 체외 모델에 적합한의 부족 때문이다. 최근 불후의 BE 세포주 BE의 생체 연구를 허용 시판되고있다. 여기서, 우리는 치료 화합물에 노출 된 후 세포 신호 및 구조의 시험 관내 특성화 있도록 BE 불멸화 세포주의 면역 염색을위한 방법을 제시한다. 이러한 기술의 적용은 그러는 것p는 EAC 진행하는에 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 개발하고 치료 및 EAC의 예방을위한 잠재적 인 수단을 제공합니다.
Introduction
바렛 식도 (BE)은 식도의 편평 상피 세포 및 정상적인 위 식도 역류 질환 (GERD) (1)로부터 얻어진 위 내용물에 대한 만성 노출의 결과에 화생이 있으면서 변화이다. BE는 GERD에 대한 응답으로 보호 메커니즘 것으로 생각됩니다, 그러나 BE의 존재는 식도 선암 (EAC), 현저하게 생존율 1을 전달하는 질병의 증가 위험을 부여. 현재 견적은 미국 인구의 최대 5.6 %가달라고하는 것이 좋습니다 BE는 종종 무증상으로, 그러나, BE의 대부분이이 진단되지 않은 남아 있다고 생각합니다. GERD와 EAC 모두의 발생률이 계속 성장 3 본 바와 같이,이 정보는 잠재적으로 EAC하는의 진행을 방지하는 방향으로 치료 방법을 제공 할 수있다, 특히로, EAC하는의 진행에 관여하는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요 해지고있다.
1의 현재 패러다임에 성공. 만성 염증, 상처, 그리고 위의 내용에 장기간 노출로 인한 유전 독성 피해는 EAC에 종양의 진행을 촉진 BE 병변에 선택적 압력을 발휘. 유전 변경의 숫자는 동안 EAC 진행하는 확인되었습니다. 그러나 이것에도 불구하고 세포 신호의 정확한 변화와 세포의 구조와 기능에 따라 이후의 영향에 대한 이해의 명백한 부족하다.
특히 표적 치료 화합물의 효과를 조사에서, 세포 신호 전달의 효과를 연구하기위한 유용한 도구가 시험 관내 세포 라인에 불멸화. 불후의 BE 세포주의 최근 상용화는 연구 할 수 있습니다. 이러한 널리 사용 생존력 분석 높은 처리량 분석법은 세포 증식 및 스와시 타겟 요법의 효과를 평가하는데 유용 할 수 있지만rvival 4-6, 이러한 분석은 세포 형태에 따라 세포 신호 전달의 효과를 심문하는 데 유용하지 않습니다. 면역 형광 염색 (IF)는 세포의 형태학, 성장 및 생존 성과 관련된 단백질시 타겟 요법의 효과를 조사하기위한 유용한 기술이다. 우리 연구소는 약물 치료 7 가능한 화학적 예방법 처리 및 바이오 마커를 서술의 희망 BE 세포 라인에 따라 임상 적으로 사용 가능한 약물의 효과를 평가하는 경우에 사용하는, 불후의 BE 세포 라인으로 이러한 방법을 적용하고있다. 마찬가지로, EAC에서 이러한 기술의 응용 프로그램이 있고 그리고 불후의 식도 세포 라인은 EAC 진행 8-10 일 수에 관한 중요한 연구 결과를 서술하고있다. 표적으로 한 치료로 치료 세포의 분석은 세포 구조와 단백질 지방화의 변화 특성을 허용, 가치가 있다면, 우리는 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 우리의 방법을 제시 IF C로되어 영원 세포의약물 치료를 haracterize.
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Protocol
1. 셀 라인의 유지 보수
- 불후의 성격 효소 (TERT) 단백질 11 반대로 인간 텔로 머라 아제의 안정적인 형질 전환에 의해 고급 이형성 (CP-B, CP-C, CP-D) 및 화생이 있으면서 (CP-A) 세포주합니다.
- 유지 세포 소 뇌하수체 추출물 (BPE), 표피 성장 인자 (EGF), 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산 (NEAA), 페니실린 - 스트렙토 마이신-네오 마이신 (PSN)로 보충 각질 미디어 라인 및 표준 BE 조직 배양 조건 (37 ° C에서 5 % CO 2, 98 % 습도).
2. 셀 도금하고있다
- 12 - 웰 플레이트 / 커버 슬립의 제조. 유리 페트리 접시와 오토 클레이브에 18mm 커버 슬립을 놓습니다. 전송 진공관에 부착 멸균 유리 피펫을 사용하여 12 - 웰 조직 배양 접시에 18mm 유리 커버 슬립을 멸균. 멸균 PBS 및 미디어 커버 슬립을 씻으십시오.
- 를 Trypsinize 및 불후의 BE 세포를 계산합니다. 세포 USI를 계산자동 셀 카운터 또는 혈구를 겨. 20,000-40,000 세포 / ml의 농도로 배양 배지에서 세포를 희석.
- 각이 잘 20,000-40,000 세포 / 웰의 총 세포 수에 대한 커버 슬립을 포함에 세포를 1 ㎖를 놓습니다.
- 부드럽게 세포가 커버 슬립에 부착하도록 우물의 바닥에 커버 슬립을 밀어 멸균 피펫 팁을 사용합니다.
BE 세포의 3. 약물 치료
- 원하는 농도로 따뜻한 (37 ℃) 매체 선택 약을 희석 반복 튜브를 반전 또는 와류 믹서를 사용하여 잘 섞는다. 경험적으로 결정 약물 농도. 커버 슬립에 대한 세포의 부착을 허용하는 BE 세포의 초기 시딩 다음 치료 24 시간을 시작합니다
- 비교 및 제어를 위해, 배양 배지에 희석 0.1 % 차량 (디메틸 설폭 사이드 [DMSO] 또는 대리인이 화합물을 용해하는 데 사용)과 함께 세포의 추가 커버 슬립을 취급합니다. 약을 확인하고 Ve에 대한 실험실 펜 라벨 판차 량은 샘플을 처리. 37 ° C, 5 % CO 2, 98 %의 습도로 설정 세포 배양 인큐베이터에 세포를 넣고 원하는 시점에 품어.
4. 면역 형광 염색법
- 정착
- 약물 치료의 원하는 배양 시간에 따라, 미디어를 대기음 실온 (RT, 25 ° C)에서 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 신속하게 커버 슬립을 씻는다.
- PBS를 대기음도 각각 4 % PFA [4 % PFA / PBS를 함유하는 PBS 1 ㎖를 추가하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 4 % PFA / PBS를 대기음 RT에서 PBS와 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻어. 원하는 경우 4 ° C에서 PBS/0.1의 % PFA에 일 주일간 매장의 coverslips.
- Permeabilization / 차단
항체가 세포 내 표적 액세스 할 수 있도록 고정 PFA 세포를 투과. 세포는 단백질 표면의 경우, 1X의 PBS/0.5의 %의 BSA 용액에 첨가 사포닌하지 않고 이후의 모든 단계를 수행합니다.- 실온에서 10 분 동안 PBS에 희석하는 50 mM NH 4 망할 CIA와 함께 배양하여 배경을 줄이고 5 분 동안 한 번 RT PBS로 세척.
- 0.1 % 사포닌 및 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS의 100-300 μL에 30 분 동안 BE 세포를 배양한다. , 필터 살균 10 %의 주식에서 사포닌을 희석 물을 준비하고 4 ℃에서 저장
- 인간의 상공 회의소의 준비
- 젖은 종이 타월 챔버의 바닥을 적층하여 사각형 생물 검정 접시를 준비하고 위에 파라 필름의 층을 배치합니다.
- 부드럽게 겸자 및 주사기 바늘을 이용하여 파라 필름 상으로 향하도록 커버 슬립, 세포를 옮긴다.
- 커버 슬립을 식별 할 수있는 실험실 펜으로 파라 필름을 표시합니다.
- 일차 항체 배양
- 0.5 % BSA 및 0.1 % 사포닌을 모두 함유하는 PBS에 일차 항체를 희석.
- 부드럽게 실험실 조직을 사용하여 차단 솔루션을 몰아 내고 차 항체 용액 100 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 하룻밤 BE 세포의 일차 항체를 품어
- 차 항체 보육
- 슬라이드는 RT에서 5 분마다 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌으로 3 배 씻으십시오.
- 차 항체는 일차 항체가 발생되었을 때의 종을 인식 PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 형광 태그로 복합 이차 항체를 희석.
- 각 coverslip에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어.
- 세척 및 Coverslips는 실장
- PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻으십시오. 세척 버퍼를 제거하고 커버 슬립에 PBS의 100 ~ 300 μl를 추가합니다.
참고 : 더블 안티 들어몸의 얼룩, 반복 토론에 나와있는 정보에 따라 원하는 추가 기본 및 보조 항체 4.4-4.5 단계를 반복합니다. - 집게를 사용하여 부드럽게 커버 슬립을 들어 올려 실험실 조직이나 종이 타월을 사용하여 PBS를 얼룩.
- 유리 현미경 슬라이드에 세포 아래로, 커버 슬립에 4를 포함하는 적절한 안티 페이드 설치 미디어 '-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI)의 15 μl를 추가하고, 커버 슬립을 반전.
- 슬라이드 폴더에 슬라이드를 삽입하고 하드 설정 반대로 페이드 매체는 치료 할 수 있도록 RT에서 하룻밤 직사 빛에서 배양, 제조 업체의 지침에 따라. 반대로 페이드 매체가 설정되면, 슬라이드는 현미경 가시화 될 때까지 C ° 4 °의 C 또는 -20 하나에 저장할 수 있습니다.
- PBS/0.5 %의 BSA/0.1 %의 사포닌에 coverslips는 3 배, 5 분마다 씻으십시오. 세척 버퍼를 제거하고 커버 슬립에 PBS의 100 ~ 300 μl를 추가합니다.
Coverslips는 5. 현미경 시각화
염색 된 세포는 공 초점 현미경 또는 하나를 통해 이미지화 할 수있는 경우 가능한 수직 microscop전자. 공 초점 현미경은 불연속 깊이에 고해상도 이미지를 제공하지만, 직립 현미경 빠르고 유용한 이미지를 생산할 수있다. 간결하게, 영상의 방법은 표준 현미경을 제시하여 셀 BE 스테인드. 일반적으로 이미지 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 또는 유사한 형광 물질 (즉, 녹색 형광 단백질)로, 텍사스 레드와 DAPI,이 형광 물질을 구별 할 수있는 필터를 사용하여 현미경이 필요합니다. 호환 형광을 결정하는 프로토콜을 시작하기 전에 현미경을 확인합니다.
- 표준 IF 현미경 영상
- -20 ° C ~ 4 ° C에서 저장 슬라이드 / 커버 슬립을 제거하고 실내 온도를 따뜻하게 할 수 있습니다. 현미경 및 수은 아크 램프의 전원을 켭니다.
- 커버 슬립이 현미경 무대에 목표를 향과 현미경 슬라이드를 놓습니다. 오일 침지 목적의 사용을 위해, 커버 슬립 상에 침지 기름 방울을 추가한다.
- DAPI 필터를 선택하고 셔터를 엽니 다. 이미지가 나타날 때까지 접안 렌즈를 통해보고하는 동안 목표를 초점을 맞 춥니 다. 모든 셀 DAPI로 염색되므로, 핵은 쉽게 관찰되어야한다.
- 각각의 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 수집한다.
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Representative Results
개시된 방법의 애플리케이션으로부터 얻어진 결과의 일례는도 1a-D에 도시되어있다. CP-D와 CP-C BE 세포와 커버 슬립은 Src에 가족 억제제 SKI-606, 또는 차량 (DMSO)의 1 μM로 24 시간 동안 처리하여 단백질, β 신호있는 adherens 접합 Wnt에 대해 위의 절차를 사용하여 염색 - 카테닌. 세포 핵의 라벨이 DAPI (파란색)로 표시하여 수행하는 동안 β-catenin의 시각화는, 녹색 형광체에 결합 된 항 토끼 IgG에있는 라벨에 의해 달성되었다. 커버 슬립은 하드 장착 설정하고 세포가 63X/1.4N 계획 - 고차 색지움 목표를 사용하여 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 몇 군데 사용하여 슬라이드를 현미경에 장착되었다. 선택 녹색 형광체는 488 nm에서 흥분과 505-525 nm에서 방출 필터를 사용하여 시각화 하였다. 마찬가지로, DAPI는 405 nm의 410-460 nm의 필터를 사용하여 수집 방출에 흥분했다. 티로신 키나제에서 Src의 활동 전의 특히 높은 등급의 이형성증 (12), BE 증가. 대장 및 전립선 암 세포 13 ~ 15의 관측과 일치에서에서 Src의 억제는 세포질 / 핵 (화살표가,, 1C를 1A 피규어, 및 1E) 세포막 (화살촉, 1B 피규어에서 β-catenin의의 relocalization 결과 1D 및 1 층). 이러한 기술을 사용하여, 우리와 다른 사람들은 이전에서 Src의 억제는 또한 종양 억제, P27의 kip1의 7,16 이러한 방법은 현재 실험실에서 사용되는의 발현 및 현지화를 변경하는 것으로 나타났습니다.
μ
그림 1.의 SRC 키나아제 억제제. CP-C (AD) 및 CP-D (E, F와 함께 다음과 같은 치료되어 영원 세포의 경우) 24 시간 (오른쪽 패널)의 경우, 차량 (DMSO, 왼쪽 패널) 또는 Src에 억제제의 1 μM, SKI-606로 치료했다. BE 균체 기재된 프로토콜에 따라 고정 및 염색 하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 염색하는 동안 β-catenin의 (녹색)는, 특정 항체와 알렉사 Fluro 488에 결합 된 이차 항체를 사용하여 시각화 하였다. SKI-606. C, D)와 함께 다음과 같은 치료 세포막 (화살촉)에 핵 (화살표)에서 β-catenin의 로컬 라이즈의 변화를 주와 B에있는 흰색 상자의 확대 된 이미지를 더 β-의 변화를 강조 카테닌 현지화. 이러한 이미지는 선택한 대상에 대한 최소한의 배경과 독특한 염색과 이상적인 염색을 나타냅니다. 호프, 12 μM (A, B, D, F), 0.5 μM (C, D).
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Discussion
우리는이 세포에 따라 타겟 요법의 생리적 효과를 해명으로 BE 세포의 IF를 적용하는 방법을 설명했다. 우리는 BE 세포 향한 이러한 절차의 사용을 설명하는 동안, 우리는이 방법 또한 다른 세포 유형 13,17,18의 다양한 적용 할 수있는 것으로 나타났습니다. 또한, 이러한 절차는 특정 대상에 대한 염색을 최적화하는 여러 가지 방법으로 변경할 수 있습니다.
우리는 적절한 IF에 따라 직접적인 영향을 하나의 매개 변수가 고정의 선택을 찾을 수 있습니다. 우리는 위의 절차에 고정 용 4 % PFA / PBS를 사용하는 방법을 설명했지만 대안 고정 제는 또한 적용 가능하다. 냉 메탄올 고정은 (-20 ° C) 20 분 동안 PBS로 세척 한 후 특정 단백질 / 항체 13에 적합합니다. 고정 용 냉 메탄올의 사용은 세포를 투과 할 필요성을 부정. 그러나, 정착의 선택 (4 % PFA / PBS 또는 냉 메탄올)는 경험적으로 결정해야합니다. 위에서 설명한 절차는 단일 단백질의 시각화를 설명; 그러나이 방법은 추가 대상 (13)의 식별에 쉽게 적응할 수있다. 최적의 두 가지 단백질, 특히 서로 다른 형광 물질에 결합 된 각각의 종을 인식하는 두 개의 서로 다른 종 (예를 들면, 토끼에서 제기 한 마우스에있는 한), 및 보조 항체에서 제기 차 항체는, 필요한 경우. DAPI와 결합 녹색 및 적색 형광체에 결합 이차 항체는 일반적으로 다수의 형광체로부터의 간섭을 회피하는 것 외에도 타겟 간의 우수한 콘트라스트를 제공한다. BE 세포에 IF의 두 가지 목표를 위해, 고정 다음과 같은 두 가지 기본 및 각각의 이차 항체의 연속 배양을 수행합니다. 세척 및 슬라이드의 설치를위한 단계는 동일하게 유지됩니다.
요약하면, 우리는 BE 셀 IF위한 간단하고 유용한 프로토콜을 제공한다. 이러한 절차의 적용은 INFORMAT을 얻을 수 있습니다약물 치료, 그 자궁외 유전자의 도입, 또는 세포에 대한 관심의 유전자의 RNAi의 하향 조절의 효과에 대한 이온.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 세인트 조셉 재단 (AJF, LJI)과 미국 폐 협회, RG-224607-N (LJI)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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